Name: Herstellung von Hühnerembryo-Extrakt für die Kultivierung von Murine Neural Crest Stem Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von Hühnerembryo-Extrakt für die Kultivierung von Neural Crest Stem Cells. Diese Methode umfasst Isolation, Zentrifugation und Filtration von 11 Tage alten Embryonen.

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Die Unterstützung und Beratung von Markus Pajtler und Robert Bohrer waren von unschätzbarem Wert für die Visualisierung dieses Protokolls.

Die Autoren stellen fest, dass Tierversuche in Übereinstimmung mit der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie (86/609/EWG) durchgeführt wurden, nach den Richtlinien der NIH zur Pflege und Verwendung von Tieren für experimentelle Verfahren und den Regularien der Institutional Tiere gesetzt Pflege und Nutzung Committee (IACUC) an der Universität Duisburg-Essen (Deutschland). Teil 1: Einrichten (nicht auf Video gezeigt) Vorbereitung von Materialien und Lösungen (vor der Einnahme der Eier aus dem Inkubator) <ul><li> Eier haben, um in einem befeuchteten Inkubator für 11 Tage bei 37 ° C (100 ° F). </li><li> 70% Ethanol-Spray, saubere Platten, präzise sauberen Pinzette, 4 ° C (40 ° F) kalte sterile DMEM auf Eis und 60 ml sterilen Spritzen </li><li> 50 ml Sterile Corning Rohre müssen mit 4 halbgefüllten ° C kalten DMEM der mazeriert Embryonen bei einem Verhältnis von 1:1 (mazeriert Masse: DMEM) mischen. Sobald die Eier außerhalb des Inkubators Dissektion der Hühnerembryonen ergriffen hat, um gestartet werden. </li><li> Sterilisieren Dissektion Werkzeuge im Autoklaven oder am Tag der Dissektion, tauchen die Werkzeuge in 70% Ethanol für 20 Minuten. </li></ul> Teil 2: Präparation der Hühnerembryonen (gezeigt auf Video) <ol><li> Wet den bebrüteten Eiern mit 70% Ethanol-Spray für mindestens 30 Sekunden und trocknen Sie sie sorgfältig mit einem sauberen weichen Papiertüchern zwar nicht Schütteln der Eier nicht übermäßig. Hinweis: Wir empfehlen nicht sezieren mehr als 60 Hühnerembryonen gleichzeitig. </li><li> Öffnen Sie die Eier vorsichtig von schneidigen gegen eine scharfe Kante und nehmen Sie den Embryo mit Vorsicht nicht die Zerstörung der Dottersack oder der Hühnerembryo sich. </li><li> Suchen Sie nach dem Beginn der Nabelschnur schnell und öffnen Sie die klare Verpackung ohne Zerstörung der Dottersack oder kleinen Gefäßen. Dann sezieren die Nabelschnur mit präzisen sauberen Pinzette. </li><li> Nehmen Sie den Embryo aus dem Dottersack. Hinweis: Die Embryonen sollten schnell enthauptet werden (nicht im Video gezeigt). </li><li> Sammeln Sie die Embryonen in Minimal Essential Medium bei 4 ° C. </li></ol> Teil 3: Mazeration der Hühnerembryonen <ol><li> Nehmen Sie den Kolben aus einer 60 mL sterile Spritze aufziehen. </li><li> Transfer ca. 10 Embryonen in einer 60 ml Spritze. </li><li> Setzen Sie die Kolben vorsichtig zurück in die Spritze, um nicht zu riskieren mazeriert Material. </li><li> Mazerat durch Herunterdrücken des Kolbens. </li><li> Sammeln Sie die mazeriert Masse in die vorbereitete Corning Rohre mit DMEM bei einem Verhältnis von 1:1 (mazeriert Masse: DMEM) zur Hälfte gefüllt. Mit 10 Embryonen ein Volumen von etwa 25 mL hergestellt wird. </li><li> Legen Sie die Mischung auf einem Schüttler für 45 min bei 4 ° C. </li></ol> Teil 4: Zentrifugation der Hühnerembryo - DMEM Suspension <ol><li> Übertragen Sie die Hühnerembryo - DMEM Suspension in die Zentrifugenröhrchen. </li><li> Add sterile Hyaluronidase in einer Konzentration von 1 mg pro 25 mg des Embryos. </li><li> Tare die Zentrifugenröhrchen sehr genau. Hinweis: Dieser Schritt sollte mit Vorsicht durchgeführt werden, wie Zentrifugation bei sehr hohen g-force und Schäden materieller oder Zentrifuge kann auftreten, wenn mit unausgeglichenen Rohren ausgeführt wird. Mit einer hohen Genauigkeit Waage nach zu den drei Nachkommastellen für alle Röhren durch eine Anpassung der fehlende Betrag mit DMEM empfangen werden soll. </li><li> Reduzieren Sie die Temperatur der Zentrifuge auf 4 ° C. Hinweis: Auch die Zentrifugation Rotor sollte in einer Kühlkammer oder Kühlschrank über Nacht aufbewahrt werden. </li><li> Centrifuge 6 Stunden mindestens für 180.000 xgx h. Hinweis: Für bessere Ergebnisse in Bezug auf die Trennung der einzelnen Phasen zu verwenden 266,000 xgx h. Wenn möglich, verwenden Sie das Vakuum Anpassung. </li></ol> Teil 5: Filtration des Hühnerembryo-Extrakt Nach der Zentrifugation können