Intraperitoneale Injektion in Adult Zebrafisch
30. August 2010
Wir zeigen, intraperitoneale Injektion in das Erwachsenenleben Zebrafisch. Wir verwenden eine 10 ul Nanofil Mikrospritze durch eine Micro4 Controller und UltraMicroPump III geregelt. Diese Demonstration umfasst den Einsatz von kaltem Wasser als Betäubungsmittel.
Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Lösung in die Bauchhöhle des adulten Zebrafisches zu injizieren. In diesem Beispiel werden wir in unserem Labor Glukose injizieren. Wir verwenden dieses Verfahren, um die Blutglukosestase zu untersuchen.
Dies wird erreicht, indem der Fisch zuerst gewogen wird, um die Menge der zu injizierenden Lösung pro Gramm Körpergewicht zu bestimmen. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, den Fisch mit kaltem Wasser zu betäuben. Der dritte Schritt des Verfahrens ist, den Fisch auf den Mikroskopständer zu überführen und zu injizieren.
Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, den Fisch in seinen Tank zurückzubringen, damit er sich erholt. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Veränderungen der Glukosehomöostase durch Messung der Blutglukosekonzentration zeigen. Hallo, ich bin Mary Kinkle aus dem Labor von Victoria Prince am Department für Organismische Biologie und Anatomie der University of Chicago.
Ich bin Stephanie Ames, ebenfalls aus dem Prince-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur intraperitonealen Injektion bei adulten Zebrafischen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Regulation der Blutglukose-Homöostase zu untersuchen.
Beginnen wir also. Um die Fische für die Injektion vorzubereiten, überführen Sie die Fische zunächst in ein sauberes Becken und entziehen Sie ihnen Nahrung. Verzichten Sie 24 Stunden lang auf Fütterung, um den Darminhalt zu entleeren, und 72 Stunden lang, um den Blutzuckerspiegel auf Basiswerte zu senken.
Die in diesem Protokoll verwendete Dichte beträgt 10 bis 12 Tiere mit gemischtgeschlechtlicher Population pro Neun-Liter-Becken mit drei Schichten aus Kieseln. Die Kiesel stecken die Eier ein, sodass diese nicht gefressen werden. Entfernen Sie täglich die Eier und Abfälle durch Absaugen des Beckens.
Als Nächstes bereiten Sie die Cortland-Salzlösung vor, indem Sie 124,1 Millimolar Natriumchlorid, 5,1 Millimolar Kaliumchlorid, 2,9 Millimolar Natriumpyrophosphat, 1,9 Millimolar Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 1,4 Millimolar Calciumchlorid-Dihydrat, 11,9 Millimolar Natriumbicarbonat, vier Gramm Polyvinylroone und 1000 USP-Einheiten Heparin in deionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 100 Millilitern auffüllen, filtrieren, sterilisieren und bei vier Grad Celsius lagern. Danach lösen Sie fünf Gramm Glukose in 10 Millilitern Cottin-Salzlösung. Um eine Glukose-Lösung mit einer Konzentration von 0,5 Milligramm pro Mikroliter herzustellen, filtrieren, sterilisieren und lagern Sie diese bei vier Grad Celsius.
Bereiten Sie dann den chirurgischen Tisch vor, indem Sie einen weichen Schwamm auf etwa 20 Millimeter Höhe an der flachen Seite zuschneiden. Führen Sie einen 10 bis 15 Millimeter tiefen Schnitt aus, um den Fisch für die Injektion zu fixieren. Stellen Sie den Schwamm in eine 60 Millimeter große Petrischale und setzen Sie die Petrischale mit dem Schwamm in den Deckel eines P-200-Pipettenspitzen-Behälters.
Bereiten Sie als Nächstes das Mikroskop vor, indem Sie die Mikroskoptischplatte mit Plastikfolie und Papiertüchern zum Schutz abdecken. Für den Fall von Verschüttungen stellen Sie den Operationstisch auf das Papiertuch. Stellen Sie den Fokus vorab ein, indem Sie den Operationstisch betrachten und auf den Schwamm fokussieren.
Legen Sie Ihren Finger auf die Oberseite des Schwamms und konzentrieren Sie sich darauf, um weitere Fokuseinstellungen zu minimieren, sobald der Fisch auf dem Operationsfeld liegt. Wiegen Sie den Fisch, indem Sie einen 500-Milliliter-Becher etwa zu einem Drittel mit Wasser aus der Fischhaltung füllen und vorsichtig reißen. Überführen Sie den Fisch mithilfe eines Netzes mit so wenig überschüssigem Wasser wie möglich auf eine Waage in den Becher, notieren Sie das Gewicht und überführen Sie jeden gewogenen Fisch in einen klaren, beschrifteten Behälter.
