Genomweite Analyse mittels ChIP zu Isoform-spezifische Gene-Targets zu identifizieren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, genomische Ziele von KDM fünf a Jared und RBB zwei Histon-Demethylase zu identifizieren. Dies wird durch die Präparation von vernetztem Chromatin erreicht, das beschallt wird, um in einem zweiten Schritt DNA-Fragmente der entsprechenden Größe herzustellen. RBB zwei gebundene DNA-Fragmente werden mit RBB zwei Antikörpern immunpräzipitiert.

Anschließend wird die gewonnene genomische DNA durch PCR zur Sequenzierung amplifiziert. Schließlich werden die von Illumina sequenzierten Short Reads eindeutig auf das menschliche Genom abgestimmt, und signifikante Peaks werden identifiziert und mit den nächstgelegenen Genen annotiert. Um rbbb zwei Zielgene zu identifizieren, werden Ergebnisse erhalten, die molekulare Funktionen zeigen, die mit Rrb B, zwei Zielgenen, assoziiert sind, basierend auf der genomweiten Identifizierung von Rbbb zwei angereicherten Regionen.

Hallo, ich bin Mike. Sie kommt aus dem Labor von Dr. Elizabeth Bencia in der Abteilung für Biochemie und Molekulargenetik an der University of Illinois in Chicago. Und ich komme aus dem Labor für biomedizinische Genomik, das von Dr. NGA an der BARCEL Biomedical Research Park University PO P fea geleitet wird.

Und ich bin Danielle Dal. Und ich bin William Richter. Wir sind beide auch im Benevolence Skill Lab.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für Chromatin, Immunpräzipitation und Sequenzierung. Dieses Verfahren nutzen wir in unserem Labor, um die Bindungsstelle seines Hautarztes zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Um diesen Vorgang zu beginnen, wachsen Sie etwa 10 bis zu den achten Zellen. Für jede Immunpräzipitation oder ip. Hier diffuses osteolytisches Lymphom.

U 9 37-Zellen werden verwendet und für die monozytäre Differenzierung mit TPA für 96 Stunden nach dem Zellwachstum in Formaldehydlösung direkt in das Medium bis zu einer Endkonzentration von 1 % induziert. Dann wird der Kolben kurz geschwenkt und 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen gelassen. Saugen Sie dann das Medium an und spülen Sie die Zellen mit 15 Millilitern eiskaltem PBS. Wiederholen Sie diese Wäsche einmal.

Geben Sie anschließend sechs Milliliter Lysepuffer in jeden der Kolben auf Eis. Dann die Kolben 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius schaukeln. Zum Schluss ernten Sie die Zellen mit einem Zellschaber und überführen sie in konische 15-Milliliter-Röhrchen.

Zu diesem Zeitpunkt können die Zellen bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Wenn die Zellen eingefroren waren, hachen Sie sie aus. Nach dem Auftauen die Zellen nach unten schleudern und den Snat.

Dann die Zellen in sechs Milliliter Lysepuffer zwei resuspendieren und die Röhrchen 10 Minuten lang vorsichtig bei Raumtemperatur wiegen. Wiederholen Sie die Zentrifugation und resuspendieren Sie die Zellen in 2,5 Millilitern Lysepuffer drei. Bereiten Sie anschließend die Suspension für die Beschallung vor, indem Sie sie in ein Becherglas mit eiskaltem Wasser legen, wobei die Mikrospitze eines Branson 450 Soniers auf eine Amplitude zwischen 50 und 60 % eingestellt ist.

Beschallen Sie die Lösung für einen 32. konstanten Burst und kühlen Sie sie auf Eis ab. Wiederholen Sie diese Impulse eine Minute lang 10 bis 15 Mal, pipettieren Sie dann den Inhalt des Röhrchens auf und ab und übertragen Sie ihn in ein neues Röhrchen. Die Lösung weiter pulsieren und abkühlen lassen.

Fügen Sie weitere fünf Mal nach der Beschallung 10 % Triton X 100 zu einem Zehntel des Lösungsvolumens hinzu. Übertragen Sie dann die Lysate in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und schleudern Sie die Rückstände in einer Mikrozentrifuge aus, bevor sie Chromatin, Immunpräzipitation oder Chip erhalten. Bewahren Sie 50 Mikroliter des Zelllysats als Eingangsprobe auf.

