Hochauflösende LWL-Mikroendoskopiesysteme für In situ Cellular Imaging

Traditionell wurden biologische und klinische Studien, die eine mikroskopische Analyse mit Auflösung auf zellulärer Ebene erfordern, durchgeführt, indem mehrere Experimente parallel durchgeführt wurden, wobei einzelne Proben zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten aus der Studie entnommen wurden. Die Punkte für die Auswertung durch Lichtmikroskopie, während Konfokal-, Multiphotonen- und Elektronenmikroskopie der zweiten Harmonischen nützliche Techniken für die Bildgebung in situ sind. Die erforderliche Infrastruktur ist komplex und teuer, da Scanning-Lasersysteme und komplexe Lichtquellen zum Einsatz kommen. Hier zeigen wir, wie man an einem einzigen Tag ein hochauflösendes faseroptisches Mikroendoskopsystem mit Standardkomponenten für unter 5.000 US-Dollar bauen kann.

Die Plattform bietet Flexibilität in Bezug auf Bildauflösung, Sichtfeld und Betriebswellenlänge. Zunächst wird ein einfacher Rahmen für ein Epi-Fluoreszenzmikroskop zusammengebaut, in dem eine Lichtquelle, optische Filterlinsen, ein Glasfaserbündel und eine CCD-Kamera untergebracht werden können. Als nächstes werden die Abbildungslinsen installiert, die ein vergrößertes Bild des Glasfaserbündels auf der CCD-Kamera bilden.

Anschließend wird eine LED-Quelle mit Beleuchtungsoptik installiert, um die Probe mit fluoreszierendem Anregungslicht zu versorgen. Mit dem zusammengebauten Mikroendoskop zeigt die Echtzeit-Bildgebung schließlich Details auf zellulärer Ebene von fluoreszenzmarkierten Proben, einschließlich In-vitro-Kulturen, In-vivo-Tiermodellen und menschlichen Probanden. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der konfokalen oder Multiphotonenmikroskopie besteht darin, dass sie einfach und kostengünstig genug ist, so dass Forscher, die in einer Vielzahl von Bereichen arbeiten, sie schnell implementieren und an ihre spezifischen Bedürfnisse anpassen können.

Das hier beschriebene hochauflösende Mikroendoskop sollte als Basiskonfiguration betrachtet werden, bei der mehrere Variationen in Montage und Anwendung möglich sind. Berücksichtigen Sie bei der Auswahl von Komponenten für eine bestimmte Anwendung die inhärenten Beziehungen in der Fluoreszenzmikroskopie zwischen Fluorolkonzentration, Photobleaching-Beleuchtung, Intensität, Kameraempfindlichkeit, Verstärkung und Belichtungszeit. Diese Plattform ist für die Verwendung mit Proflavin als fluoreszierendes Kontrastmittel konzipiert, kann aber auch für die Verwendung mit anderen Fluoreszenzfarbstoffen konfiguriert werden.

Pro Flavin ist ein heller Zellkernfleck mit maximalen Absorptions- und Emissionswellenlängen von 445 Nanometern bzw. 515 Nanometern. Die Verwendung anderer Kontrastmittel erfordert, dass der Benutzer die Anregungsemission und dichroitische Filter entsprechend auswählt, um das Mikroendoskopsystem zusammenzustellen, indem er zunächst zwei sechs Zoll große Käfigstäbe mit zwei 1,5 Zoll langen Käfigstäben verbindet, um ein Paar von 7,5 Zoll langen Stäben zu bilden. Schrauben Sie die Stangen in eine Seite der Klappspiegeleinheit und installieren Sie dann einen Spiegel mit einem Durchmesser von einem Zoll.

Schrauben Sie anschließend vier 0,5-Zoll-Stäbe in die gegenüberliegende Seite der Klappspiegeleinheit. Schieben Sie den Käfigwürfel über die beiden unteren Durchgangslöcher auf die 7,5 Zoll Käfigstangen. Schrauben Sie die zwei Zoll großen Stangen in die Seitenfläche des Käfigwürfels.