Berechnen Sie das Injektionsvolumen basierend auf dem Gewicht. In diesem Beispiel injizieren wir eine Lösung von 0,5 Milligramm pro Gramm Körpergewicht an Glukose, gelöst in Cortland-Salzlösung. Da unsere Lösung 0,5 Milligramm pro Mikroliter beträgt, lautet die Berechnung: ein Mal das Gewicht des Fisches in Gramm ergibt das zu injizierende Volumen in Mikrolitern. Bereiten Sie die Spritze und die dazugehörige Injektionsausrüstung vor.
Dieses Protokoll verwendet eine 30-5G-gekippte Stahlnadel, eine Ultra-Mikropumpe und einen Micro-Four-Prozessor sowie eine 10-Mikroliter-Nano-Füll-Mikrospritze für die Glukoseinjektion. Füllen Sie die Spritze mit 0,5 Milligramm pro Mikroliter Glukose, gelöst in Cortland-Salzlösung. Es ist wichtig, alle Luftblasen aus der Spritze zu entfernen, die Spritze auf der Ultra-Mikropumpe zu montieren und das Injektionsvolumen für den ersten Fisch einzustellen, indem das Volumen in Nanolitern über das nummerierte Tastenfeld des Micro-Four-Prozessors eingegeben wird. Bereiten Sie abschließend das Eis-Anästhetikum vor, indem Sie ausreichend Eiswürfel aus Wasser der Fischhaltungsanlage zerkleinern.
Um einen Eisbehälter zu füllen, stellen Sie den Operationsplatz in einen größeren Behälter, beispielsweise einen 2,4-Liter-Kunststoffbehälter für die Lebensmittelaufbewahrung. Gießen Sie etwas warmes Leitungswasser in den äußeren Behälter und auf den Operationsplatz. Stellen Sie einen Reservetank mit warmem Leitungswasser in unmittelbarer Nähe bereit.
Befestigen Sie ein Thermometer am äußeren Behälter. Stellen Sie den äußeren Behälter mit dem Anästhetikum sowie den Operationsplatz neben das Mikroskop. Halten Sie den Eimer mit Eiswürfeln in der Nähe bereit.
Fügen Sie Eisstücke hinzu, bis die Wassertemperatur 17 Grad Celsius beträgt. Unterschreiten Sie für diesen Schritt nicht 17 Grad Celsius. Überführen Sie die Fische mit einem Netz in den Außenbehälter.
Bei 17 Grad oder etwas darunter breiten die Fische typischerweise ihre Brustflossen horizontal aus, schnappen nach Luft und zeigen schnelle Bewegungen der Kiemendeckel. Fügen Sie langsam Eisstücke zum Behälter hinzu, um die Temperatur innerhalb mehrerer Minuten auf 12 Grad Celsius abzusenken. Während die Temperatur sinkt, schwimmen die Fische langsamer und hören schließlich ganz auf zu schwimmen.
Schließlich wird das Luftschnappen aufhören und die Kiemenbewegungen verlangsamen sich. Der Fisch ist bereit für die Injektion, wenn er nicht mehr auf Berührungen reagiert. Wenn die erforderliche Temperatur erreicht ist, drücken Sie auf den Schwamm, um ihn zu durchtränken.
Halten Sie Ihre Finger so lange im kalten Wasser, dass sie sich nicht erwärmen und den Fisch aufwärmen, wodurch er aus der Narkose erwachen könnte. Überführen Sie den Fisch vorsichtig mit kalten Fingern in die Nut des Schwamms. Positionieren Sie den Fisch mit dem Bauch nach oben und den Kiemen in der Nut.
Übertragen Sie den Operationstisch schnell auf die Mikroskopbühne. Positionieren Sie die Nadel schnell und vorsichtig, sodass die Spitze kranial zeigt und näher am Beckengürtel als am Anus liegt. Führen Sie die Nadel entlang der Mittellinie zwischen den Beckenflossen ein.
Sie sollten spüren können, wann die Nadel tief unterhalb der Körperwand liegt. Beim Einführen der Nadel spüren Sie, wie die Körperwand nachgibt. Sobald die Nadel in die Bauchhöhle eindringt, injizieren Sie das entsprechende Volumen mit dem Mikroprozessor.