drei Phasen zu beachten: Die obere schmuddeligen flüssigen Phase mit Fett-Fragmente, die klare flüssige Phase in der Mitte und das Pellet am Boden der Zentrifugenröhrchen. Hinweis: Schütteln oder rege Bewegung der zentrifugierten Mischung muss strikt zu vermeiden, da dies das Ergebnis der Zentrifugationsschritt durch den Verlust des klaren zentralen flüssigen Phase zu zerstören. Hinweis: Alle folgenden Schritte wurden unter sterilen Bedingungen mit einem laminaren Luftstrom Bank durchgeführt werden: <ol><li> Pipette die klare flüssige Phase in ein Filtersystem mit Poren von 0,45 um. Dann auf dem angeschlossenen Vakuumpumpe einschalten. Hinweis: Berühren Sie nicht die Pellet am Boden. Dies würde zu einer Verunreinigung des Extraktes und ein Verstopfen des Filters Systems führen. </li><li> Übertragen Sie die Pre-Extrakt in einen Filter mit Poren von 0,22 um und schalten Sie die angeschlossenen Vakuumpumpe wieder. </li><li> Aliquot der erzielten Hühnerembryo-Extraktin sterile 15 mL Corning Röhren. </li><li> Schnell speichern Sie die Aliquots bei -80 ° C (-62 ° F). Hinweis: Die CEE dauern bis zu zwei Jahren, wenn bei -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+reveals+multipotency+of+some+avian+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells.</a> Nature. 335, 161-164 (1988).</li>
<li>Stemple, D. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+stem+cell+for+neurons+and+glia+from+the+mammalian+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest.</a> Cell. 71, 973-985 (1992).</li>
<li>Rao, M. S., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+controlled+in+vitro+differentiation+of+murine+multipotent+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells.</a> J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).</li>
<li>Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+glial+fate+acquisition+of+neural+crest+cells+are+regulated+by+an+interplay+between+the+transcription+factor+Sox10+and+extrinsic+combinatorial+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling.</a> Cell. 128, 3949-3961 (2001).</li>
<li>Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX10+maintains+multipotency+and+inhibits+neuronal+differentiation+of+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells.</a> Neuron. 38, 17-31 (2003).</li>
<li>Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+determination+and+the+control+of+neuronal+identity+in+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Review+Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest.</a> Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).</li>
<li>Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+signals+and+cell+fate+specification+in+premigratory+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Review+Bioessays%22%5BJournal%5D)">Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest.</a> Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).</li>
<li>Sieber-Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+controlling+lineage+specification+in+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Factors controlling lineage specification in the neural crest.</a> Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).</li>
<li>Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+crest+stem+cells%3A+control+of+neural+crest+cell+fate+and+plasticity+by+endothelin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3.</a> Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).</li>
<li>Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+controlled+differentiation+of+neural+crest+stem+cell+lines+using+conditional+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis.</a> Differentiation. 75, 890-891 (2007).</li>
<li>Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+stem+and+precursor+cells+from+fetal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue.</a> Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).</li>
</ol>

Dieses Protokoll basiert auf Modifikationen der Verfahren, die in den letzten 10,11 beschrieben worden sind, basiert. Zusätzlich zu früheren Veröffentlichungen haben wir hier zeigen die einzelnen unterschiedlichen Schritte des Prozesses mehr ausgeweitet. Dies unterstützt den Experimentator mit den wichtigsten Daten sichern richtige Verfahren und zuverlässige Ergebnisse. Ferner ist, wie die Zerlegung Prozess ist ein wesentlicher Bestandteil der CEE-Extraktion beschreiben wir das Verfahren der Aufnahme der Embr...