Befestigen Sie die Kamera mit einem Adapter mit C-Mount auf SM One an einer Käfigplatte. Befestigen Sie die Käfigplatte an den 0,5-Zoll-Käfigstangen, die bündig mit der Vorderseite der Klappspiegeleinheit abschließen. Wählen Sie ein Rohrobjektiv mit einem Durchmesser von einem Zoll, um ein Bild des Glasfaserbündels auf der Kamera zu erstellen.

Die Brennweite der Linse sollte so gewählt werden, dass die Ursache des Glasfaserbündels um mindestens zwei Pixel abgetastet wird. Wenn das Objektiv auf die Kamera übertragen wird, setzen Sie es in einen drei Zoll langen Objektivtubus ein und befestigen Sie das Objektiv mit einem Sicherungsring. Ein Schraubenschlüssel ist hilfreich, um Sicherungsringe in lange Linsentuben einzuschrauben.

Lassen Sie den Emissionsfilter in den drei Zoll großen Objektivtubus auf den ersten Sicherungsring fallen und fügen Sie einen weiteren Ring hinzu, um den Filter an Ort und Stelle zu sichern. Stellen Sie sicher, dass die Filterausrichtung der vom Filterhersteller angegebenen Konvention entspricht. Schrauben Sie den Objektivtubus in die Seite des Käfigwürfels, die der CCD-Kamera am nächsten ist.

Diese Position ist auch hier zu sehen. Beachten Sie, dass dieses Objektiv und dieser Filter im Diagramm ohne Drei-Zoll-Objektivtubus dargestellt sind. Schließen Sie die Kamera zur besseren Übersichtlichkeit an einen Computer an und sehen Sie sich das Bild auf dem Bildschirm an.

Richten Sie die Käfigbaugruppe auf ein entferntes Objekt, und schieben Sie den Käfigwürfel entlang der Schienen, bis ein Bild des Objekts im Fokus angezeigt wird. Ziehe mit einem Schraubendreher die vier Schrauben fest, die sich an den Seiten des Käfigwürfels befinden. Diese Schrauben greifen beim Festziehen in die Schienen und halten den Würfel in Position.

Dadurch wird sichergestellt, dass die Tubuslinse ein fokussiertes Bild des Faserbündels auf der Kamera erzeugt, wenn sie mit der unendlich korrigierten Objektivlinse kombiniert wird. Setzen Sie dann den diic-Spiegel in die Halterung ein und platzieren Sie ihn in einem Winkel von 45 Grad in den Käfigwürfel. Schrauben Sie das Objektiv über einen RMS-auf-SM-Eingewindeadapter und einen verstellbaren Objektivtubus in die Vorderseite des Käfigwürfels gegenüber dem Tubus-Objektivhalter ein.

Schrauben Sie danach einen SMA-Stecker in eine Käfigplatte und montieren Sie diesen an den Stangen ungefähr im Arbeitsabstand der Objektivlinse. Lege die Grundplatte und die Endkappe an die offenen Seiten des Käfigwürfels. Montieren Sie dann eine LED auf einer Käfigplatte und schieben Sie sie auf das Ende der zwei Zoll großen Stangen.

Füge eine Linse zu einem 0,5-Zoll-Objektivtubus hinzu, so dass dieser Tubus, wenn er in die Seite des Käfigwürfels eingeschraubt wird, ein Bild der LED bildet, die die hintere Blende der Objektivlinse ausfüllt. Füge außerdem den Anregungsfilter in den Objektivtubus ein. In diesem Stadium kann ein LED-Treiber verwendet werden, um die Beleuchtungsintensität mit Epoxidharz zu steuern.

