Name: Genomweite Analyse mittels ChIP zu Isoform-spezifische Gene-Targets zu identifizieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Erfahren Sie, wie ChIP-Seq genomweite Ziele der Histondemethylase KDM5A/RBP2 identifiziert. Diese Methode nutzt Sonication und Immunpräzipitation zur Analyse epigenetischer Regulation.

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Diese Arbeit wurde von 115.347-RSG-08-271 bis 01-GMC von ACS, und durch CA138631 Zuschuss von NIH unterstützt.

Das Protokoll wurde ursprünglich von B. Ren, 2001 angepasst. Es stellt eine leichte Modifikation des Protokolls durch Odom et al. 5, die Sie hier finden <a href="http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads">http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads</a> 1. Pre-Block und Bindung des Antikörpers an magnetische Kügelchen (Sollte der Nacht vor dem nächsten Schritt ausgeführt werden) <ol><li> Wash 100 L Dynabeads Protein G (pro IP, für mehrere IPs kombinieren) in 1 ml frischem BSA / PBS-Lösung (50 mg BSA in 10 mL PBS-Diese Lösung wird für eine Woche reicht). </li><li> Sammeln Sie die Kugeln mit einem Magnetfuß, und wiederholen Sie den Waschvorgang zwei weitere Male. </li><li> Anschließend fügen Sie 10 ug von Antikörpern gegen 250 ul der Perlen Gülle in PBS / BSA-Lösung (pro IP) beimpft und über Nacht auf einer rotierenden Plattform bei 4 ° C. </li><li> Nach der Fertigstellung, waschen Sie die Beads dreimal in 1 ml der PBS / BSA-Lösung und dann in 10 ul PBS / BSA-Lösung (pro IP) resuspendieren. </li></ol> 2. Zell-Vernetzung <ol><li> Zu Beginn dieses Verfahrens, wachsen etwa 10 8 Zellen pro Immunpräzipitation oder IP. Hier sind diffuse histiozytisches Lymphom U937-Zellen verwendet und induzierte für monozytären Differenzierung mit TPA für 96 Stunden. </li><li> Nach Zellwachstum, fügen Formaldehyd-Lösung direkt auf die Medien bis zu einer Endkonzentration von 1%. Dann können wirbeln die Flaschen kurz und sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten sitzen. Dann saugen die Medien und waschen Sie die Zellen mit 15 ml eiskaltem PBS. Wiederholen Sie diesen waschen einmal. </li><li> Als Nächstes fügen Sie 6 ml Lysispuffer 1 (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% Glycerin, 0,5% NP-40, 0,25% Triton X-100, mit Protease-Inhibitoren) in jede der Kolben auf Eis. Dann rocken die Kolben für 20 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Schließlich Ernte der Zellen mit einem Zellschaber und übertragen diese auf 15 ml konische Röhrchen. An dieser Stelle können die Zellen bei -80 ° C gelagert werden </li></ol> 3. Zell-Beschallung <ol><li> Wenn die Zellen wurden eingefroren, tauen sie aus. Einmal aufgetaut, drehen Sie das Zellen nach unten bei 3.000 rpm für 10 Minuten bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. Dann die Zellen in 6 ml Lysepuffer 2 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, mit Protease-Inhibitoren). Rock the Röhrchen vorsichtig bei Raumtemperatur für 10 Minuten. </li><li> Wiederholen Sie die Zentrifugation und Resuspendieren der Zellen in 2,5 ml Lysispuffer 3 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1% Natriumdeoxycholat, 0,5% N-Lauroylsarcosin, mit Protease-Inhibitoren) . </li><li> Als nächstes bereiten die Aussetzung für Beschallung, indem Sie es in ein Becherglas mit Eiswasser mit der Mikrospitze eines Branson 450 Sonifier auf einen Wert zwischen 50 und 60% Amplitude. </li><li> Mit Ultraschall die Lösung für eine 30 Sekunden konstant platzen und kühlen auf Eis für 1 Minute. Wiederholen Sie diese Impulse von 10 bis 15 mal. Dann Pipette der Inhalt des Röhrchens auf und ab und übertragen Sie sie auf eine neue Röhre. Weiter zu Puls und die Lösung eine zusätzliche 5-mal. </li><li> Nach Beschallung, mit 10% Triton X-100 bis 1 / 10 der Lösung Volumen. Übertragen Sie die Lysate bis 1,5 mL Zentrifugenröhrchen, und drehen Sie die Trümmer in einer Mikrozentrifuge. Übertragen Sie anschließend das Zelllysat in ein neues Röhrchen. </li></ol> 4. Chromatin Immunopräzipitation <ol><li> Vor Chromatinimmunpräzipitation oder Chip, sparen Sie 50 ul der Zelllysate wie das Eingangs-Sample. Dann verbinden die gelöscht Zelllysat mit Dynabeads, um Antikörper, die zuvor wie oben beschrieben hergestellt pre-gebunden. Rock the Mischung, zusätzlich zu den 50 ul Eingang Probe bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Waschen Sie die Kugeln mit 1 mL der Waschpuffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 0,5 M LiCl, 1mM EDTA, 0,7% Natriumdeoxycholat, 1% NP-40). Verwenden Sie dann ein magnetisches stehen, um die Perlen zu sammeln und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen waschen 6 bis 8 mal. </li><li> Führen Sie eine letzte Waschung mit 1 mL TE-plus-50 mM NaCl (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). Drehen Sie die Perlen in einer Mikrozentrifuge bei 3.000 rpm für 2 Minuten bei 4 ° C. Nach der Zentrifugation absaugen restliche TE-Puffer. </li><li> Dann fügen Sie 100 ul Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS) zu den Proben. Unmittelbar nach, inkubieren Sie die Proben bei 65 ° C