Verwenden Sie das Fußpedal, um einen Mikroliter pro Gramm Fischkörpergewicht zu injizieren. Nach der Injektion entfernen Sie die Nadel und überführen den Fisch unverzüglich zurück in seinen Warmwassertank zur Erholung. Überprüfen Sie die Nadel unter dem Mikroskop, indem Sie den Fisch über dem Tankwasser aus dem Schwamm entlassen. Gelegentlich bleibt eine Schuppe an der Nadel hängen, die vor der nächsten Injektion entfernt werden sollte.
Nach einer geeigneten Zeitspanne führen Sie Ihren nachgeschalteten Assay durch. Wir haben festgestellt, dass ein 72-stündiges Fasten erforderlich ist, um den Blutglukosespiegel vor der Injektion auf einen Grundniveauwert zu senken. In dieser Abbildung zeigen die nicht injizierten Kontrolldaten, dargestellt in Grün, Blutglukosewerte, die nicht signifikant von den hier in Rot dargestellten Kontrollen mit Fahrzeuginjektion abweichen.
Jedoch zeigt die blaue Linie die Blutglukosewerte bei injizierten Fischen und veranschaulicht den Anstieg und Abfall der zirkulierenden Glukose. Im Zeitverlauf befanden sich sowohl die mit Glukose als auch die mit Vehikel injizierten Tiere während des Injektionsvorgangs unter chirurgischer Anästhesie, während die nicht injizierten Kontrollen nicht unter chirurgischer Anästhesie standen. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine intraperitoneale Injektion bei adulten Zebrafischen durchführt.
In unserem Labor untersuchen wir Veränderungen der Blutglukosekonzentration zu verschiedenen Zeitpunkten nach einer i.p.-Injektion einer Glucoselösung. Diese Technik, die wir Ihnen gerade gezeigt haben, kann jedoch verwendet werden, um Ihre gewünschte Lösung zu injizieren. Beachten Sie beim Durchführen dieses Verfahrens, den Fisch langsam zu anästhesieren und vorsichtig zu handhaben.
Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
Übersicht
In diesem Artikel wird das Verfahren für intraperitoneale Injektionen bei adulten Zebrafischen unter Verwendung einer NanoFil-Mikrospritze und Kaltwasseranästhesie demonstriert. Die Methode zielt darauf ab, die Glukosehomöostase im Blut durch präzise Injektionen zu untersuchen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Physiologie
Hintergrund
- Intraperitoneale Injektionen sind entscheidend, um Substanzen direkt in die Bauchhöhle zu verabreichen.
- Zebrafische sind ein wertvolles Modellorganismus zur Untersuchung metabolischer Prozesse.
- Das Verständnis der Regulation des Blutzuckerspiegels ist entscheidend für Erkenntnisse über Stoffwechselstörungen.
- Die Verwendung von Anästhesie ist notwendig, um den Stress während des Eingriffs zu minimieren.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode für intraperitoneale Injektionen bei Zebrafischen demonstrieren.
- Die Forschung zur Glukosehomöostase und deren Regulation erleichtern.
- Einen Protokollablauf bereitstellen, der in anderen Laboren reproduziert werden kann.
Verwendete Methoden
- Vorbereitung der Fische durch Fasten und Wiegen, um das Injektionsvolumen zu bestimmen.
- Anästhesierung der Fische mittels kaltem Wasser, um während der Injektion minimale Bewegungen sicherzustellen.
- Injektion einer Glucoselösung in die Bauchhöhle unter Verwendung einer präzisen Mikrospritze.
- Überwachung der Erholung der Fische nach der Injektion zur Beurteilung der Auswirkungen des Verfahrens.
Hauptergebnisse
- Das Verfahren ermöglicht erfolgreich die Injektion von Substanzen in adulte Zebrafische.
- Die Blutglukosewerte können nach der Injektion gemessen werden, um metabolische Veränderungen zu untersuchen.
- Die Fische erholen sich gut nach dem Eingriff, was auf die Wirksamkeit des verwendeten Anästhetikums hinweist.
- Die Ergebnisse tragen zu einem besseren Verständnis der Glukosehomöostase bei Zebrafischen bei.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode stellt ein wertvolles Werkzeug für Forscher dar, die Stoffwechselprozesse bei Zebrafischen untersuchen.
