Name: Erkennung von Neu1 Sialidase-Aktivität bei der Regulierung der Toll-like-Rezeptor-Aktivierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Lernen Sie die Sialidase-Assay-Methode zur Untersuchung von TLR-Rezeptor-Aktivierung an lebenden Makrophagen. Diese Technik ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung enzymatischer Aktivität und liefert wertvolle Einblicke in immunologische Mechanismen.

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Teilweise Unterstützung durch Zuschüsse zu MRS ist von Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), die Harry Botterell Foundation for Neuroscience Research, ARC, und die Garfield Kelly Cardiovascular Research und Development Fund. SRA ist ein Empfänger der Queens University Research Award und dem Robert J. Wilson Fellowship. PJ ist ein Empfänger der Königin Graduate Award und dem Robert J. Wilson Fellowship. AG und SA werden die Empfänger der Königin Graduate Award. SF war der Empfänger der Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology (OGSST). AG ist der Empfänger der Königin Franklin Bracken Graduate Scholarship. SA ist der Empfänger der Königin RS McLaughlin Graduate Scholarship.

1. Resurrecting Gefrorene Makrophagen <ol><li> Vor Wiederbelebung eingefrorenen Zellen aus dem -80 ° C Gefrierschrank, muss man Kulturmedium Verwendung sterilfiltriert Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 5 g / ml plasmocin ergänzt vorzubereiten. Plasmocin ist eine Antibiotika-Lösung in unsere Forschung zur Beseitigung und Vermeidung von Mykoplasmen-Kontaminationen von Zellkulturen. </li><li> Für ein Fläschchen von gefrorenen Zellen gibt man 4 mL, 1 mL der kultivierten Medium bis zu einer 25 cm 2 Zellkulturflasche in ein steriles biohazard Containment Kapuze. </li><li> Wenn die Flasche mit der eingefrorenen Zellen aus dem -80 ° C Gefrierschrank genommen werden, werden sie schnell von Hand Erwärmung in den sterilen Haube, die etwa 2-3 min dauert aufgetaut. </li><li> Sobald die Zellen aufgetaut sind, sind sie schnell in den Kolben mit dem konditionierten Medium mit einer 1 ml sterilen Pipette übertragen. </li><li> Die Flasche mit den Zellen werden in einer Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 platziert. </li><li> Die Zellen für das Wachstum und die Einhaltung täglich überprüft, bis sie 75% bis 90% konfluent mit einem inversen Mikroskop werden. </li><li> Während der Zellkultur Inkubation, 12 mm runde Glasplatten durch Abdecken in 70% igem Ethanol in einem großen Glas-Petrischale für 1 Stunde in den Biohazard Containment Gehäuse sind sterilisiert, wird der Alkohol nachträglich entfernt und gespeichert reusage, und das nasse Glas Seiten bleiben ausgesetzt, um die sterilfiltriert Luftstrom im Gehäuse unter einer UV für 24 Stunden oder bis sie trocken sind. </li></ol> 2. Plating Cells für das Sialidase Assay <ol><li> Vor der Beschichtung der Zellen ist eine einzige sterile runde Glasplatte sorgfältig in eine Vertiefung einer BD Falcon 24-well Flachboden mit Deckel Gewebekultur-behandelte Polystyrol Platte gelegt mit einem sterilisierten flammenden voll gebogen, 4 &quot;, gezahnt, Edelstahl ForceP . Zum einen Kolben von Zellen bei 75% Konfluenz verwenden wir im Allgemeinen 12 Wells der Kulturplatte. </li><li> Für adhärente Makrophagen, die DMEM konditioniertem Medium aus der Flasche mit einer 5 mL sterilen Pipette in die sterile Containment Gehäuse entfernt werden. Waschen Sie die adhärenten Zellen einmal mit 1x Tris sterile Kochsalzlösung pH 7,4 auf jedem Serum enthaltenden Medium zu entfernen, und fügen Sie 1 ml Calcium-freien Medium (CMF) Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung bei pH 7,4 genug, um die Zellen zu decken. Die Zellen sind in der 37 ° C Inkubator für etwa 10 min oder in Verkehr gebracht, bis die Zellen zum Abheben in die Flasche zu beginnen. Der Kolben kann sanft geschaukelt werden oder geschüttelt, um alle verbleibenden adhärenten Zellen zu lösen. </li><li> Um die 1 ml suspendierten Zellen in der Flasche, 3 ml DMEM konditioniertem