für 10 bis 15 Minuten. Scratch die Rohre gegen eine 1,5-ml-Tube-Rack alle 2 Minuten, um die Perlen in der Schwebe zu halten. </li><li> Sammeln Sie die Kugeln mittels Zentrifugation und die magnetische stehen, und überweisen Sie den Überstand in ein PCR-Röhrchen. Dann rufen Sie die zuvor gespeicherten Eingangs-Sample, und fügen Sie 3 Bände der Elutionspuffer. </li><li> Schließlich legen Sie die IP-und Input-Proben in den Thermocycler über Nacht bei 65 ° C bisUmkehr der Querverbindungen. </li><li> Am folgenden Tag, fügen Sie 1 Volumen TE-Puffer zu den Proben. Dann fügen RNase A bis zu einer Endkonzentration von 0,2 ug / ul. Inkubieren Sie die Proben in den Thermocycler für 1 bis 2 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Nach der Inkubation, fügen Proteinase K in einer Endkonzentration von 0,2 ug / ul. Dann inkubieren Proben im Thermocycler bei 55 ° C für 2 Stunden. </li><li> Anschließend entpacken Sie die Proben einmal mit einem Volumen Phenol. Entpacken Sie die Proben ein zweites Mal mit einem Volumen Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol. Schließlich, extrahieren Sie die Proben noch einmal mit einem Volumen Chloroform: Isoamylalkohol. </li><li> Dann fügen Sie 30 g Glykogen zu jeder Probe. Fügen Sie außerdem NaCl auf eine Endkonzentration von 0,2 Molar und zwei Volumina Ethanol zu den Proben. Inkubieren Sie für 30 Minuten bei -80 ° C. Nach der Inkubation, Spin der Proben und Dekantieren des Überstandes. Waschen Sie die Pellets mit 500 ul 75% Ethanol. Dann trocknen die Pellets und resuspendieren Sie in 40 ul Wasser. </li><li> So überprüfen Sie die Größen der DNA-Fragmente durch die Beschallung Verfahren hergestellt, Last 5 ug des gereinigten Eingang Probe in einem 1,8% Agarosegel und führen Sie das Gel. Die Beschallung Verfahren sollte Fragmente im Bereich von 150-350 Basenpaaren zu produzieren. Allerdings, wenn die Fragmente nicht in diesem Bereich fallen, sollte die Beschallung Verfahren durch Variation der Anzahl von Bursts und die Amplitude eingestellt werden. </li><li> Um Robustheit und Spezifität der ChIP überprüfen, die Anreicherung unter Kontrolle bindenden Regionen, indem Gen-spezifischen PCR mit 1 ul der IP-Proben und eine Verdünnungsreihe des Eingangs Probe. Zwei bis drei "gebunden" Regionen und ein ungebundenes Steuerelement Region müssen gewählt, um die Qualität von IP-und Input-Proben zu testen. </li></ol> 5. Amplifikation von genomischer DNA <ol><li> Beginnend mit 34 ul der IP Probe oder 200 ng des Eingangs Probe durchführen Ende zu reparieren, 'A' tail hinaus und Ligation von Adaptern, um DNA-Fragmente unter Verwendung von genomischer DNA Sample Prep Kit <a href="http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn">http://www.illumina.com/systems/ genome_analyzer.ilmn</a> (Illumina, Inc., San Diego, CA). </li><li> Purify die DNA mit einem MinElute PCR Purification Kit und dann eluieren es in Puffer EB (10 mM Tris Cl, pH 8,5), die wurde auf 50 ° C vorgewärmten Zum Beispiel, Beanspruchungsklasse 23 ul und 46 ul für die endgültige Elution von IP-und Input-DNA Proben. </li><li> Nehmen Sie die PCR-Reaktion unter Verwendung von 23 ul der DNA mit Adaptern und 25 ul Phusion DNA-Polymerase aus dem Kit, 1 ul 20 uM Sol_PCR_1 und 1 ul 20 uM Sol_PCR_2. Führen Sie die PCR-Reaktion wie folgt: 1) 30 Sekunden bei 98 ° C; 2) 10 Sekunden bei 98 ° C; 3) 30 Sekunden bei 65 ° C; 4) 30 Sekunden bei 72 ° C; Wiederholung der Schritte Schritt 2-4 18 mal und dann 5 Minuten bei 72 ° C, schließlich halten bei 4 ° C. </li><li> Nach PCR-Amplifikation, reinigen die DNA mit dem QIAGEN MinElute PCR Purification Kit. Pre-warme 15 ul Puffer EB auf 50 ° C und eluieren DNA. Verdünnen 0,5 ul der Probe 1:4 und führen Sie eine Nanodrop Lesen. </li></ol> 6. Gel Reinigung der amplifizierten Produkte <ol><li> Zur Reinigung der amplifizierten Produkte, bereiten ein 1,8% Agarosegel von 50 mL mittels HPLC-grade Wasser. Add TAE und Ethidiumbromid nach dem Agarose geschmolzen ist. Dann gießen Sie das Gel. Legen Sie das Gel nach Zugabe von 4 ul Ladepuffer auf die Eingangs-und IP-Proben. Führen Sie dann das Gel bei 120 Volt für 45 Minuten. </li><li> Analysieren Sie das Gel nach der Ausführung. Das Gel sollte, dass Fragmente im Bereich zwischen 150 und 350 Basenpaaren hergestellt offenbaren. Sie stellen genomische DNA-Fragmente zwischen 50 und 250 Basenpaare lang und einen Adapter. </li><li> Excise der Region Gel mit dem Material in dem 150 350-Basenpaar-Bereich mit einem Skalpell. Achten Sie darauf, um zu vermeiden Auslösen der Adapter-Adapter Band läuft, die bei etwa 120 Basenpaare. Stellen Sie die DNA mit Hilfe eines QIAquick Gel Extraction Kit Anweisungen des Herstellers. Insbesondere verwenden Sie eine Spalte aus dem QIAquick Gel Extraction Kit für ein Gel Stück 400 mg oder weniger. Zu Beginn der Extraktion, fügen Sie 3 Bände von QG Puffer 1 Volumen Gel. Add 1 Volumen Isopropanol und laden Sie die Mischung auf die Säule. Verwenden Sie 0,5 ml QG auf die Säule zu waschen, gefolgt von Standard-Verfahren in Kit beschrieben. Verwenden Sie H 2 O vorgewärmt auf 50 ° C, um die DNA zu eluieren. Inkubieren Sie die Spalte mit 30 ul H 2 O für 5 Minuten bei 37 ° C vor dem Spinnen es nach unten. </li><li> Trocknen Sie die Probe auf genau 11 ul in einem Speedvac ohne Wärme. Nehmen Sie 1 ul der Probe und messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Nanodrop Spektralphotometer. </li><li> Schließlich identifizieren bereichert Genprodukte mit dem Illumina Genome AnalyzerIIe, wie dies unter <a href="http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf">http://genesdev.cshlp.org/content/suppl</a>/ 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf 6. