Intraperitoneale Injektion in Adult Zebrafisch

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Lösung in die Bauchhöhle des erwachsenen Zebrafisches zu injizieren. In diesem Beispiel injizieren wir Glukose in unserem Labor. Wir verwenden dieses Verfahren, um die Blutzuckerstase zu untersuchen.

Dies wird erreicht, indem der Fisch zuerst gewogen wird, um zu bestimmen, wie viel Lösung pro Gramm Körpergewicht injiziert werden soll. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, den Fisch mit kaltem Wasser zu betäuben. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, den Fisch auf den Mikroskoptisch zu bringen und zu injizieren.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, den Fisch zur Erholung in sein Aquarium zurückzubringen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die durch die Messung des Blutzuckerspiegels Veränderungen in der Glukosehomöostase zeigen. Hallo, ich bin Mary Kinkle vom Labor von Victoria Prince in der Abteilung für Organismische Biologie und Anatomie an der University of Chicago.

Ich bin Stephanie Ames, ebenfalls vom Prince Lab. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur intraperitonealen Injektion in erwachsene Zebrafische. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Regulation der Blutzuckerhomöostase zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Um den Fisch für die Injektion vorzubereiten, setzen Sie den Fisch zunächst in ein sauberes Aquarium und halten Sie das Futter schnell zurück. Der Fisch 24 Stunden lang, um den Inhalt der Darmknollen zu entleeren, und 72 Stunden, um den Blutzuckerspiegel auf den Ausgangswert zu senken.

Die in diesem Protokoll verwendete Dichte beträgt 10 bis 12 gemischtgeschlechtliche Bevölkerungen. Fische pro Neun-Liter-Becken mit drei Schichten Murmeln, die Eier sequestrieren, damit sie nicht gefressen werden. Entfernen Sie täglich Eier und Abfällen, indem Sie den Tank absaugen.

Bereiten Sie unten als nächstes Cortland-Salzlösung mit 124,1 Millimolar Natriumchlorid, 5,1 Millimolar Kaliumchlorid, 2,9 Millimolar Natriumpyrophosphat, 1,9 Millimolar Magnesiumsulfat Hept Hydrat, 1,4 Millimolar Calciumchlorid Dihydrat 11,9 Millimolar Natriumbicarbonat, vier Gramm Polyvinylroon und 1000 USP Einheiten Heparin bis zu einem Endvolumen von 100 Millilitern mit einem deionisierten Wasserfilter vor. sterilisieren und bei vier Grad Celsius lagern. Als nächstes lösen Sie fünf Gramm Glukose in 10 Millilitern Cottinsalzlösung auf. Um eine Glukoselösung von 0,5 Milligramm pro Mikroliter herzustellen, filtrieren, sterilisieren und bei vier Grad Celsius lagern.

Bereiten Sie dann den Operationstisch vor, indem Sie einen weichen Schwamm auf der flachen Fläche auf eine Höhe von etwa 20 Millimetern schneiden. Machen Sie einen 10 bis 15 Millimeter tiefen Schnitt, um den Fisch für die Injektion zu halten. Setzen Sie den Schwamm in eine 60 Millimeter Petrischale ein und setzen Sie die Petrischale mit einem Schwamm in den Deckel einer Pipettenspitze P 200 ein.

Bereiten Sie als Nächstes das Mikroskop vor, indem Sie den Mikroskopsockel zum Schutz mit Plastikfolie und Papiertüchern abdecken. Für den Fall, dass etwas verschüttet wird, stellen Sie den Operationstisch auf das Papiertuch. Stellen Sie den Fokus vor, indem Sie den Operationstisch betrachten und auf den Schwamm fokussieren.

Legen Sie Ihren Finger auf den Schwamm und fokussieren Sie sich darauf, um eine weitere Fokusanpassung zu minimieren, wenn der Fisch auf dem Operationstisch liegt. Nach dem Wiegen des Fisches wird ein 500-Milliliter-Becherglas zu etwa einem Drittel mit Fischwasser gefüllt und aufgerissen. Setzen Sie die Fische mit möglichst wenig überschüssigem Wasser auf einer Waage in das Becherglas um und notieren Sie das Gewicht, übertragen Sie jeden gewogenen Fisch in ein klar beschriftetes Becken.

Berechnen Sie das Injektionsvolumen basierend auf dem Gewicht. In diesem Beispiel injizieren wir eine Lösung von 0,5 Milligramm pro Gramm Körpergewicht Glukose, die in Cortland-Salzlösung gelöst ist. Da unsere Lösung 0,5 Milligramm pro Mikroliter beträgt, lautet die Berechnung: Das Einsfache des Fischgewichtsgramms entspricht dem Volumen, das in Mikrolitern injiziert werden soll, die Vorbereitung der Spritze und der zugehörigen Injektionsausrüstung.