<table><tbody><tr><td>11 Tage inkubierte Hühnereier</td><td>Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkoholische Desinfektionsspray</td><td>Sch&amp;#252;lke Mayr GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEMGlutamax</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritze steril (60 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Röhrchen steril (50; 15 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen steril</td><td>Starlab GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase Typ IV-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milipore Stericups steril (0.45; 0.22 &amp;mu;l)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetten steril (25; 10; 5 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge L5-50</td><td>Lauftyp Ti-45</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von hühnerembryo-extrakt für die kultivierung von murine neural crest stem cells

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

Die Neuralleiste ergibt sich aus der Neuro-Ektoderm während der Embryogenese und besteht nur vorübergehend. Frühe Experimente bereits geprüften pluripotenten Vorläuferzellen zu einem integralen Bestandteil der Neuralleiste 1 sein. Phänotypisch sind Neuralleiste Stammzellen (NCSC) durch die simultane Expression p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) und SOX10 während ihrer Wanderung von der Neuralleiste 2,3,4,5 definiert. Diese Vorläuferzellen können in glatten Muskelzellen, chromaffinen Zellen, Neuronen und Gliazellen, sowie Melanozyten, Knorpel und Knochen 6,7,8,9 unterscheiden. Zu kultivieren NCSC in vitro, eine besondere Neuralleiste Stammzellen Medium (NCSCM) ist 10 erforderlich. Der komplexeste Teil des NCSCM ist die Herstellung von Hühnerembryo-Extrakt (CEE) vertreten eine wesentliche Quelle von Wachstumsfaktoren für die NCSC sowie für andere Arten von neuronalen Explantaten. Andere NCSCM Zutaten neben CEE sind im Handel erhältlich. Producing CCE mit Labor-Grundausstattung ist es von großer Bedeutung, um über die schwierigen Details wie die Isolierung, Mazeration, Zentrifugation und Filtration Prozesse kennen. In diesem Protokoll beschreiben wir genauer Techniken, um eine maximale Menge an reinem und hochwertigem CEE produzieren.

Um Neuralleiste Stammzellen (NCSC) in vitro zu kultivieren, ist ein spezielles Medium (NCSCM) erforderlich. Wesentlicher Bestandteil der NCSCM ist Hühnerembryo-Extrakt (CEE). Wir beschreiben hier genaue Techniken, um eine maximale Menge an reinem und hochwertigem CEE, einschließlich Details wie die Isolierung, Mazeration, Zentrifugation und Filtration zu produzieren.

Herstellung von Hühnerembryo-Extrakt für die Kultivierung von Murine Neural Crest Stem Cells

Die Neuralleiste entsteht während der Embryogenese aus dem Neuroektoderm und besteht nur vorübergehend. Frühe Experimente bewiesen bereits die Pluripotenz ...