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Das übergeordnete Ziel der folgenden Experiments ist es, genomische Ziele KDM5A/JARID1A/RBP2 Histon-Demethylase zu identifizieren. (P1) Dies ist bei der Vorbereitung der vernetzten Chromatin, beschallt, um DNA-Fragmente geeigneter Größe zu produzieren erreicht ist. (P2) In einem zweiten Schritt werden RBP2 gebundenen DNA-Fragmente mit RBP2 Antikörper immunpräzipitiert. (P3) Als nächstes werden die wiederhergestellten DNA-Fragmente an den Enden repariert und Adapter sind an den Enden der genomischen DNA ligiert, um Bibliotheken von genomischer DNA für die Analyse vorzubereiten auf die Strömung Zellen in der Illumina Cluster Station. Die DNA-Bibliotheken sind durch PCR mit geringen Anzahl von Zyklen amplifiziert. (P4) Schließlich liest Illumina sequenziert kurz sind eindeutig auf das menschliche Genom ausgerichtet ist, sind signifikante Peaks identifiziert und mit Anmerkungen versehen, um die nächste Gene, um RBP2 bereichert Regionen zu identifizieren. (P5) Ergebnisse erzielt, die zeigen, molekularen Funktionen mit RBP2 Zielgene auf genomweite Identifizierung RBP2 bereichert Regionen basieren verbunden. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Überprüfung der Ergebnisse von Chromatin Beschallung Um die Größe der DNA-Fragmente durch die Beschallung Verfahren hergestellt zu überprüfen, wurde 5 ug (10.1) des gereinigten Eingang Probe auf 1,8% Agarosegel aufgetragen. Wie erwartet, produziert unser Beschallung Verfahren Fragmente im Bereich von 150-350 bp. Allerdings, wenn die Fragmente nicht in diesem Bereich fallen, sollte die Beschallung Verfahren entsprechend angepasst werden, indem die Anzahl der Bursts und die Amplitude. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Gel Reinigung der amplifizierten Produkte. Die PCR-Produkte werden auf einem Gel laufen, um den Adapter zu entfernen und wählen Sie eine Größe-Reihe von Vorlagen für die Cluster-Generation-Plattform. Dieses Gel zeigt, dass Fragmente im Bereich zwischen 150 und 350 Basenpaaren hergestellt wurden. Sie stellen genomische DNA-Fragmente zwischen 50 und 250 Basenpaare lang und einen Adapter. Wir Verbrauchsteuern der ausgewählten Region des Gels mit einem Skalpell. Es sollte darauf geachtet, um den Adapter-Adapter Band, die bei etwa 120 Basenpaare führt zu vermeiden. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Isoform-spezifischen Antikörper ermöglicht die Unterscheidung zwischen großen und kleinen Isoformen RBP2. RBP2 Proteinstruktur in Domain-Ansicht präsentiert. RBP2 enthält mehrere Domänen: die katalytische Histon-Demethylierung JmjC Domain und die damit verbundenen JmjN Domäne, einer trockenen Domain-fähig Sequenz-spezifische DNA-Bindung, eine C5HC2 Zinkfinger, die möglicherweise mit DNA oder anderen Proteinen, und mehrere PHD-Domänen interagieren können. Die beiden anti-RBP2 Antikörper, die zwischen RBP2 Isoformen unterscheiden können gegen die RBP2 Fragmente, die durch dicke Linien angedeutet abgeleitet. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5a.jpg" alt="Abbildung 5a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5a"> Abbildung 5a. Übersicht der RBP2 bindenden Regionen zusammen mit Chromosom und Ensembl Gene. Genomic Koordinaten identifiziert bereichert RBP2 (alle Isoformen und große Isoform) bindenden Regionen vorgestellt Chromosom weise. Occupances von Ensembl Gene (Version 54; HG18) in den Chromosomen (Chromosom 10 in diesem Bild) sind als schwarze Balken (oben) präsentiert. Jeder RBP2 bindende Region ist als eine vertikale Linie, wo das mittlere Fenster zeigt alle RBP2 Isoformen bindenden Regionen auf Chromosom 10 vertreten, und auf der Unterseite zeigt RBP2 große Isoform bindenden Regionen. Die mittleren und unteren Platten geben Überblick über die Überschneidungen und spezifische Belegung RBP2 Isoformen auf Chromosom 10. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5b.jpg" alt="Abbildung 5b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5b"> Abbildung 5b. Functional Bereicherung Analyse RBP2 Zielgene. Heatmap zeigt FDR korrigiert signifikant (p-Wert ≤ 0,05) angereichert GO Molecular Function Kategorien unter den Genen gebunden (am nächsten Gene an die RBP2 bindende Region) durch RBP2 (alle Großen und Ganzen Isoformen). Farben nach Rot zeigen eine hohe statistische Signifikanz zeigt gelb geringe statistische Signifikanz und Grau gibt keine statistische Signifikanz. Enrichment-Analyse zeigt die Überlappung und Isoform spezifischen molekularen Funktionen der RBP2 Zielgene.

