Dezellularisierung und Recellularization von Whole Livers

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, maßgeschneiderte Lebertransplantate unter Verwendung einer entzellulierten Lebermatrix herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Spenderleber katheterisiert wird. Anschließend erfolgt die Entzellulierung des Organs durch Perfusion mit einer Reihe von Detergenzlösungen.

Die Revascularisierung der dezellularisierten Lebermatrix wird anschließend durchgeführt, indem adulte primäre Hepatozyten per Perfusion eingeführt werden. Abschließend wird ein in-vitro-Perfusionssystem verwendet, um das zelluläre Lebertransplantat zu kultivieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die hepatische Funktion der verkleinerten Transplantate in vitro durch Messung der Albumin-, Harnstoff- und Gesamtbiliasäuresekretion im Perfusionsmedium zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Verfahren wie der Gerüstherstellung mittels synthetischer Biomaterialien und herkömmlichen Gewebeengineering-Methoden liegt meiner Meinung nach in der Anwesenheit der gewebespezifischen Zusammensetzung der extrazellulären Matrix. Das perfundierte, dezellularisierte Gerüst weist zudem die gewebespezifische Mikroarchitektur, wie beispielsweise die Gefäßstruktur, auf. Die Präsenz der Gefäßstruktur ermöglicht es uns, die Zellen gleichmäßiger wieder in das Gerüst einzubringen.

Es ermöglicht uns außerdem, es gleichmäßig mit Nährstoffen zu perfundieren, um das Zellüberleben zu verbessern. Den Verzögerungsteil des Protokolls wird Nima gemeinsam mit dem Postdoktoranden für poststrukturelle Analysen in unserem Labor demonstrieren. Den Re-Retalisierungsteil wird Gabriel Price demonstrieren, der ebenfalls ein Postdoktorand ist.

Ihr Forschungsschwerpunkt liegt auf der Industrialisierung dieser Transplantate. Um eine perfusionsgestützte Dezellularisierung durchzuführen, beginnen Sie mit der Entnahme einer Rattenleber mittels Kanülierung der Pfortader. Verwenden Sie eine 18-Gauge-Kanüle und lassen Sie die untere und obere Hohlvene offen. Halten Sie das Organ in einer 10 cm großen Petrischale in phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS feucht.

Als Nächstes richten Sie ein Perfusionsystem ein, das aus einem acht Liter fassenden Reservoir, einer peristaltischen Pumpe und einer Blasenfalle besteht. Füllen Sie das Perfusionsystem mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS und lassen Sie es 10 Minuten lang laufen. Danach füllen Sie eine 10 Zentimeter große Petrischale mit PBS und verringern die Flussrate des Puffers auf 1,2 Milliliter pro Minute.

Überführen Sie die gewonnene Leber vorsichtig in die Petrischale mit PBS und lassen Sie sie über Nacht perfundieren. Am nächsten Tag perfundieren Sie die Leber fünf Minuten lang mit 0,01 % Natrium-ESAL-Sulfat oder SDS in destilliertem Wasser.

Danach für eine Stunde wieder auf PBS umschalten. Die SDS- und PBS-Perfusionsschritte insgesamt dreimal wiederholen, wobei die SDS-Perfusionszeit auf 10, 15 und schließlich 20 Minuten erhöht wird. Anschließend die Leber mit der folgenden Serie: 0,01 % SDS für 24 Stunden perfundieren.

0,1 % SDS für 24 Stunden. 0,2 % SDS für drei Stunden, 0,5 % SDS für drei Stunden. Destilliertes Wasser für 15 Minuten, 1 % Triton X 100 in destilliertem Wasser für 30 Minuten, wodurch alle gebundenen Nukleinsäuren entfernt werden.

Und schließlich PBS für zwei Stunden, um die entzelluläre Lebermatrix oder DLM nach Abschluss der Perfusion gegebenenfalls zu waschen; reseziere alle Lappen bis auf den Mittellappen. Bewahren Sie die DLM in einer sauberen und verschlossenen Petrischale in PBS bei vier Grad Celsius auf, bis sie verwendet werden kann, um die DLM zu sterilisieren. Spülen Sie sie mit steriler PBS, die 0,1 % Peressigsäure und 4 % Ethanol enthält, und inkubieren Sie sie drei Stunden bei vier Grad Celsius.

Als Nächstes waschen Sie das DLM zweimal mit steriler PBS, danach mit PBS, die 2 % Penicillin-Streptomycin, 10 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin und 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Amphotericin B enthält. Lagern Sie die dezellularisierte Leber in derselben Lösung bei vier Grad Celsius, bis sie für Zellbesiedelungsexperimente verwendet wird.