Medium. Nehmen Sie 0,5 ml der suspendierten Zellen und steril übertragen sie auf das Gewebe gezüchtet Platte mit den 12 mm runden Glasplatten. Rund, 0,5 x 10 6 Zellen, die runde Glasplatten übertragen. </li><li> Die Gewebekulturplatte enthaltenden Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 für 24 Stunden, damit für die Zellen, die runde Glasplatten haften. </li></ol> 3. Sialidase Assay 1. Dass die Kontrolle <ol><li> Legen Sie einen Objektträger (gefrostet: 1 Ende, 1Schieben, 25 x 75 x 1 mm) in der Containment-Schrank oder Labortisch und fügen durch Mischen in der angegebenen Reihenfolge die folgenden Verbindungen: 1 ul DAKO + 1 ul der 4-Muñana und schließlich + 3 ul Tris-gepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 (TBS). </li><li> Nach dem Entfernen der Medien aus einer gut mit den Zellen, heben die kreisförmige Glasplatte mit den 4 &quot;ForceP um die Ecke des Brunnens. Entfernen Sie vorsichtig das Glas Folie mit dem ForceP und legen Sie die Folie mit dem Zellen nach auf die Mischung Lösung auf dem Objektträger. </li><li> Sofort nehmen die microcope slide zu einem epi-Fluoreszenz-Mikroskopie, die für die UV-Filter gesetzt wurde und verfügt über eine digitale Kamera für die Aufnahme der fluoreszierenden Bildern. </li><li> Fokus des Mikroskops unter Phasenkontrast, bis Sie die Zellen sehen können und dann zu fluoreszierenden Modus. Machen Sie Fotos von den Zellen unter Fluoreszenzlicht bei 1 min, 2 min und 3 min. Nehmen Sie ein einzelnes Bild der Zellen unter Phasenkontrast. </li></ol> 2. Making the positiven Test <ol><li> Spot die folgenden Verbindungen in der Reihenfolge auf einem anderen Objektträger: 1 ul DAKO + 1 ul der 4-Muñana + 2 ul der LPS + 1 ul der TBS. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1.2 bis 3.1.4. </li></ol> 3. Making the Positive Prüfung zusammen mit Neuraminidase-Hemmer Tamiflu <ol><li> Spot die folgenden Verbindungen in der folgenden Reihenfolge auf einem anderen Objektträger: 1μL DAKO + 1μL von 4-Muñana + 2 ul der LPS + 1 ul von Tamiflu. </li><li> Tamiflu-Konzentrationen werden in 1x Tris vorbereiteten Kochsalzlösung pH 7,4; die endgültige Konzentration der Verbindungen in Kontakt mit den lebenden Zellen auf der kreisförmigen Glasplatte wird mit einem Verdünnungsfaktor von 5 haben. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1.2 bis 3.1.4. </li></ol> 4. Die Bestimmung der Konzentration des Inhibitors benötigt, um 50% der Sialidase-Aktivität (IC 50) Inhibit <ol><li> Zur Quantifizierung der Fluoreszenz um die Zellen, werden die Bilder analysiert mittels ImageJ 1.38x mit der Analyse-Plugin für die Messung RBG. Nehmen Sie 50 stichprobenartige Messungen der Fluoreszenz die Zellen umgebenden und berechnet den Mittelwert der gesamten Fluoreszenz. </li><li> Die IC 50 ist aus einem Grundstück von der Inhibitorkonzentration als log-Einheiten umgewandelt (zB log ng / mL) auf der x-Achse gegen die mittlere Fluoreszenz auf der y-Achse mittels nichtlinearer Regression erzeugt. </li></ol> 5. Secrets to Success <ol><li> Sicherstellen, dass die Zellen in Kultur sind frei von Verunreinigungen von Mykoplasmen. Wir verwenden routinemäßig Plasmocin in einem Kulturmedium, um für dieses Steuerelement. </li><li> Die künstliche Neuraminidase Substrat, 4-Muñana, sollte verwendet werden frisch zubereitet werden. Die vorbereiteten Untergrund kann innerhalb einer Woche für die Sialidase Assay verwendet werden. </li><li> Wenn die Zelllinie hat einen niedrigen Rezeptor-Expression auf der Zelloberfläche, kann man eine höhere Dosis des Liganden für die Stimulation zu verwenden. </li><li> Wir haben auch erlebt, dass die Zellen über 6 mal passagiert könnte ihren Rezeptor Phänotyp verlieren. Frisch, sollte wiederbelebt Zellen kultiviert werden. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Siehe animierte Protokoll der Sialidase-Assay mit repräsentativen Ergebnissen in der beigefügten <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2142/szewczuk_JoVE_sialidase_assay.pptx">Powerpoint-Datei</a> .