<ol><li>Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+malignancies+caused+by+dysregulation+of+a+chromatin-binding+PHD+finger%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic malignancies caused by dysregulation of a chromatin-binding PHD finger.</a> Nature. 459 (7248), (2009).</li>
<li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+pRB+to+the+PHD+protein+RBP2+promotes+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of pRB to the PHD protein RBP2 promotes cellular differentiation.</a> Mol Cell. 18 (6), 623-623 (2005).</li>
<li>Lopez-Bigas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+the+H3K4+histone+demethylase+RBP2+reveals+a+transcriptional+program+controlling+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation.</a> Mol Cell. 31 (4), 520-520 (2008).</li>
<li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K4+demethylases+are+essential+in+development+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone H3K4 demethylases are essential in development and differentiation.</a> Biochem Cell Biol. 85 (4), 435-435 (2007).</li>
<li>Odom, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303 (5662), 1378-1378 (2004).</li>
<li>Guenther, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+chromatin+at+genes+encoding+stem+cell+regulators+in+human+mixed-lineage+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Aberrant chromatin at genes encoding stem cell regulators in human mixed-lineage leukemia.</a> Genes Dev. 22 (24), 3403-3403 (2008).</li>
</ol>

Funktionelle Unterschiede zwischen RBP2 Isoformen sind nicht bestimmt worden. Wir haben ein umfassendes Konzept zur genomischen Regionen von RBP2 Isoformen gebunden Ermittlung und Festlegung der funktionalen Kategorien, die diese Regionen darstellen. Dies wurde durch ChIP-Seq Analyse durch bioinformatische Analyse der erhaltenen Sequenz liest, erreicht. RBP2 modifiziert methylierte Lysinreste auf Histone. Wir fanden, dass RBP2 große Isoform die Anerkennung Modul enthält für methylierte Histon-Lysin und RBP2 kleinen Isoform fehlt diesem Modul binden an verschiedene Regionen im menschlichen Genom (Abbildung 5A). Wichtig ist, dass Isoform-spezifischen Regionen und überlappenden Regionen von Genen gehören mit unterschiedlichen molekularen Funktionen (Abbildung 5B). Zum Beispiel, &quot;Chromatin Bindung&quot; und &quot;Transkriptionsfaktorbindungsstellen&quot; Funktionen können auf Gen-Targets von RBP2 kleinen Isoform zugeschrieben werden, aber nicht von RBP2 großen Isoform (Abbildung 5B). Durch den Vergleich der tatsächlichen Gen-Sets generiert für alle Isoformen und RBP2 großen Isoform (Daten nicht gezeigt), können wir auch festlegen, ob die große Isoform ist spezifisch an bestimmte Gene rekrutiert.

Oligonukleotidsequenzen 2006 Illumina, Inc. Alle Rechte vorbehalten. <ul><li> Sol_PCR_1 Sequenz 5&#39;-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T-3 &#39; </li><li> Sol_PCR_2 Sequenz 5&#39;-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T-3 &#39; </li></ul>

genomweite analyse mittels chip zu isoform-spezifische gene-targets zu identifizieren