Schließen Sie einen SMA-Stecker für eine 1030-Mikron-Faser an das 720-Mikron-Sichtfeld-Glasfaserbündel an. Weitere Informationen zur Steckverbinder von Glasfasern finden Sie in den T Thor Labs, Teilenummer FN nine six. Ein Leitfaden zum Verbindern und Polieren von optischen Fasern.

Schrauben Sie das Augenbündel des SMA-Steckers in die am Käfig montierte SMA-Buchse, die Stangen richten Sie das distale Ende des Bündels auf eine Breitbandlichtquelle; Leuchtstofflampen reichen aus. Beobachten Sie dann das Bild der proximalen Fläche des Bündels auf der CCD-Kamera. Passen Sie abschließend die Position der Objektivlinse an, indem Sie den Käfigwürfel ein- oder ausschrauben.

Bis das Bild des Faserbündels scharf erscheint, sollte die individuelle Ursache deutlich erkennbar sein. Die räumliche Auflösung des Mikroendoskops kann erhöht werden, indem eine Mikrolinse oder Linsenanordnung an der distalen Spitze des Faserbündels angebracht wird. Diese Optiken sind so konfiguriert, dass die Bündelspitze nicht direkt auf das Gewebe aufgesetzt wird, sondern die Spitze mit einer Vergrößerung auf die Gewebeoberfläche abgebildet wird.

Dadurch wird die räumliche Abtastfrequenz erhöht, die durch die Lichtleiterursache des Faserbündels auferlegt wird. Der Grad der Vergrößerung entspricht der Erhöhung der räumlichen Auflösung und gleichzeitig einer proportionalen Verkleinerung des Gesichtsfeldes. Wählen Sie eine Grinslinse mit der gewünschten Vergrößerung und dem gewünschten Arbeitsabstand für Ihre Anwendung.

Stellen Sie sicher, dass der Durchmesser der Linse mit dem des Faserbündels übereinstimmt. Sie planen, mit zu arbeiten. Montieren Sie das Faserbündel und die Grinslinse auf separaten dreiachsigen manuellen Positioniertischen unter einem Mikroskop oder Stereoskop mit geringer Leistung, um eine genaue Ausrichtung zu gewährleisten.

Geben Sie als Nächstes einen Tropfen optischen Klebstoff auf die Linse oder die Bündelfläche. Bringen Sie die beiden Komponenten mit den manuellen Positionierern in Kontakt. Setzen Sie die Grenzfläche für die vom Hersteller empfohlene Dosis UV-Licht aus, um den Klebstoff auszuhärten.

Um die Grinslinse und die geklebte Schnittstelle zu schützen, verwenden Sie ein kurzes Stück Aluminium-Kapillarschlauch, um die Verbindung zu umschließen. Schieben Sie den Schlauch über die Verbindung und befestigen Sie ihn mit dem Tropfen Epoxidharz an jedem Ende des Schlauchs, verwenden Sie einen Schrumpfschlauch, um die Montage abzuschließen. Tragen Sie vor der mikroendoskopischen Bildgebung das Kontrastmittel auf die Zellen oder das Gewebe auf, die abgebildet werden sollen, um Zellen und Kulturen abzubilden.

Entfernen Sie zunächst Wachstumsmedien durch Peppe. Fügen Sie dann die Pro-Flavin-Lösung hinzu, indem Sie sie vorsichtig in die Vertiefung pipettieren. Nach einer kurzen Inkubation von bis zu einer Minute wird die Pro-Flavin-Lösung mit Peppe entfernt und verworfen.

Spülen Sie die Zellen, indem Sie frische PBS-Lösung in die Vertiefung geben und entfernen, und montieren Sie das distale Ende des Faserbündels in einer sicheren Vorrichtung mit manuellen Positionierungstischen auf der x-, y- und z-Achse, um die Stabilität zu gewährleisten. Während der Bildgebung nach dem Auftragen des Farbstoffs auf Zellen oder Gewebe wird das Faseroptikbündel in Lichtkontakt mit der Probe gebracht. Betrachten Sie das Bild des Glasfaserpakets auf dem Computerbildschirm, entweder mit der vom Kamerahersteller bereitgestellten Software oder mit einer benutzerdefinierten Software, die Sie entwickeln möchten.