Zweitens, um eine dezellularisierte Lebermatrix unter einer Gewebekulturhaube zu zellularisieren. Beginnen Sie mit einem Perfusionssystem, das dem zur Dezellularisierung der Leber verwendeten ähnelt. Füllen Sie das Perfusionssystem mit 200 Milliliter Kulturmedium, wie z. B. DMEM mit hohem Glucosespiegel, 10 % fetalem Rinderserum, 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und 100 Mikrogramm pro Milliliter Streptomycin.

Platzieren Sie das DLM in die Perfusionskammer und verbinden Sie es über die Pfortaderkanüle mit dem Perfusionsystem, während die Pumpe mit fünf Millilitern pro Minute läuft. Um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, lassen Sie das Medium 30 Minuten lang das DLM durchströmen. Stoppen Sie anschließend den Fluss im Perfusionsystem und injizieren Sie langsam 50 Millionen Hepatozyten, die aus einer adulten Ratte isoliert wurden, über die Entlüftungsschleuse in das Perfusionsystem.

Starten Sie den Fluss erneut mit 10 Milliliter pro Minute und zirkulieren Sie das Medium 10 Minuten lang um. Stoppen Sie erneut den Mediumfluss. Injizieren Sie zusätzliche 50 Millionen Hepatozyten.

Starten Sie dann den Fluss erneut mit 10 Milliliter pro Minute. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis insgesamt 200 Millionen Hepatozyten in das DLM eingeführt wurden. Sobald alle Zellen in das DLM injiziert wurden, sammeln Sie den Ausfluss in 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 800 U/min.

Entfernen Sie die Überstände und vereinigen Sie die Pellets in einem einzigen Reaktionsgefäß. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen und ihre Vitalität mittels Trypanblau-Ausschluss. Um die Ansiedlungseffizienz für die Kultur zu ermitteln.

Eine zelluläre Lebertransplantation vornehmen. Richten Sie ein steriles Perfusionsystem ein, das einen Oxygenator enthält. Füllen Sie das Perfusionsystem mit 50 Milliliter Kulturmedium, wie beispielsweise Williams E mit 5 % PBS und 0,5 Einheiten pro Milliliter Insulin.

20 Nanogramm pro Milliliter EGF, 14 Nanogramm pro Milliliter Glucagon, 7,5 Mikrogramm pro Milliliter Hydrocortison, 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und 100 Mikrogramm pro Milliliter Streptomycin. Platzieren Sie das zellbesiedelte Lebertransplantat in die Perfusionskammer und verbinden Sie es über die Kanüle der Vena portae mit dem Perfusionsystem, während die Pumpe mit fünf Millilitern pro Minute läuft.

Um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, schließen Sie die Perfusionskammer aseptisch und versiegeln Sie sie fest, um Leckagen während der Kultivierung zu verhindern. Inkubieren Sie das Perfusionsystem bei 37 Grad Celsius mit 10 % Kohlendioxid und erhöhen Sie die Perfusionsflussrate auf 15 Milliliter pro Minute. Schließen Sie den Oxygenator an einen Gasgemischtank mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid an und stellen Sie die Gasflussrate auf 0,5 Liter pro Minute ein.

Dadurch sollte ein Sauerstoffpartialdruck von etwa 400 Millimeter Quecksilber erreicht werden. Führen Sie die Kultur bis zu 10 Tage lang mit täglichen Mediumwechseln fort. Entnehmen Sie täglich Proben des Mediums zur Bestimmung der Albumin-, Harnstoff- und Gesamtbiliasäuresekretion, um die Leberfunktion des Transplantats am Ende der Kulturperiode zu überwachen.

Entnehmen Sie eine Probe des zellulären Lebertransplantats für die molekulare und histologische Analyse. Die vollständige Dekellularisierung einer Rattenleber dauert etwa 72 Stunden unter Verwendung des beschriebenen Protokolls.

Die resultierende Matrix behält 100 % des faserförmigen Kollagens, 50 % der glykoaminoglykane und lediglich 5 % der DNA der nativen Leber bei. Die vaskuläre Struktur der Matrix bleibt erhalten, wie durch Gussverfahren und Analyse mittels Rasterelektronenmikroskopie belegt ist. Das Vorhandensein der vaskulären Mikroarchitektur innerhalb der DLM erleichtert deren Besiedelung mit Zellen mit einer Effizienz von 96 % sowie die anschließende Perfusion.

Für die In-vitro-Kultur kann das rekonstruierte Lebertransplantat bis zu 10 Tage lang in vitro kultiviert werden und zeigt dabei korrekte Leberfunktionen, die durch die Sekretion von Albumin, Harnstoff und gesamten Gallensäuren bestätigt wurden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine gesamte Leber dezellularisiert und rekellularisiert.