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Rekrutierung von Transkriptions-und epigenetische Faktoren, um ihre Ziele ist ein wichtiger Schritt in ihrer Regulierung. Prominent in Rekrutierung featured sind die Protein-Domänen, die auf bestimmte Histon-Modifikationen zu binden. Ein solcher Bereich ist die Anlage homeodomain (PHD), in mehreren Chromatin-bindenden Proteinen gefunden. Die epigenetische Faktor RBP2 mehrere PHD-Domänen, jedoch haben sie unterschiedliche Funktionen (Abbildung 4). Insbesondere bindet die C-terminale Domäne PHD, in einem RBP2 onkogenen Fusion in menschlichen Leukämien gefunden, um trimethyliertes Lysin 4 in Histon H3 (H3K4me3) 1. Das Transkript entsprechend der RBP2 Isoform mit dem C-terminalen PHD sammelt während der Differenzierung von promonocytic, Lymphom-derived, U937-Zellen in Monozyten 2. In Übereinstimmung mit beiden Datensätzen zeigte genomweite Analyse, dass in differenzierten U937-Zellen, die RBP2 Protein genomischen Regionen in hohem Grade für H3K4me3 3 angereichert wird lokalisiert. Lokalisierung von RBP2 seine Ziele korreliert mit einer Abnahme der H3K4me3 aufgrund RBP2 Histon-Demethylase-Aktivität und eine Abnahme der transkriptionellen Aktivität. Im Gegensatz dazu sind zwei weitere PHDs von RBP2 nicht H3K4me3 binden. Bemerkenswert ist, dass die C-terminale Domäne von PHD RBP2 in den kleineren RBP2 Isoform 4 fehlen. Es ist denkbar, dass die kleinen Isoform RBP2, die Interaktion fehlt mit H3K4me3, von der größeren Isoform in der genomischen Lage unterscheidet. Der Unterschied in der genomischen Lage des RBP2 Isoformen für die beobachtete Vielfalt in RBP2 Funktion Konto. Insbesondere ist RBP2 eine kritische Spieler in der zellulären Differenzierung durch die Retinoblastomprotein (pRB) vermittelt. In Übereinstimmung mit diesen Daten, frühere genomweite Analyse, ohne Unterscheidung zwischen Isoformen, wurden zwei unterschiedliche Gruppen von RBP2 Zielgene: 1) Gene durch RBP2 in einer Weise, die unabhängig von Differenzierung gebunden ist; 2) Gene durch RBP2 in einer gebundenen Differenzierung- abhängigen Weise. Zur Identifizierung Unterschiede in der Lokalisation zwischen den Isoformen führten wir genomweite Standortanalyse durch ChIP-Seq. Mit Antikörpern, die sowohl RBP2 Isoformen wir alle RBP2 Ziele gefunden haben zu erkennen. Zusätzlich haben wir Antikörper, binden nur groß und nicht klein RBP2 Isoform (Abbildung 4). Nach der Identifizierung der große Isoform Ziele kann man dann davon subtrahieren alle RBP2 Ziele, um die Ziele von kleinen Isoform offenbaren. Diese Daten zeigen, den Beitrag der Chromatin-Interaktion Domain in Protein Einstellung in ihren Bindungsstellen im Genom.

Hier präsentieren wir eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) Verfahren zur genomweiten Ort Analyse von Protein-Isoformen, die in einer Histon-bindende Domäne unterscheiden. Wir wenden es ChIP-Seq-Analyse, um die Ziele des KDM5A/JARID1A/RBP2 Histon-Demethylase zu identifizieren.

Genomweite Analyse mittels ChIP zu Isoform-spezifische Gene-Targets zu identifizieren