Hallo, mein Name ist Annaa aus dem Labor von Professor Ika Egar aus der Abteilung für Pädiatrische Onkologie am Universitätskinderklinik Essen, Deutschland. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung von Extrakten von 11 Tage alten pränatalen embryonalen Küken. Stellen Sie DMEM auf Eis, um es auf mindestens vier Grad Celsius abzukühlen.Wir verwenden DMEM-Glutamat von GIBCO, das in sterile Röhrchen vorbereitet wurde, indem diese zur Hälfte befüllt wurden. Mit dem MEM waschen Sie die Eier mit 70 %igem Ethanol, wobei Sie X verwenden, die 11 Tage lang bei 100 Grad Fahrenheit in einem befeuchteten Inkubator inkubiert wurden. Achten Sie darauf, dass das Ethanol mindestens 30 Sekunden lang einwirken kann.Nach dem Auftragen die Eier vorsichtig mit weichem Papierhandtuch trocknen. Eine Kunststoff- oder Glasplatte mit Ethanol reinigen. Die Eier öffnen.Legen Sie das Embryo vorsichtig in die Platte. Beschädigen Sie nicht das EC oder kleine Gefäße. Verwenden Sie scharfe, saubere Präzisionsnadeln, um die Embryonen zu dissezieren.Zuerst suchen Sie erneut nach der Nabelschnur. Achten Sie darauf, den Ductus venosus oder kleine Blutgefäße nicht zu beschädigen, während Sie nach der Nabelschnur suchen. Sobald Sie die Nabelschnur gefunden haben, verfolgen Sie sie bis zu ihrem Ursprung und dissezieren Sie sie.Nachdem die durchsichtige Hülle über dem Embryo geöffnet wurde, den Embryo vorsichtig aus dem EC entnehmen, ohne ihn zu beschädigen. Die Embryonen in sterilem, minimalem essentiellem Medium auf Eis legen. Wir verwenden DMEM-Glutamat von gyp Co. Den Kolben eines sterilen 60-Milliliter-Sirenen entnehmen.Geben Sie jeweils etwa 10 Embryonen in die Spritze. Setzen Sie den Kolben in die Spritze ein. Reifen Sie die Embryonen, indem Sie den Kolben nach unten drücken.Achten Sie darauf, nicht zu viel Druck auszuüben, da sonst das maturierte Material verloren geht. Sammeln Sie die maturierten Embryonen in den vorbereiteten Röhrchen im Verhältnis von eins zu eins Embryonen pro MEM 10 Embryonen. Das sollte ein Volumen von etwa 25 Milliliter ergeben.Schütteln Sie das Gemisch aus Embryonen und EMEM im Verhältnis eins zu eins 45 Minuten bei vier Grad Celsius. Überführen Sie das Gemisch vorsichtig in die Zentrifugenröhrchen. Geben Sie die rile Hyaluronidase Tage hinzu.Wir verwenden R-Hay-Tage aus Boin-Hoden von Sigma. Reiß die Zentrifugenröhrchen mit einer speziellen AC-Genauigkeitswaage auf. Es ist sehr wichtig, auf die drei Stellen nach dem Komma zu achten.Sie müssen gleich sein. Andernfalls besteht die Gefahr von Problemen mit der Zentrifuge aufgrund der hohen Geschwindigkeit, die zum Zentrifugieren der Mischung erforderlich ist. Korrigieren Sie gegebenenfalls Ungleichheiten, indem Sie die fehlende Menge des MEM per Pipette hinzufügen. Der Rotor sollte über Nacht in einem Kühlschrank oder einer Kühlkammer auf vier Grad Celsius heruntergekühlt worden sein.Die Zentrifugenröhrchen müssen sehr fest verschlossen werden. Andernfalls besteht die Gefahr, dass Probleme beim Herausnehmen aus dem Rotor auftreten. Nach der Zentrifugation den Rotor mit den Röhrchen füllen und ihn im Voraus sehr fest verschließen.Kühlen Sie die Zentrifuge auf vier Grad Celsius herunter. Verwenden Sie in jedem Fall ein Vakuum. Warten Sie, bis der Rotor seine Endgeschwindigkeit erreicht hat.Wenn etwas Seltsames passiert, stoppen Sie die Zentrifuge sofort. Drücken Sie die Bremstaste, um die Zentrifugation zu beenden. Dies ist der Fall, nachdem ein TI I 45-Rotor sechs Stunden lang mit einer Geschwindigkeit von 45.000 Umdrehungen pro Minute gelaufen ist.Entnehmen Sie die Röhrchen vorsichtig. Schütteln Sie sie keinesfalls, da dies zu einer Vergrößerung der oberen trüben Flüssigkeitsschicht innerhalb der Röhrchen führen könnte. Achten Sie auf die drei Phasen.Oben befindet sich eine Flüssigkeit mit Fetttröpfchen. In der Mitte befindet sich eine klare Flüssigkeit, und am Boden ist das Pellet sichtbar. Achten Sie darauf, die klare Phase vorsichtig aus der Mitte des Reaktionsgefäßes abzunehmen.Berühren Sie das Pellet auf keinen Fall, da dies zu einer Kontamination des Extrakts sowie zu einer Verstopfung des Filtersystems führen würde. Zunächst filtrieren Sie mit einem 0,45-Mikrometer-Filter, der an eine Vakuumpumpe angeschlossen ist. Im zweiten Schritt filtrieren Sie die gewonnene Flüssigkeit durch einen 0,22-Mikrometer-Filter, der ebenfalls an die Vakuumpumpe angeschlossen ist. Geben Sie den Extrakt anschließend in die Röhrchen. Bewahren Sie die Röhrchen schließlich bei minus 80 Grad Celsius auf.

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Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

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Assay für Neural Induction im Hühnerembryo

Isolierung von embryonalen Neuralleiste vom Neuralrohr erleichtert die Verwendung...

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