Dieses Protokoll verwendet eine 30 5G abgeschrägte Stahlnadel, eine Ultra-Mikropumpe und einen Micro-Four-Prozessor sowie eine 10-Mikroliter-Nano-Fill-Mikrospritze für die Glukoseinjektion, füllen Sie die Spritze mit 0,5 Milligramm pro Mikroliter Glukose, gelöst in Cortland-Salzlösung. Es ist wichtig, alle Luftblasen von der Spritze zu entfernen, die Spritze auf die Ultramikropumpe zu montieren und das Injektionsvolumen für den ersten Fisch zu programmieren, indem Sie das Volumen in Nanolitern über die nummerierte Tastatur des Micro-Four-Prozessors eingeben. Bereiten Sie zum Schluss das Eisanästhetikum vor, indem Sie genügend Eiswürfel aus dem Wasser der Fischanlage zerkleinern.

Um einen Eiskübel zu füllen, stellen Sie den Operationstisch in einen größeren Behälter, z. B. einen 2,4-Liter-Vorratsbehälter aus Gummi. Gießen Sie etwas warmes Wasser in den äußeren Behälter und den Operationstisch. Halten Sie einen Reservetank mit warmem Wasser in der Nähe.

Befestigen Sie ein Thermometer am äußeren Behälter. Stellen Sie den äußeren Anästhesiebehälter und den Operationstisch neben das Mikroskop. Halten Sie den Eimer mit den Eiswürfeln bereit.

Beginnen Sie mit der Zugabe von Eischips, bis die Wassertemperatur 17 Grad Celsius beträgt. Gehen Sie für diesen Schritt nicht unter 17 Grad Celsius. Verwenden Sie ein Netz, um den Fisch in den äußeren Behälter zu bringen.

Bei 17 Grad oder etwas tiefer spreizt der Fisch in der Regel seine Brustflossen horizontal, keucht und macht schnelle Ohrbewegungen. Geben Sie langsam Eiswürfel in den Behälter, um die Temperatur im Laufe mehrerer Minuten auf 12 Grad Celsius zu senken. Wenn die Temperaturen sinken, schwimmen die Fische langsamer und hören schließlich auf zu schwimmen.

Irgendwann hört das Keuchen auf und die Ohrbewegungen verlangsamen sich. Der Fisch ist bereit für die Injektion, wenn er nicht auf die Berührung reagiert. Wenn die gewünschte Temperatur erreicht ist, drücken Sie auf den Schwamm, um ihn zu sättigen.

Halten Sie Ihre Finger ausreichend in das kalte Wasser, damit sie den Fisch nicht erwärmen und aus der Narkose holen. Setzen Sie den Fisch während der Handhabung mit kalten Fingern vorsichtig in den Trog des Schwamms um. Positionieren Sie den Fisch mit dem Hinterleib nach oben und den Kiemen im Trog.

Bringen Sie den Operationstisch schnell auf den Mikroskoptisch. Arbeiten Sie schnell und positionieren Sie die Nadel vorsichtig so, dass die Spitze nach vorne zeigt und näher am Beckengürtel als am Anus ist. Führen Sie die Nadel in die Mittellinie zwischen den Beckenflossen ein.

Du solltest spüren können, wann die Nadel tief an der Körperwand anliegt. Während du die Nadel einführst, kannst du spüren, wie die Körperwand nachgibt. Wenn die Nadel in die Bauchhöhle eintritt, injizieren Sie das entsprechende Volumen mit dem Mikroprozessor.

Verwenden Sie das Fußpedal, um nach der Injektion einen Mikroliter pro Gramm Körpergewicht des Fisches zu injizieren, entfernen Sie die Nadel und bringen Sie den Fisch sofort zurück in seinen Warmwassertank zur Erholung. Indem Sie den Fisch aus dem Schwamm über dem Aquarienwasser lösen, überprüfen Sie die Nadel unter dem Mikroskop. Gelegentlich wird eine Skala angebracht, die vor der nächsten Injektion entfernt werden sollte.

Fahren Sie nach einer angemessenen Zeit mit Ihrem Downstream-Assay fort. Wir haben festgestellt, dass ein 72-stündiges Fasten erforderlich ist, um den Blutzucker vor der Injektion auf ein Ausgangsniveau zu senken. In dieser Abbildung zeigen die in Grün dargestellten nicht injizierten Kontrolldaten Blutzuckerwerte, die sich nicht signifikant von den hier in Rot gezeigten Kontrollen mit Fahrzeuginjektion unterscheiden.

Die blaue Linie zeigt jedoch die Blutzuckerwerte für Fische, denen Glukose injiziert wurde, und zeigt den Anstieg und Abfall der zirkulierenden Glukose an. Im Laufe der Zeit standen sowohl die glukoseinjizierten als auch die vehikelinjizierten Tiere während des Injektionsverfahrens unter chirurgischer Narkose, während die nicht injizierten Kontrollen nicht unter chirurgischer Narkose standen. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie eine intraperitoneale Injektion in erwachsene Zebrafische durchführen können.

In unserem Labor untersuchen wir Veränderungen der Blutzuckerkonzentration zu verschiedenen Zeitpunkten nach der IP-Injektion einer Glukoselösung. Diese Technik, die wir Ihnen gerade gezeigt haben, kann jedoch verwendet werden, um Ihre Lösung von Interesse zu injizieren. Denken Sie bei diesem Verfahren daran, den Fisch langsam zu betäuben und vorsichtig zu behandeln.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.