Die Rekrutierung von transkriptionellen und epigenetischen Faktoren an ihre Zielsequenzen ist ein entscheidender Schritt in ihrer Regulation. Eine prominente Rolle bei der Rekrutierung spielen die ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, genomische Zielstrukturen von KDM five a Jared one, einer RBB two-Histon-Demethylase, zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem in einem zweiten Schritt vernetzte Chromatinpräparationen durch Beschallung in DNA-Fragmente geeigneter Größe zerschnitten werden. An RBB two gebundene DNA-Fragmente werden anschließend mittels RBB two-Antikörpern immunpräzipitiert.Anschließend wird die gewonnene genomische DNA mittels PCR für die Sequenzierung amplifiziert. Schließlich werden die mittels Illumina sequenzierten kurzen Reads eindeutig gegen das humane Genom ausgerichtet, und signifikante Peaks werden identifiziert und den nächstgelegenen Genen zugeordnet. Um Rbbb zwei Zielgene zu identifizieren, werden Ergebnisse herangezogen, die molekulare Funktionen im Zusammenhang mit Rrb B zwei Zielgenen basierend auf der genomweiten Identifizierung von Rbbb zwei angereicherten Regionen zeigen.Hallo, ich bin Mike. Sie aus dem Labor von Dr. Elizabeth Bencia am Department für Biochemie und Molekulargenetik an der Universität von Illinois in Chicago. Und ich bin ala aus dem Labor für Biomedizinische Genomik unter der Leitung von Dr. NGA am BARCEL Biomedizinischen Forschungspark der Universität PO P fea.Und ich bin Danielle Dal. Und ich bin William Richter. Beide von uns befinden wir uns ebenfalls im Benevolence Skill Lab.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für die Chromatin-Immunpräzipitation und Sequenzierung. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Bindungsstelle seines Dermatologen zu untersuchen. Beginnen wir also.Um dieses Verfahren zu beginnen, züchten Sie etwa 10 hoch 8 Zellen für jede Immunpräzipitation oder IP. Hier: diffuses osteolytisches Lymphom.U 9 37 Zellen werden verwendet und zur monozytären Differenzierung mit TPA für 96 Stunden induziert, gefolgt von Zellwachstum in Formaldehydlösung, die direkt dem Medium zugesetzt wird, um eine Endkonzentration von 1 % zu erreichen. Dann wird der Kolben kurz geschwenkt und 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wird das Medium abgesaugt und die Zellen mit 15 Milliliter eiskalter PBS gespült. Dieser Waschschritt wird einmal wiederholt.Fügen Sie anschließend sechs Milliliter Lysepuffer eins jedem der Kolben auf Eis hinzu. Schwenken Sie dann die Kolben 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Abschließend gewinnen Sie die Zellen mithilfe eines Zellabstreifers und überführen sie in 15-Milliliter-Konizgläser. An diesem Punkt können die Zellen bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Falls die Zellen eingefroren wurden, tauen Sie sie auf. Nach dem Auftauen zentrifugieren Sie die Zellen und verwerfen den Überstand.Suspenderen Sie die Zellen anschließend in sechs Millilitern Lysepuffer zwei und schwenken Sie die Röhrchen vorsichtig 10 Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie die Zentrifugation und resuspendieren Sie die Zellen in 2,5 Millilitern Lysepuffer drei. Bereiten Sie danach die Suspension zur Sonifikation vor, indem Sie sie in ein Becherglas mit eisgekühltem Wasser stellen und die Mikrotip eines Branson 450 Soniergeräts auf eine Amplitude zwischen 50 und 60 % einstellen.Sonifizieren Sie die Lösung für eine 32. Sekunde mit kontinuierlichem Impuls und kühlen Sie sie auf Eis. Wiederholen Sie diese Impulse für eine Minute 10 bis 15 Mal, pipettieren Sie den Inhalt des Reaktionsgefäßes mehrmals auf und ab und überführen Sie ihn in ein neues Reaktionsgefäß. Fahren Sie fort, die Lösung in Impulsen zu behandeln und abzukühlen.Fügen Sie nach der Sonikation zusätzlich fünfmal Triton X-100 10 % der Lösungsvolumens hinzu. Überführen Sie anschließend die Lysate in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie das Zelltrümmer in einer Mikrozentrifuge, bevor Sie die Chromatin-Immunpräzipitation oder Chip durchführen. Bewahren Sie 50 Mikroliter des Zelllysats als Input-Probe auf.Anschließend wurde das klare Zelllysat mit Dynabeads, die an einen zuvor gemäß der schriftlichen Anleitung präparierten Antikörper gebunden waren, kombiniert. Die Mischung zusammen mit der 50-Mikroliter-Eingangsprobe über Nacht bei vier Grad Celsius schütteln. Die Beads mit einem Milliliter Waschpuffer waschen.Dann verwenden Sie einen Magnethalter, um die Kügelchen zu sammeln, und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diese Waschung sechs bis acht Mal. Führen Sie eine abschließende Waschung mit einem Milliliter TE-Puffer mit 50 Millimolar Natriumchlorid durch.Zentrifugieren Sie die Kügelchen in einer Mikrozentrifuge; danach den restlichen TE-Puffer abpipettieren. Anschließend 100 Mikroliter Elutionspuffer zu den Proben hinzufügen. Unmittelbar danach.Inkubieren Sie die Proben bei 65 Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten. Kratzen Sie die Röhrchen alle zwei Minuten an einem 1,5-Milliliter-Röhrchenhalter ab, um die Perlen in Suspension zu halten. Sammeln Sie die Perlen mittels Zentrifugation und dem Magnethalter und überführen Sie das SNAT in ein PCR-Röhrchen.Danach die zuvor aufbewahrte Input-Probe entnehmen und drei Volumina des Elutionspuffers hinzufügen. Abschließend die IP- und Input-Proben über Nacht bei 65 Grad Celsius in den Thermocycler geben. Um die Vernetzungen am folgenden Tag rückgängig zu machen, ein Volumen TE-Puffer zu den Proben hinzufügen.Anschießend RNAs A bis zu einer Endkonzentration von 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter hinzufügen. Die Proben im Thermocycler eine bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter hinzufügen.Anschließend die Proben zwei Stunden lang im Thermocycler bei 55 Grad Celsius inkubieren. Danach die Proben einmal mit einem Volumen Phenol extrahieren. Die Proben ein zweites Mal mit einem Volumen Phenyl-Chloroform-Isoamylalkohol extrahieren.Extrahieren Sie die Proben abschließend nochmals mit einem Volumen Chloroform-Isoamylalkohol. Geben Sie dann 30 Mikrogramm Glykogen zu jeder Probe hinzu. Fügen Sie außerdem Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 0,2 Molar sowie zwei Volumina Ethanol zu den Proben hinzu.Inkubieren Sie sie 30 Minuten bei minus 80 Grad Celsius. