Erkennung von Neu1 Sialidase-Aktivität bei der Regulierung der Toll-like-Rezeptor-Aktivierung

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Induktion der zellulären neuen Sase-Aktivität als Reaktion auf die Bindung eines Liganden an seinen spezifischen Rezeptor zu bewerten. Dies wird erreicht, indem Zellen zunächst 24 Stunden lang auf kreisförmigen Glasobjektträgern mit einem Durchmesser von 12 Millimetern in einer 24-Loch-Gewebekulturplatte kultiviert werden. Als zweiter Schritt werden die lebenden, auf dem Glasobjektträger haftenden Zellen direkt mit einer zuvor hergestellten Mischung aus Sase-Substrat und Rezeptorligand – mit oder ohne spezifische Inhibitoren – auf einem Mikroskopobjektträger in Kontakt gebracht.

Der Objektträger wird sofort unter ein Fluoreszenzmikroskop gebracht, um die Fluoreszenzbilder sichtbar zu machen und digital aufzuzeichnen. Im Zeitverlauf werden Ergebnisse erhalten, die Veränderungen in der neuen Sase-Aktivität an der Zelloberfläche zeigen, die mit ligandenbehandelten lebenden Zellen assoziiert ist, basierend auf der blauen Fluoreszenzintensität, die die Zellen im Epi-Fluoreszenzmikroskop umgibt.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der spektralphotometrischen Analyse besteht darin, dass weniger Reagenzien benötigt werden. Außerdem können Sie die sase-Aktivität in lebenden Zellen beobachten und Bilder davon aufnehmen. Diese Methode kann verwendet werden, um zentrale Fragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, beispielsweise potenziell neuartige Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen zu untersuchen sowie die Auswirkungen spezifischer Enzym- oder Proteininhibitoren auf die Rezeptoraktivierung zu analysieren.

Den Vorgang werden Dr. Ray Amit und Dr. PT Gath demonstrieren, ehemalige Doktoranden aus meinem Labor, die diesen Assay in ihren Forschungsstudien verwenden, bevor sie gefrorene Makrophagenzellen wiederbeleben. Bereiten Sie das Kulturmedium vor, indem Sie steriles, filtriertes Delcos, modifiziertes Eagles-Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum und fünf Mikrogramm pro Milliliter des Antibiotikums Plasmin, verwenden. Geben Sie dann für jede Ampulle gefrorener Zellen vier Milliliter des Kulturmediums in einen 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturkolben, nehmen Sie die Ampulle mit den gefrorenen Zellen aus dem minus 80 Grad Celsius kalten Gefrierschrank und tauen Sie diese schnell durch Aufwärmen in der Hand in der sterilen Biohazard-Sicherheitswerkbank auf.

Das dauert etwa zwei bis drei Minuten. Sobald die Zellen aufgetaut sind, überführen Sie sie mithilfe einer sterilen Ein-Milliliter-Pipette schnell in den Zellkulturkolben, der das konditionierte Medium enthält. Stellen Sie den Kolben mit den Zellen in einen Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop.

Überprüfen Sie die Zellen täglich auf Wachstum und Anheftung, bis sie einige Tage vor der Zellplattierung für den SASE-Assay 75 % bis 90 % konfluent sind. Bereiten Sie die 12 Millimeter großen runden Glasscheiben vor, auf die die Zellen aufgebracht werden. In der Sicherheitswerkbank.

Legen Sie die Objektträger in eine große Glas-Petri-Schale und sterilisieren Sie sie, indem Sie sie nach einer Stunde für eine Stunde in 100 % Ethanol eintauchen. Entfernen Sie den Alkohol und lassen Sie die feuchten Glasobjektträger 24 Stunden lang oder bis zur Trocknung dem sterilen, gefilterten Luftstrom im Schrank unter UV-Licht ausgesetzt. Die Zellen sterilisieren zunächst eine vollständig gekrümmte vier Zoll lange, gezahnte Edelstahl-Pinzette durch Flammen.

Verwenden Sie dann die Pinzette, um vorsichtig eine einzelne sterile, runde Glasplatte in jede Vertiefung einer 24-Loch-Flachboden-Zellkultur-Platte aus polystyrol, die für die Zellkultur behandelt wurde, zu legen. Entfernen Sie mit einer sterilen 5-Milliliter-Pipette das DMEM-konditionierte Medium aus dem Kolben mit den adhärenten Makrophagenzellen. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1 x sterilem Tris-gepuffertem Salzlösung (pH 7,4), um jegliches serumhaltiges Medium zu entfernen.

Fügen Sie anschließend ein Milliliter kalziumhaltiges, phosphatgepuffertes Kochsalzlösungsmittel ohne Phosphat bei pH 7,4 hinzu. Stellen Sie die Zellen für etwa 10 Minuten oder bis die Zellen beginnen, sich im Kolben abzuheben, in den 37-Grad-Celsius-Brutschrank. Sobald sich die Zellen abgehoben haben, geben Sie drei Milliliter DMEM-Konditioniertes Medium zu den suspendierten Zellen hinzu.