<ol><li>Amith, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neu1+desialylation+of+sialyl+alpha-2%2C3-linked+beta-galactosyl+residues+of+TOLL-like+receptor+4+is+essential+for+receptor+activation+and+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Neu1 desialylation of sialyl alpha-2,3-linked beta-galactosyl residues of TOLL-like receptor 4 is essential for receptor activation and cellular signaling.</a> Cell Signal. 22, 314-324 (2010).</li>
<li>Amith, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+pathogen+molecule-induced+Toll-like+receptor+activation+and+cell+function+on+Neu1+sialidase%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Dependence of pathogen molecule-induced Toll-like receptor activation and cell function on Neu1 sialidase.</a> Glycoconjugate Journal. 26, 1197-1212 (2009).</li>
<li>Woronowicz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+neurotrophic+factor+activation+of+Trk+tyrosine+kinase+receptors+on+cellular+sialidase%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Dependence of neurotrophic factor activation of Trk tyrosine kinase receptors on cellular sialidase.</a> Glycobiology. 17, 10-24 (2007).</li>
<li>Jayanth, P., Amith, S. R., Gee, K., Szewczuk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neu1+Sialidase+and+Matrix+Metalloproteinase-9+Cross-talk+is+Essential+for+Neurotrophin+Activation+of+Trk+Receptors+and+Cellular+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Signal%22%5BJournal%5D)">Neu1 Sialidase and Matrix Metalloproteinase-9 Cross-talk is Essential for Neurotrophin Activation of Trk Receptors and Cellular Signaling.</a> Cell. Signal. 22, 1193-1205 (2010).</li>
<li>Finlay, T. M., Jayanth, P., Amith, S. R., Glimour, A., Guzzo, C., Gee, K., Beyaert, R., Szewczuk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymoquinone+from+nutraceutical+black+cumin+oil+activates+Neu4+sialidase+in+live+macrophage%2C+dendritic%2C+and+normal+and+type+I+sialidosis+human+fibroblast+cells+via+GPCR+G%CE%B1i+proteins+and+matrix+metalloproteinase-9%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Thymoquinone from nutraceutical black cumin oil activates Neu4 sialidase in live macrophage, dendritic, and normal and type I sialidosis human fibroblast cells via GPCR Gαi proteins and matrix metalloproteinase-9.</a> Glycoconj J. 27, 329-348 (2010).</li>
<li>Seyrantepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Phagocytosis+in+Macrophages+by+Neuraminidase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of Phagocytosis in Macrophages by Neuraminidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 206-215 (2010).</li>
</ol>

SRA und PJ trugen gleichermaßen als Erstautoren.