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Proben und dekantieren Sie das Überstand. Waschen Sie die Pellets mit 500 µL 75%igem Ethanol, trocknen Sie die Pellets anschließend und resuspendieren Sie sie in 40 µL Wasser.Um die Größen der durch das SONICATION-Verfahren erzeugten DNA-Fragmente zu überprüfen, laden Sie fünf Mikrogramm der gereinigten Input-Probe in ein 1,8 %iges Agarosegel und führen das Gel durch. Das Sonication-Verfahren sollte Fragmente im Bereich von 150 bis 350 Basenpaaren erzeugen. Falls die Fragmente jedoch nicht in diesem Bereich liegen, sollte das Sonication-Verfahren angepasst werden, indem die Anzahl der Impulse und die Amplitude vor der Amplifikation der genomischen DNA variiert werden.Überprüfen Sie Größe, Konzentration und Anreicherung der Proben, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Um die Amplifikation der genomischen DNA zu beginnen, entnehmen Sie 34 Mikroliter der IP-Probe und 200 Nanogramm der Input-Probe. Führen Sie die Endreparatur, A-Tailing und Ligation von Adaptern an DNA-Fragmente unter Verwendung eines Illumina-Genom-DNA-Probevorbereitungskits durch, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.Reinigen Sie die DNA mithilfe eines Mini-Elutions-PCR-Reinigungs-Kits und eluieren Sie sie anschließend in Puffer EB, der zuvor auf 50 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Verwenden Sie 23 Mikroliter und 46 Mikroliter für die IP- und Input-DNA-Proben respectively. Stellen Sie die PCR-Reaktion durch Zugabe von 23 Mikrolitern DNA mit Adaptern und 25 Mikrolitern Fusion-DNA-Polymerase aus dem Kit her.Ein Mikroliter 20 Mikromolarer PCR-Eins und ein Mikroliter 20 Mikromolarer PCR-Zwei; führen Sie die PCR-Reaktion wie in dem schriftlichen Protokoll beschrieben durch. Reinigen Sie die DNA mit dem Qiagen Mini-PCR-Reinigungskit.Erwärmen Sie 15 Mikroliter Puffer EB auf 50 Grad Celsius vor und verdünnen Sie die DNA, indem Sie 0,5 Mikroliter der Probe im Verhältnis 1:4 verdünnen, und führen Sie eine NanoDrop-Messung durch, um die amplifizierten Produkte zu reinigen. Bereiten Sie ein 1,8 %iges Agarosegel von 50 Milliliter mit HPLC-Reinstwasser vor, fügen Sie TAE und Bromid hinzu, nachdem die Agarose geschmolzen ist. Gießen Sie dann das Gel ein und laden Sie das Gel auf. Nachdem vier Mikroliter Lade-Puffer zu den Input- und IP-Proben hinzugegeben wurden, führen Sie das Gel bei 120 Volt 45 Minuten lang laufen. Analysieren Sie das Gel nach dem Lauf. Dies sollte zeigen, dass Fragmente im Bereich zwischen 150 und 350 Basenpaaren erzeugt wurden.Sie repräsentieren genomische DNA-Fragmente mit einer Länge zwischen 50 und 250 Basenpaaren. Schneiden Sie mit einem Skalpell den Gelbereich aus, der das Material im Bereich von 150 bis 350 Basenpaaren enthält. Achten Sie darauf, den Adapter-Adapter-Band, der bei etwa 120 Basenpaaren läuft, nicht mit auszuschneiden.Isolieren Sie die DNA mithilfe eines Kayak-Schnell-Gel-Extraktionskits gemäß den Herstelleranweisungen. Trocknen Sie die Probe in einem SpeedVac ohne Hitze exakt auf 11 Mikroliter ein. Entnehmen Sie ein Mikroliter der Probe und bestimmen Sie die DNA-Konzentration mit einem NanoDrop-Spektrophotometer.Schließlich identifizieren Sie angereicherte Genprodukte mithilfe des Illumina-Genomanalysators und analysieren Sie die Bindungsstellen und Zielgene, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Die genomischen Koordinaten der identifizierten angereicherten RB-Bindungsprotein-zwei- oder RBP-zwei-Bindungsregionen werden in einem chromosomenspezifischen Format dargestellt. Die Besetzungen von Ensemble-Genen auf den Chromosomen können als schwarze VARs visualisiert werden.Hier werden die Besetzungen des Chromosoms 10 durch RBP zwei gezeigt, wobei zwei Bindungsregionen als vertikale Linien dargestellt sind. Das mittlere Feld zeigt alle Bindungsregionen der RBP-zwei-Isoformen auf Chromosom 10, und das untere Feld zeigt die Bindungsregionen der großen RBP-zwei-Isoform. Diese Informationen geben einen Überblick über überlappende und spezifische Besetzungen der RBP-zwei-Isoformen auf Chromosom 10.Hier ist eine Wärmekarte mit falscher Entdeckungsrate oder FDR-korrigierten, signifikant angereicherten Genontologie- oder GO-molekularen Funktionskategorien unter den von RBP gebundenen Genen dargestellt. Zwei Farbtöne in Richtung Rot deuten auf hohe statistische Signifikanz hin. Gelb zeigt geringe statistische Signifikanz an, und Grau weist auf keine statistische Signifikanz hin.Die Anreicherungsanalyse zeigt die überlappenden und isoformspezifischen molekularen Funktionen der Zielgene von R BP zwei. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen während dieses Verfahrens identifiziert. Es ist wichtig, DNA-Fragmente im geeigneten Größenbereich und mit ausreichender Ausbeute herzustellen.Dies kann erreicht werden, indem Sie unsere Anleitungen während des SCHOCKIERENS-Schritts befolgen. Das war's. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten und danke fürs Zuschauen.