Dann kombinierte er das geklärte Zelllysat mit Dyna-Kügelchen, die an einen Antikörper gebunden waren, der zuvor hergestellt worden war, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Rocken Sie das Gemisch zusätzlich zu der 50-Mikroliter-Eingangsprobe bei vier Grad Celsius über Nacht. Waschen Sie die Kügelchen mit einem Milliliter Waschpuffer

Verwenden Sie dann einen Magnetständer, um die Kügelchen zu sammeln und den Überstand zu entfernen. Wiederholen Sie diese Wäsche sechs- bis achtmal. Führen Sie eine abschließende Wäsche mit einem Milliliter TE plus 50 Millimolar Natriumchlorid durch.

Schleudern Sie die Kügelchen nach dem Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge und saugen Sie den restlichen TE-Puffer an. Geben Sie dann 100 Mikroliter elu-Puffer zu den Proben. Unmittelbar danach.

Inkubieren Sie die Proben bei 65 Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten. Kratzen Sie die Röhrchen alle zwei Minuten gegen ein 1,5-Milliliter-Röhrchengitter, um die Kügelchen in der Schwebe zu halten. Sammeln Sie die Kügelchen mit Hilfe der Zentrifugation und des Magnetständers und übertragen Sie das SNAT auf ein PCR-Röhrchen.

Rufen Sie dann die zuvor gespeicherte Eingabeprobe ab und fügen Sie drei Volumina des Elutionspuffers hinzu. Legen Sie schließlich das IP und die Eingangsproben über Nacht bei 65 Grad Celsius in den Thermocycler. Um die Quervernetzungen am nächsten Tag umzukehren, fügen Sie den Proben ein Volumen TE-Puffer hinzu.

Geben Sie dann RNAs A bis zu einer Endkonzentration von 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter hinzu. Inkubieren Sie die Proben im Thermocycler für ein bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation wird Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter zugegeben.

Anschließend werden die Proben im Thermocycler zwei Stunden lang bei 55 Grad Celsius inkubiert. Als nächstes extrahieren Sie die Proben einmal mit einem Volumen Phenol. Die Proben werden ein zweites Mal mit einem Volumen Phenylchloroform-Isoamylalkohol extrahiert.

Zum Schluss werden die Proben noch einmal mit einem Volumen Chloroform-Isoamylalkohol extrahiert. Geben Sie dann 30 Mikrogramm Glykogen zu jeder Probe. Geben Sie außerdem Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 0,2 molar und zwei Volumen Ethanol zu den Proben.

Inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei minus 80 Grad Celsius. Nach der Inkubation die Proben schleudern und den Snat. Waschen Sie die Pellets mit 500 Mikrolitern 75%igem Ethanol, trocknen Sie die Pellets und resuspendieren Sie sie in 40 Mikrolitern Wasser.

Um die Größe der durch das SONICATION-Verfahren hergestellten DNA-Fragmente zu überprüfen, laden Sie fünf Mikrogramm der gereinigten Eingangsprobe in ein 1,8%iges Agrogel und lassen Sie das Gel laufen. Das Beschallungsverfahren sollte Fragmente im Bereich von 150 bis 350 Basenpaaren erzeugen. Wenn die Fragmente jedoch nicht in diesen Bereich fallen, sollte das Ultraschallverfahren angepasst werden, indem die Anzahl der Bursts und die Amplitude vor der Amplifikation der genomischen DNA variiert werden.

Überprüfen Sie die Größe, Konzentration und Anreicherung der Proben, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Um mit der Amplifikation der genomischen DNA zu beginnen, entnehmen Sie 34 Mikroliter der IP-Probe und 200 Nanogramm der Eingabeprobe. Durchführung und Reparatur, Addition und Ligation von Adaptern zu DNA-Fragmenten unter Verwendung eines Illumina genomischen DNA-Probenvorbereitungskits, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.