Mit dem neu entwickelten Assay Sialidase-Aktivität in lebenden Makrophagen 2 zu erfassen, haben wir diese Technologie, um Sialidase-Aktivität in Liganden-induzierter Sialidase-Aktivität zu erkennen in Live-BMC-2 Makrophagen in einer dosisabhängigen Weise sowie in Live-DC-2.4 dendritischen Zellen , HEK-TLR4/MD2, HEK293, SP1 Mamma-Adenokarzinom-Zellen, menschliche WT und 1140F01 und WG0544 Typ I Sialidose Fibroblasten. Neuraminidase-Hemmer wie Tamiflu (Oseltamivir Phosphat) gehemmt thymoquinone-induzierte Siali...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-MUNANA</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation, fluoreszierendes Einbettmedium</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Tamiflu (Oseltamivir-Phosphat)</td><td>Hoffmann-La Roche AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

erkennung von neu1 sialidase-aktivität bei der regulierung der toll-like-rezeptor-aktivierung

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Mammalian Toll-like Rezeptoren (TLRs) sind eine Familie von Rezeptoren, die pathogen-associated molecular patterns zu erkennen. Nicht nur, dass TLRs entscheidende Sensoren mikrobieller (zB Viren, Bakterien und Parasiten) Infektionen, sie spielen auch eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie von Infektionskrankheiten, entzündliche Erkrankungen und möglicherweise bei Autoimmunkrankheiten. So muss die Intensität und Dauer der TLR-Reaktionen gegen Infektionskrankheiten streng kontrolliert werden. Daraus folgt, dass das Verständnis der strukturellen Integrität von Sensor-Rezeptoren, deren Liganden-Wechselwirkungen und Signalisierung Komponenten ist für die nachfolgenden immunologischen Schutz unerlässlich. Es wäre auch wichtig, Möglichkeiten für Krankheit Änderung durch den Sensor Manipulation. Obwohl die Signalwege der TLR-Sensoren sind gut charakterisiert, die Steuerung der Parameter Wechselwirkungen zwischen den Sensoren und deren Liganden immer noch schlecht definiert. Wir haben vor kurzem einen neuen Mechanismus der TLR-Aktivierung durch seine natürlichen Liganden, die nicht zuvor 1,2 beobachtet identifiziert. Er schlägt vor, Liganden-induzierte TLR-Aktivierung ist eng mit Neu1 Sialidase Aktivierung gesteuert. Wir haben auch berichtet, dass Neu1 dicht reguliert Neurotrophinrezeptoren wie TrkA und TrkB 3, die Neu1 und Matrix-Metalloproteinase-9 (MMP-9) cross-talk im Komplex mit dem Rezeptor 4 einzubeziehen. Die Sialidase Assay wurde zunächst verwenden, um einen neuen Liganden, thymoquinone zu finden, bei der Aktivierung von Neu4 Sialidase auf der Zelloberfläche von Makrophagen, dendritischen Zellen und Fibroblasten über GPCR Gαi Proteine ​​und MMP-9 5. Für TLR-Rezeptoren zeigen unsere Daten, dass Neu1 Sialidase bereits im Komplex mit TLR-2, -3 und -4 Rezeptoren, und ist bei der Ligandenbindung entweder Rezeptor induziert. Aktiviert Neu1 Sialidase hydrolysiert Sialyl α-2 ,3-verknüpften β-Galactosylresten entfernt von Ligandenbindung an sterische Hinderung an TLR-4 Dimerisierung, MyD88/TLR4 komplexen Rekrutierung, NFkB-Aktivierung und pro-inflammatorischen Zell-Antworten zu entfernen. In einer gemeinsamen Berichts hat Neu1 Sialidase wurde gezeigt, dass die Phagozytose in Makrophagen Zellen 6 zu regeln. Zusammengenommen hat die Sialidase Assay uns mit leistungsfähigen Einblicke in die molekularen Mechanismen von Liganden-induzierte Rezeptor-Aktivierung zur Verfügung gestellt. Obwohl die genaue Beziehung zwischen Neu1 Sialidase und die Aktivierung von TLR hat Trk-Rezeptoren noch nicht vollständig geklärt werden, wäre es eine neue oder bahnbrechende Ansatz Zellregulation Wege darstellen.

Die Sialidase-Test ist eine einfache technische Ansatz, der neuartige molekulare Mechanismus (s) der TLR-Sensoren von mikrobiellen Infektionen und die Beteiligung an entzündlichen Erkrankungen an der Rezeptor-Ebene auf der Zelloberfläche von Live-Makrophagen aufzuklären wird.