- Die intraperitoneale Injektion ist eine machbare und wirksame Technik zur Applikation von Lösungen.
- Zukünftige Studien können auf diesem Protokoll aufbauen, um verschiedene Stoffwechselbedingungen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Praktische Bedeutung für die Industrie
Die gezielte Verabreichung von Substanzen beim Zebrafisch ermöglicht die mechanistische Absicherung metabolischer Zielstrukturen durch die Etablierung von Dosis-Wirk-Beziehungen in einem Wirbeltiersystem. Dieser Ansatz unterstützt die Validierung von Zielstrukturen durch gezielte Störung der Glukosehomöostase und verringert damit die Uneindeutigkeit bei der Untersuchung von Signalwegen. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Forschung, indem sie quantitative und reproduzierbare phänotypische Endpunkte liefert, die für die Modellierung metabolischer Erkrankungen relevant sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Verabreichung definierter Dosen zur Beurteilung der Zielinteraktion in den Signalwegen der Glukoseregulation.
- Operationaler Wert: Gewährleistet reproduzierbare Verabreichung von Wirkstoffen, um die Variabilität bei der Beurteilung des metabolischen Phänotyps zu minimieren.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biologische Risikominderung durch direkte Messung von Blutglukoseänderungen als funktionellen Endpunkt der Modulation metabolischer Zielstrukturen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Messungen der abhängigen Variablen (Blutglukosespiegel), die eine Dosis-Wirkungs-Analyse zur Identifizierung von Wirkstoffkandidaten ermöglichen.
- Operationaler Wert: Standardisiert das Injektionsvolumen basierend auf dem Fischgewicht und verbessert so die Reproduzierbarkeit des Assays über verschiedene experimentelle Ansätze hinweg.
- Wissenschaftlicher Wert: Erleichtert die Herstellung validierter biologischer Systeme für nachgeschaltete metabolische Screening-Workflows.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Einhaltung krankheitsrelevanter Systeme, indem die Störung der Glukosehomöostase modelliert wird, die für die Pathophysiologie des Diabetes relevant ist.
- Operativer Wert: Stellt die prozedurale Konsistenz sicher, indem standardisierte Protokolle für Fasten, Anästhesie und Injektionen angewendet werden, was die Übertragbarkeit zwischen Laboren unterstützt.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die mechanistische Risikominimierung, indem der Effekt injizierter Substanzen von stressinduzierten Glukoseerhöhungen durch Verwendung von Kontrollpräparaten (Vehicle Controls) isoliert wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Optimierung, indem sie einen zuverlässigen Weg für die Applikation von Verbindungen in Stoffwechseltests an Zebrafischen bietet.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen bei der Glukoseregulation, indem präzise Substanzgaben an adulte Zebrafische ermöglicht werden.
- Screening: Stellt Bereitschaft für Assays sicher durch standardisierte, gewichtsbasierte Injektionsvolumina, die eine konsistente Exposition gegenüber der Substanz gewährleisten.
- Analytik: Erzeugt quantitative Messungen des Blutglukosespiegels, die den Vergleich metabolischer Reaktionen zwischen verschiedenen Behandlungsgruppen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung durch die Nutzung eines Wirbeltiermodells mit evolutionär konservierten Mechanismen der Glukosehomöostase.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Kapazität für das Screening metabolischer Phänotypen über mehrere Substanzserien und Zielstrukturen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in der Analyse metabolischer Wege reduziert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch definierte Injektionsvolumina und kontrollierte Anästhesieverfahren.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem klare Dosis-Wirkungs-Daten zur Modulation der Glukosehomöostase bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen basierend auf validierten metabolischen Effekten in einem Ganzorganismus-System.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Zebrafischen, in der Anästhesie und in Mikrospritzentechniken.
- Setzt den Zugang zu Ultramikropumpen, NanoFil-Spritzen und temperaturgeregelten Anästhesieeinrichtungen voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen den Teams hinsichtlich Dauer des Fastens, Gewichtsmessung und Berechnung des Injektionsvolumens.
- Beinhaltet Anpassungen bezüglich unterschiedlicher Löslichkeiten der Verbindungen und Injektionsvolumina im Trägermedium Cortland-Salzlösung.
- Ist durch die technische Fähigkeit begrenzt, die Kiemenbelüftung aufrechtzuerhalten und Verletzungen an der Injektionsstelle während der Durchführung des Verfahrens zu vermeiden.