Reinigen Sie die DNA mit einem Mini-LUT-PCR-Aufreinigungskit und eluieren Sie sie dann in einem EB-Puffer, der auf 50 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Verwenden Sie 23 Mikroliter bzw. 46 Mikroliter für die IP- bzw. Eingabe-DNA-Proben. Führen Sie die PCR-Reaktion mit 23 Mikrolitern DNA mit Adaptern, 25 Mikrolitern Fusion, DNA-Polymerase aus dem Kit durch.

Ein Mikroliter 20 Mikromolare Sole PCR ein und ein Mikroliter 20 Mikromolare. PCR zwei führt also die PCR-Reaktion durch, wie im schriftlichen Protokoll nach der PCR-Amplifikation beschrieben. Aufreinigen Sie die DNA mit dem Qiagen Mini-Loop-PCR-Aufreinigungskit.

15 Mikroliter Puffer EB auf 50 Grad Celsius vorwärmen und die DNA verdünnen, 0,5 Mikroliter der Probe eins bis vier verdünnen und eine NanoDrop-Messung durchführen, um die amplifizierten Produkte zu reinigen. Bereiten Sie ein 1,8%iges AGROS-Gel von 50 Millilitern mit Wasser in HPLC-Qualität vor, fügen Sie TAE und Bromid hinzu, nachdem das Agros geschmolzen ist. Gießen Sie dann das Gel ein, laden Sie das Gel.

Nachdem Sie den Eingangs- und IP-Proben vier Mikroliter Ladepuffer hinzugefügt haben, lassen Sie das Gel 45 Minuten lang bei 120 Volt laufen. Analysieren Sie das Gel nach dem Laufen. Dabei soll sich zeigen, dass Fragmente im Bereich zwischen 150 und 350 Basenpaaren entstehen.

Sie stellen genomische DNA-Fragmente mit einer Länge von 50 bis 250 Basenpaaren dar. Und ein Adapter schneidet den Bereich des Gels, der das Material im Bereich von 150 bis 350 Basenpaaren enthält, mit einem Skalpell heraus. Achten Sie darauf, dass das Adapter-Adapterband, das mit etwa 120 Basenpaaren läuft, nicht herausgeschnitten wird.

Gewinnen Sie die DNA mit einem Kajak-Schnell-Gel-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers zurück. Trocknen Sie die Probe auf genau 11 Mikroliter in einer Geschwindigkeit zurück ohne Hitze. Entnehmen Sie einen Mikroliter der Probe und messen Sie die DNA-Konzentration mit einem NanoDrop-Spektralphotometer.

Identifizieren Sie schließlich angereicherte Genprodukte mit dem Illumina-Genomanalysator und analysieren Sie die Bindungsstellen und Zielgene, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Die genomischen Koordinaten der identifizierten angereicherten RB-Bindungsprotein-Zwei- oder RBP-Zwei-Bindungsregionen werden in einem chromosomenweisen Format dargestellt. Die Belegung von Ensemble-Genen in den Chromosomen kann als schwarze VARs dargestellt werden.

Hier sind die Belegungen von Chromosom 10 rbp und zwei Bindungsregionen als vertikale Linien dargestellt. Das mittlere Feld zeigt alle rbp zwei Isoform-Bindungsregionen auf Chromosom 10, und das untere Feld zeigt rbp zwei große Isoform-Bindungsregionen. Diese Informationen geben einen Überblick über die Überlappung und spezifische Belegung von RBP zwei Isoformen auf Chromosom 10.

Hier wird eine Heatmap mit Falschentdeckungsrate oder FDR-korrigierter, signifikant angereicherter Genontologie oder zwei molekularen Funktionskategorien unter den Genen gezeigt, die an rbp gebunden sind. Zwei Farben in Richtung Rot weisen auf eine hohe statistische Signifikanz hin. Gelb bedeutet eine geringe statistische Signifikanz, und Grau zeigt keine statistische Signifikanz an.

Die Anreicherungsanalyse zeigt die überlappenden und isoformspezifischen molekularen Funktionen von R BP, zwei Zielgenen. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie während dieses Verfahrens Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren identifizieren können. Es ist wichtig, DNA-Fragmente mit dem richtigen Größenbereich und der richtigen Ausbeute herzustellen.

Dies kann erreicht werden, indem wir unsere Richtlinien während des SONICATION-Schritts befolgen. Das war's also. Viel Glück bei Ihren Experimenten und danke fürs Zuschauen.