Messung der spontanen Phageninduktion in lysogenen Bakterien über die Zeit

Nehmen Sie eine Übernachtkultur eines lysogenen Bakteriums, bei dem die meisten Zellen inaktive, in das Genom integrierte Phagen-DNA enthalten.

Inokulieren Sie es in frisches Medium und inkubieren Sie es.

Einige Bakterien durchlaufen eine spontane Induktion und treten in den lytischen Zyklus ein, bei dem die Phagen-DNA ausgeschnitten, repliziert und virale Proteine produziert werden.

Neu zusammengesetzte infektiöse Phagen werden durch Zelllyse freigesetzt.

Kulturproben in definierten Zeitabständen sammeln.

Um lebensfähige nicht induzierte Lysogene zu zählen, auftragen Sie serielle Verdünnungen jeder Probe auf eine Agarplatte und inkubieren Sie diese.

Zählen Sie die Kolonien, um die koloniebildenden Einheiten (CFUs) zu berechnen.

Um infektiöse Phagen zu zählen, werden die gleichen Verdünnungen auf eine Antibiotikagarplatte aufgetragen, die zuvor mit antibiotikaresistenten Indikatorwirten besiedelt wurde. Da die Lysogene antibiotikasensitiv sind, können nur resistente Wirtszellen wachsen.

Phagen infizieren und lysieren Zellen und bilden klare Plaques.

Zählen Sie die Plaques, um die Plaque-bildenden Einheiten (PFUs) zu berechnen. Niedrigere PFUs weisen auf weniger spontane Induktionsereignisse hin.

Tragen Sie die CFUs und PFUs über die Zeit auf. Während der frühen exponentiellen Phase des bakteriellen Wachstums sind die PFUs im Verhältnis zu den CFUs am niedrigsten, was auf eine minimale spontane Phageninduktion hinweist.

Um zu beginnen, stellen Sie frische Kulturen des Lysogens und des Indikatorwirts her, indem Sie die Übernachtkulturen im Verhältnis 1:100 in 100 mL LB ansäen. Inkubieren Sie bei 37 °C unter Schütteln mit 180 rpm.

Um das Wachstum des Lysogens zu überwachen, sammeln Sie ab dem Zeitpunkt der Inokulation alle Stunde eine Probe von einem Milliliter über einen Zeitraum von acht Stunden. Verdünnen Sie die Kultur seriell, indem Sie 100 Mikroliter in 900 Mikroliter LB-Medium geben. Vortexen Sie gründlich mit maximaler Geschwindigkeit und führen Sie die Verdünnungsreihe von 10⁻¹ bis 10⁻⁹ fort.

Tragen Sie 10 µL der erforderlichen Verdünnung auf eine LB-Agar-Platte auf. Lassen Sie die Probe trocknen und inkubieren Sie sie bei 30 °C für 18 bis 24 Stunden. Zählen Sie nach der Inkubation die Anzahl der Kolonien und berechnen Sie die Anzahl der lebensfähigen Bakterienzellen mithilfe der angegebenen Formel.

Als Nächstes werden zur Zählung der infektiösen Phagenpartikel in der zeitlichen Probe 100 µL logarithmisch wachsender, rifampicinresistenter Indikatorwirtszellen zusammen mit Rifampicin dem geschmolzenen Übertragsagar zugegeben. Anschließend werden 10 µL der seriell verdünnten Lysogenkultur auf die beimpfte Übertragsagarschicht aufgetragen, trocknen gelassen und bei 37 °C für 18 bis 24 Stunden inkubiert.

Nach der Inkubation die Anzahl der Plaques zählen und die infektiösen Phagenteilchen mit der angegebenen Formel berechnen.