Erkennung von Neu1 Sialidase-Aktivität bei der Regulierung der Toll-like-Rezeptor-Aktivierung

Säugetier-Toll-like-Rezeptoren (TLRs) sind eine Familie von Rezeptoren, die pathogenassoziierte molekulare Muster erkennen. TLRs sind nicht nur entscheidende Sensoren für ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Induktion der zellulären neuen Sase-Aktivität als Reaktion auf die Bindung eines Liganden an seinen spezifischen Rezeptor zu bewerten. Dies wird erreicht, indem Zellen zunächst 24 Stunden lang auf kreisförmigen Glasobjektträgern mit einem Durchmesser von 12 Millimetern in einer 24-Loch-Gewebekulturplatte kultiviert werden. Als zweiter Schritt werden die lebenden, auf dem Glasobjektträger haftenden Zellen direkt mit einer zuvor hergestellten Mischung aus Sase-Substrat und Rezeptorligand – mit oder ohne spezifische Inhibitoren – auf einem Mikroskopobjektträger in Kontakt gebracht.Der Objektträger wird sofort unter ein Fluoreszenzmikroskop gebracht, um die Fluoreszenzbilder sichtbar zu machen und digital aufzuzeichnen. Im Zeitverlauf werden Ergebnisse erhalten, die Veränderungen in der neuen Sase-Aktivität an der Zelloberfläche zeigen, die mit ligandenbehandelten lebenden Zellen assoziiert ist, basierend auf der blauen Fluoreszenzintensität, die die Zellen im Epi-Fluoreszenzmikroskop umgibt.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der spektralphotometrischen Analyse besteht darin, dass

detection-neu1-sialidase-activity-regulating-toll-like-receptor

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt einen Assay zur Untersuchung der Toll-like Rezeptor (TLR)-abhängigen Aktivität der Transkriptionsfaktoren Kernfaktor-kappa-B (NF-κB) und Aktivatorprotein-1 (AP-1) in Makrophagen. Die TLRs lösen bei der Erkennung von schadensassoziierten molekularen Mustern (DAMPs) eine proinflammatorische Signalkaskade aus, die NF-κB und AP-1 aktiviert. Die manipulierten Reportermakrophagen produzieren bei Aktivierung von NF-κB und AP-1 ein sezerniertes embryonales alkalisches...

Ein Assay für die TLR-abhängige NF-&kcy;B/AP-1-Transkriptionsfaktor-Signalgebung in Makrophagen

Dieses Video zeigt einen Reporterzell-basierten Assay zum Screening potenzieller bioaktiver Nanopartikel, die die Signalübertragung des Toll-like-Rezeptors (TLR) hemmen. Der Assay beinhaltet die Einführung von Lipopolysacchariden (LPS), gemischt mit Peptid-Gold-Nanopartikel-Hybriden, in Reportermakrophagen, die die Reporterproteine exprimieren – sezernierte embryonale alkalische Phosphatase (SEAP) und Luciferase. Die Reduktion des LPS-induzierten TLR-Signals, das durch die Hybride vermittelt...

Ein Assay zum Screening bioaktiver Nanopartikel auf die Hemmung der Toll-like-Rezeptor-Signalgebung

Dendritische Zellen (DCs) sezernieren IL-1β in Reaktion auf TLR8 Anerkennung von synthetischen Purin, R848, gefolgt von NLRP3 Inflammasom Aktivierung mit Nigericin daher, IL-1β kann verwendet werden, um NLRP3 Inflammasom Aktivität zu messen. Die intrazelluläre Zytokin-Färbung, Immunoblotting und ELISA werden verwendet, um NLRP3 Inflammasom Grundieren und Aktivierung über IL-1β Ausdruck genau zu messen.

Aktivierung und Messung der NLRP3 Inflammasom Aktivität mit IL-1β in humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen

Wir beschreiben ein HPLC-basiertes Verfahren zur Bestimmung von N-Acetylneuraminsäure und N-Glykolylenuraminsäure in Mausleber und Milch.