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Forschung

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Biologie

Unsere Bayesian ändern Point (BCP)-Algorithmus baut auf state-of-the-art Fortschritte in der Modellierung change-Punkten über Hidden-Markov-Modelle und wendet sie auf Chromatinimmunpräzipitation Sequenzierung (ChIPseq) Datenanalyse. BCP funktioniert gut sowohl breit und punktförmige Datentypen, sondern zeichnet sich durch genaue Identifizierung robust, reproduzierbar Inseln diffuse Histon Bereicherung.

A Novel Bayesian Change-Punkt Algorithmus für genomweite Analyse Diverse ChIPseq Datentypen

In diesem Video demonstrieren wir die Chromatin-Immunpräzipitationstechnik zur Identifizierung von Proteinbindungsstellen an spezifischen Regionen der genomischen DNA von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen durch die selektive Immunpräzipitation von proteingebundenen Chromatinfragmenten. Diese Methode hilft, das Zusammenspiel mehrerer regulatorischer Proteine zu untersuchen, einschließlich Transkriptionsfaktoren, die an der Genregulation beteiligt sind.

Chromatin-Immunpräzipitation zur Identifizierung von Zielprotein-Bindungsstellen auf genomischer DNA

Die Kombination von Chromatinimmunpräzipitation und ultra-Sequenzierung mit hohem Durchsatz (Chip-seq) zu identifizieren und abzubilden Protein-DNA-Wechselwirkungen in einem bestimmten Gewebe oder Zelllinie. Skizziert ist, wie man eine hohe Qualität ChIP Vorlage für anschließende Sequenzierung mit Erfahrung mit dem Transkriptionsfaktor TCF7L2 als Beispiel zu generieren.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

Ein Protokoll beschrieben, das Illumina Infinium Assays verwendet, um groß angelegte Genotypisierung. Diese Assays zuverlässig Millionen SNPs Genotyp über Hunderte von einzelnen DNA-Proben in drei Tagen. Einmal erzeugt, können diese Genotypen verwendet werden, um für Vereine mit einer Vielzahl von verschiedenen Erkrankungen oder Phänotypen zu überprüfen.

Infinium-Assay für Groß SNP Genotypisierung Anwendungen

Dieses Video Artikel beschreibt ein in vitro-Mikroarray-basierte Methode, um die Gen-Targets und Bindungsstellen für Zweikomponentensystem Antwortregulatoren bestimmen.

DNA-Affinitäts-gereinigten Chip (DAP-Chip)-Methode, um Gene für bakterielle Ziele fest, Zwei-Komponenten-Systeme Regulatory

Die Identifizierung von Molekülen, die mit spezifischen genomischen Regionen von Interesse assoziiert sind, ist erforderlich, um die Mechanismen der Regulation der Funktionen dieser Regionen zu verstehen. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Durchführung einer technischen DNA-bindenden Molekül-vermittelten Chromatin-Imunopräzipitation (enChIP) zur Identifizierung von Proteinen und RNAs, die mit einer bestimmten genomischen Region assoziiert sind.

Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP

Epigenetische Faktoren können mit genetischen Programme zu modulieren Genexpression und regulieren die Funktion der B-Zellen interagieren. Durch die Kombination von in-vitro- B-Zell-Stimulation, qRT-PCR, und Hochdurchsatz-RNA-Sequenz und mRNA-Sequenz Ansätze, analysieren wir die epigenetische Modulation von MiRNA und gen-Expression in B-Zellen.

Genomweite Analyse von HDAC-Inhibitor-vermittelten Modulation der Micro-RNAs und mRNAs in B Zellen induziert unterziehen Class-Schalter DNA-Rekombination und Plasma-Zell-Differenzierung

Dieses Protokoll beschreibt die kombinatorische Verwendung von ChIP-Seq, 4sU-Seq, total RNA-Seq und Ribosom profiling für Zelllinien und Primärzellen. Nachverfolgen von Änderungen im Transkriptionsfaktor verbindlich, de Novo Transkription, RNS-Verarbeitung, Umsatz und Übersetzung im Laufe der Zeit und zeigt den gesamten Verlauf der Ereignisse in aktivierten und/oder sich rasch verändernden Zellen ermöglicht.

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Das Manuskript beschreibt einen Chip-basierte digitale PCR-Assay zu erkennen, eine seltene CDH1 Transkript Variante (CDH1a) in Tiefkühlfrische normalen und Tumorgewebe von Patienten mit Magenkrebs erhalten.

Erkennung einer CDH1 selten Transkript Variante in Tiefkühlfrische Magenkrebs Geweben durch Chip-basierte digitale PCR

Wir präsentieren ein Protokoll zur Identifizierung funktioneller Implikationen nicht-kodierender Varianten, die durch genomweite Assoziationsstudien (GWAS) anhand dreidimensionaler Chromatin-Wechselwirkungen identifiziert wurden.

Mapping Alzheimer-Krankheit Varianten zu ihren Zielgenen mit Hilfe der Berechnung der Chromatin-Konfiguration

Dieser Artikel beschreibt ein halbautomatisches, mikroskaliertes ChIP-Seq-Protokoll von DNA-Regionen, die mit einer spezifischen Histonmodifikation (H3K27ac) unter Verwendung einer ChIP-Liquid-Handler-Plattform assoziiert sind, gefolgt von der Bibliotheksvorbereitung mittels Tagmentation. Das Verfahren umfasst eine Kontrollbewertung für Qualitäts- und Quantitätszwecke und kann auf andere Histonmodifikationen oder Transkriptionsfaktoren angewendet werden.

Ein halbautomatisches ChIP-Seq-Verfahren für groß angelegte epigenetische Studien

Erfahren Sie, wie ChIP-Seq genomweite Ziele der Histondemethylase KDM5A/RBP2 identifiziert. Diese Methode nutzt Sonication und Immunpräzipitation zur Analyse epigenetischer Regulation.

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