Passen Sie die Belichtungszeit und die Verstärkungseinstellungen der Kamera an, um ein Bild mit akzeptabler Helligkeit zu erhalten. Bei korrekter Montage funktioniert das Mikroendoskop als Epi-Fluoreszenzmikroskop, das über ein kohärentes faseroptisches Bündel weitergeleitet wird. Für optimale Bildgebungsergebnisse sollte darauf geachtet werden, dass drei Schlüsselbedingungen erfüllt sind.

Zunächst sollte die proximale Fläche des Faserbündels ohne Defokussierung auf die CCD-Kamera abgebildet werden, um die volle Auflösung des Systems zu erreichen. Hier. Ein Teil eines Faserbündels wird mit schlechtem Fokus, leichtem Fokus und gutem Fokus abgebildet. Die optimale Fokussierung wird gefunden, indem die tatsächliche Position der Objektivlinse relativ zur Bündelfläche eingestellt wird.

Zweitens sollte die proximale Fläche des Faserbündels gleichmäßig über seinen gesamten Durchmesser beleuchtet werden. Wie bereits beschrieben, wird dies erreicht, indem die Beleuchtungsoptik für die Cola-Beleuchtung konfiguriert wird. Das hier gezeigte Bild wurde aufgenommen, wenn eine gleichmäßig fluoreszierende Probe in dieser bevorzugten Konfiguration beleuchtet wird.

Das entsprechende Ergebnis unter kritischer Beleuchtung ist hier dargestellt. Die Struktur der LED wird auf die Faserbündelfläche abgebildet, was dazu führt, dass dieses unerwünschte Muster die wahre Probenstruktur überlagert. Drittens ist es wichtig sicherzustellen, dass sowohl die proximale als auch die distale Fläche des Faserbündels sauber und frei von Kratzern und Spänen sind.

In diesem Beispiel werden Bildreste an der Bündelfläche befestigt und ein Schaden in Form eines kleinen Chips bei fünf Uhr ist am Faserumfang zu sehen. Schmutz kann von den Bündelflächen entfernt werden, indem die Reinigung auf die gleiche Weise wie bei herkömmlichen Glasfasersteckverbindern mit Linsenpapier und Isopropanol oder Standard-Glasfaser-Reinigungswerkzeugen durchgeführt wird. 1483 Zellen wurden mit Proflavin markiert und das blanke Faserbündel leicht auf die Probe gelegt.

Hier wird eine In-vitro-Bildgebung gezeigt, bei der eine 2,5-fache Grinslinse auf die Bündelspitze geklebt wurde, eine Verbesserung der räumlichen Auflösung und eine Verringerung des Gesichtsfeldes erreicht wurde. In vivo-Bildgebung, bei der ein Faserbündel mit einem Außendurchmesser von 0,5 Millimetern durch eine 21-Gauge-Nadel geführt und in ein Brustfettpolstergewebe der Maus vorgeschoben wurde, wie in diesem Film zu sehen, sind Adipozyten aufgrund des Herzzyklus deutlich sichtbar mit Bewegung. In diesem Beispiel wurde die Bildgebung der Mundschleimhaut bei einem gesunden menschlichen Freiwilligen mit einem größeren Faserbündel mit einem Außendurchmesser von 1,5 Millimetern durchgeführt.

In allen gezeigten Beispielen wurde Pro Flavin als nukleäres Markierungsfluoreszenzkontrastmittel verwendet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein faseroptisches Mikroendoskop für die Fluoreszenzbildgebung von Zellen und Geweben in C zwei entwirft und zusammenbaut.