Überführen Sie anschließend 0,5 Milliliter der Suspension mit etwa 0,5 Millionen Zellen auf jede kreisförmige Glasplatte mit 12 Millimeter Durchmesser in der 24-Loch-Platte. Inkubieren Sie die Gewebekulturplatte mit den Makrophagenzellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid, damit die Zellen an den kreisförmigen Glasplatten adhärieren können. Der Assay zur Bestimmung der Sase-Aktivität wird unter drei verschiedenen Bedingungen auf drei separaten Objektträgern durchgeführt. Auf dem ersten Objektträger, der als negativer.

Die Kontrollzellen werden mit Eindeckmedium behandelt. Das Neuraminidase-Substrat für ANA und trisgepufferte Salzlösung, jedoch nicht das Toll-ähnliche Rezeptor-Ligand LPS. Auf dem zweiten Objektträger werden die Zellen mit Eindeckmedium, dem Toll-ähnlichen Rezeptor-Ligand LPS und trisgepufferter Salzlösung behandelt.

Auf dem dritten Objektträger werden die Zellen einem Puffermedium aus ANA, LPS-Tris, gepuffertem Salzlösung und dem Neuraminidasehemmer Tamiflu ausgesetzt. Wir werden das Verfahren nur für den zweiten Test demonstrieren, da sich die drei Tests lediglich durch die Zusammensetzung der Verbindungen auf dem Objektträger unterscheiden. Legen Sie den Objektträger auf die Laborbank und geben Sie die folgenden Verbindungen nacheinander hinzu.

Ein Mikroliter Einbettmedium, gefolgt von einem Mikroliter Form zwei Mikroliter LPS und schließlich drei Mikroliter Tris-gepufferte Salzlösung, pH 7,4. Als Nächstes entfernen Sie das Medium aus einem der Vertiefungen einer 24-Loch-Platte, die die Zellen enthält. Der nächste Schritt ist der schwierigste Teil dieses Verfahrens, da Sie die kreisförmige Glasdeckenscheibe mit einer Pinzette aus der Vertiefung der Gewebekulturplatte entfernen müssen, ohne sie zu zerbrechen, und zwar mit einer vier Zoll langen Pinzette.

Heben Sie die runde Glasplatte vorsichtig in die Ecke der Vertiefung an und nehmen Sie sie dann sorgfältig heraus. Legen Sie die Platte mit den Zellen nach unten in die Lösungsmischung. Bringen Sie die Objektträger sofort zu einem Epi-Fluoreszenzmikroskop, das für den UV-Filter eingestellt ist und mit einer Digitalkamera zur Aufnahme von Fluoreszenzbildern ausgestattet ist. Fokussieren Sie das Mikroskop im Phasenkontrast, bis Sie die Zellen sehen können, und schalten Sie dann in den Fluoreszenzmodus um.

Erwerben Sie Bilder der Zellen im Fluoreszenzmodus nach einer, zwei und drei Minuten. Zusätzlich soll ein einzelnes Bild der Zellen in Phasenkontrastdarstellung aufgenommen werden. Die Ergebnisse eines SASE-Assay-Experiments sind hier dargestellt.

Zunächst wurden als negativer Kontrolle lebende Zellen, die an einer Glasobjektträger hafteten, direkt mit einer Mischung aus Einbettmedium und Formsubstrat in Kontakt gebracht. Wäre IP sase-Aktivität vorhanden, würde das Substrat zu freiem Ethyl Lum beone hydrolysiert, das nach Anregung bei 365 Nanometern eine Fluoreszenzemission bei 450 Nanometern zeigt, gemessen zwei Minuten nach Zugabe des Substrats.

Dieses fluoreszierende Bild zeigt keine SASE-Aktivität im Bereich der Zellen. Das nächste Bild zeigt die Ergebnisse eines positiven SASE-Assays, bei dem lebende Zellen, die auf einer Glasplatte hafteten, direkt mit einer Tropfenmischung aus Einbettungsmedium, Substrat vier und dem TLR-vier-Liganden LPS in Kontakt gebracht wurden. Das Substrat wurde durch das SASE-Enzym hydrolysiert, wodurch freies Ethylumbellon entstand, und das Fluoreszenzbild, das zwei Minuten nach Zugabe von Substrat und LPS aufgenommen wurde, weist auf hohe SASE-Aktivität im Bereich der Zellen hin.

Jedoch wurde die Sase-Aktivität stark verringert oder je nach Konzentration des Inhibitors nicht mehr nachgewiesen, wenn lebende Zellen direkt mit einem Tropfen aus Einbettmedium, nano-Substrat, TLR-4-Ligand LPS sowie dem Neuraminidase-Inhibitor Tamiflu in Kontakt gebracht wurden. Abschließend zeigt dieses Diagramm die 50-%-Hemmungskonzentration von Tamiflu und Oseltamivir-Carboxylat, die durch Auftragen der Abnahme der Sase-Aktivität gegen den Logarithmus der Wirkstoffkonzentration bestimmt wurde. Die mittlere Fluoreszenz im Bereich um die Zellen jeder Gruppe wurde mithilfe der Image-J-Software gemessen. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Zellen 24 Stunden vor Beginn des Sade-Assays auf runden Glasdeckgläsern in 24-Loch-Gewebekulturplatten zu kultivieren.

Zusätzlich müssen alle Reagenzien, die in diesem Assay verwendet werden, vor Beginn des Assays vorbereitet werden.