PiggyBac Transposon-vermittelte Geneditierung in humanen iPSCs: Ein Verfahren zur Integration von Genen von Interesse in humanen iPSCs mit dem PiggyBac Transposon-System

Spülen Sie die humane iPSC-Kultur mit kalzium- und magnesiumfreiem PBS, bevor Sie die Zellen 5 bis 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit einem Zelldissoziationsreagenz behandeln. Wenn sich die Zellen vom Kulturbehälter zu lösen beginnen, verwenden Sie eine P1000-Pipette, um die Zellen 3 bis 4 Mal vorsichtig manuell zu dissoziieren.

Übertragen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und bringen Sie das endgültige Volumen mit frischem PBS ohne Kalzium und Magnesium auf 10 Milliliter für die Zählung. Sammeln Sie 1 x 10⁶ Zellen durch Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern Puffer R aus dem Elektroporationskit.

Fügen Sie 4,5 Mikrogramm transponierbare Vektorplasmid-DNA und 0,5 Mikrogramm der PiggyBac-Transposase-Plasmid-DNA für die Transfektion hinzu. Transfizieren Sie mit dem Zellelektroporationssystem gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den angegebenen Parametern. Dann. säen Sie die Zellen in humanem iPS-Medium, das mit dem 10-mikromolaren ROCK-Inhibitor Y-27632 in einer 6-Millimeter-Matrix-beschichteten Schale ergänzt wurde.