Bestimmung von Sialinsäuren in Leber- und Milchproben von Wildtyp und<em&gt; CMAH</em&gt; Knock-out Mäuse.

Maut-like Rezeptor (TLR) -Signalisierung spielt eine wichtige Rolle bei der Pathophysiologie vieler menschlicher entzündlicher Erkrankungen, und die Regulierung der TLR-Reaktionen durch bioaktive Nanopartikel wird in vielen entzündlichen Zuständen als vorteilhaft angesehen. THP-1 zellbasierte Reporterzellen bieten eine vielseitige und robuste Screening-Plattform zur Identifizierung neuer Inhibitoren der TLR-Signalisierung.

Screening bioaktiver Nanopartikel in phagozytischen Immunzellen für Inhibitoren der Toll-like Receptor Signaling

MALT1 regelt die angeborene Immunität, aber wie in diesem Fall bleibt unklar. Wir verwendet die selektive MALT1 Paracaspase Inhibitor MLT-827 um zu entwirren den Beitrag von MALT1 zur angeborenen Signalisierung von Toll-Like oder C-Art Lectin-Like-Rezeptoren, zeigen, dass MALT1 die Produktion der myeloischen Zytokine reguliert, vor- und nachgelagerten der C-Art Lectin-Like-Rezeptoren selektiv.

Myeloische angeborene Signalisierung Pathway Verordnung von MALT1 Paracaspase Tätigkeit

Dieses Protokoll bietet Forschern eine schnelle, indirekte Methode zur Messung der TLR-abhängigen NF--B/AP-1-Transkriptionsfaktoraktivität in einer murinen Makrophagenzelllinie als Reaktion auf eine Vielzahl von polymeren Oberflächen und adsorbten Proteinschichten, die die Mikroumgebung des Biomaterials Implantate modellieren.

Ein Makrophagen-Reporter-Zell-Assay zur Untersuchung der toll-like Receptor-vermittelten NF-kB/AP-1-Signalisierung auf adsorbierten Proteinschichten auf polymeren Oberflächen

Dieses Protokoll umfasst eine Reihe von funktionellen Neutrophilen-Assays, die als Screening-Methode verwendet werden, um Funktionen aus verschiedenen Signalwegen abzudecken. Das Protokoll beinhaltet eine erste und einfache Bewertung der Zelllebensfähigkeit, Reinheit, Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, Echtzeitmigration, Phagozytose und einen vorläufigen Vorschlag für neutrophile extrazelluläre Fallen.

Eine Reihe von Screening-Techniken für einen schnellen Überblick über die Funktion der Neutrophilen

Ein einzigartiges, umfassendes Protokoll zur Generierung von de-sialylierten humanen monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (mo-DCs) aus isolierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) unter Verwendung einer Sialidase-Behandlung wird vorgestellt. Des Weiteren werden Methoden zur Beurteilung der phänotypischen und funktionellen Charakterisierung von mo-DCs beschrieben und evaluiert, wie die Behandlung mit Sialidase das Reifungsniveau von mo-DCs verbessert.

Generierung von Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen mit unterschiedlichen sialylierten Phänotypen

Hier schlagen wir ein einfaches Protokoll vor, das metabolisches Oligosaccharid-Engineering, Click-Chemie und Expansionsmikroskopie kombiniert und die Biobildgebung von intrazellulären sialylierten N-Glykoproteinen mit verbesserter Auflösung unter Verwendung von Routinemikroskopiegeräten ermöglicht.

Visualisierung der intrazellulären Sialylierung mit Click-Chemie und Expansionsmikroskopie

Lernen Sie die Sialidase-Assay-Methode zur Untersuchung von TLR-Rezeptor-Aktivierung an lebenden Makrophagen. Diese Technik ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung enzymatischer Aktivität und liefert wertvolle Einblicke in immunologische Mechanismen.

Erkennung von Neu1 Sialidase-Aktivität bei der Regulierung der Toll-like-Rezeptor-Aktivierung

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