Dissection und Färbung von Drosophila Larven Ovarien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, isolierte Eierstöcke von Drosophila-Larven im späten dritten Stadium mit einem konfokalen Mikroskop sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst weibliche Larven aus einer synchronisierten Population ausgewählt werden. Der zweite Schritt des Eingriffs besteht darin, einen intakten Fettkörper zu präparieren, ihn vom Darm und der Nagelhaut zu trennen und auf Eis zu legen.

Der dritte Schritt des Verfahrens ist das Fixieren von Flecken und Waschfettkörper mit eingebetteten Eierstöcken. Der letzte Schritt des Eingriffs ist die Trennung der Eierstöcke vom Fettkörper während der Montage. Letztlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine zellspezifische Färbung durch Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die feinen Dissektionen und das Einbetten viel Übung erfordern. Fünf Tage vor der Sektion Hefe in ein frisches 25-Millimeter-Fläschchen mit Fliegenfutter geben. Legen Sie sieben bis 16 verpaarte weibliche Fruchtfliegen in das Fläschchen.

Lassen Sie die Weibchen zwei bis vier Stunden lang Eier legen oder bis etwa 30 Eier pro Fläschchen vorhanden sind. Inkubieren Sie das Ei mit den Fläschchen bei 25 Grad Celsius und einer Luftfeuchtigkeit von mindestens 70 %. Nach fünf Tagen haben die Larven das späte dritte Stadium erreicht.

Füllen Sie eine Sezierschale mit neun Gläsern aus Glas mit Ringer-Medium. Bereiten Sie als Nächstes speziell angefertigte Formen vor, die mit einem Nylonnetz in der Petrischale ausgestattet sind, die Ringer enthalten. Mittel. Stellen Sie das Gericht mit einer feinen Pinzette auf Eis.

Pflücken Sie 10 bis 15 Larven aus den Wänden des Fläschchens und legen Sie sie in die Präparierschale. Stellen Sie die Präparierschale unter ein Mikroskop, um die Frau auszuwählen und zu sezieren. Weibliche Larven können von männlichen Larven anhand ihrer Stacheln unterschieden werden.

Männliche Hoden sind leicht als große, klare Ovale zu erkennen, die in das hintere Drittel des Fettkörpers eingebettet sind. Weibliche Eierstöcke, die sich an der gleichen Stelle des Fettkörpers befinden, sind als viel kleinere, klare runde Kugeln zu erkennen. Wenn die Eierstöcke nicht sichtbar sind, erkennt man die weiblichen Larven durch das Fehlen von Hoden.

Bringen Sie eine weibliche Larve in einen sauberen Brunnen Um mit der Dissektion zu beginnen, halten Sie die Larven mit einer Pinzette direkt hinter dem Gehirn fest. Entfernen Sie den Kopf mit einer zweiten Pinzette. Platzieren Sie den restlichen hinteren Teil der Larven auf der dorsalen Seite mit der Luftröhre nach unten.

Halten Sie die Larven mit einer Pinzette an den hinteren Kugeln fest. Schieben Sie dann die Pinzette gleichzeitig langsam nach innen, schieben Sie mit der anderen Pinzette die Nagelhaut nach hinten, bis etwa die Hälfte des Larvenfettkörpers fest herauskommt. Halten Sie das hintere Ende der Nagelhaut mit einer Pinzette fest und halten Sie den Rest der Nagelhaut locker mit dem anderen Paar sanft und ziehen Sie das hintere Ende vorsichtig und langsam weg, so dass die Nagelhaut und die daran befestigten Eingeweide durch den Spalt gleiten.

Trennen Sie am Ende dieses Prozesses den Darm und die Kutikula vom vorderen Teil des Fettkörpers. Befeuchten Sie eine Weidepipette gründlich mit Ringers Medium aus einer Vertiefung, die die präparierten Larven enthält. Mit der Weidepipette den Fettkörper in das eiskalte Klingelmedium im Zellsieb überführen.

Der nächste Schritt besteht darin, das Präparat bei 5% Formaldehyd in Ringer's Medium zu fixieren und zu färben und den Fettkörper 20 Minuten lang unter leichtem Rühren auf einem Orbitalschüttler zu inkubieren. Sofern nicht anders angegeben, werden alle Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt. Waschen Sie den Fettkörper dreimal mit 1% PBT, das erste Mal für fünf Minuten, das zweite Mal für 10 Minuten und das dritte Mal für 45 Minuten.

Eine Stunde lang mit 0,3 % PBTB unter leichtem Rühren blockieren. Der Agitation folgend. Den Fettkörper in ein 0,2 Milliliter Röhrchen geben.

Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit und fügen Sie den gewünschten ersten Antikörper in 0,3 % PBTB verdünnt hinzu und inkubieren Sie ihn über Nacht bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren auf einer Walze. Am nächsten Tag überträgst du den Fettkörper wieder in die Form. Waschen Sie anschließend den Fettkörper dreimal für jeweils 30 Minuten mit 0,3 % PBTB unter sanftem Rühren.

Dann eine Stunde lang mit 0,3 % PBTB, ergänzt mit 5 % normalem Eselsserum, blockieren. Den Fettkörper unter leichtem Rühren in ein 0,2-Milliliter-Röhrchen überführen und einen geeigneten sekundären fluoreszierenden Antikörper in der Blockierungslösung verdünnen. Legen Sie das Röhrchen in ein Gestell und stellen Sie das Gestell auf eine Walze und inkubieren Sie es zwei Stunden lang unter leichtem Rühren.

Wenn der Antikörper fluoreszierend ist, inkubieren Sie ab diesem Zeitpunkt im Dunkeln. Übertragen Sie nach zwei Stunden den Fettkörper zurück in die Form und waschen Sie ihn dreimal für jeweils 30 Minuten mit 0,3 % PBT unter leichtem Rühren, um die Eierstöcke zu präparieren und zu befestigen. Übertragen Sie den Fettkörper sehr vorsichtig in ein sauberes Einor-Röhrchen.

Entfernen Sie alle Flüssigkeiten mit einer Weidepipette und decken Sie sie sofort mit Vector Shield Eindeckmedien ab. Schneiden Sie das Ende einer Pipettenspitze ab und saugen Sie den Fettkörper vorsichtig mit minimalem Volumen an Eindeckmedium auf. Übertragen Sie den Fettkörper auf einen Objektträger.

Der nächste Schritt besteht darin, mit zwei vernickelten Stifthaltern Stifte mit einem Durchmesser von 0,1 Millimetern den Fettkörper unter einem Stereomikroskop auszubreiten und die Eierstöcke zu lokalisieren, indem man in das hintere Drittel des Fettkörpers schaut. Der Fettkörper hat eine Blütenform, wo er die Eierstöcke umgibt. Seziere die Blüten vom Rest des Fettkörpers aus und entsorge die Leiter.

Entferne den Fettkörper, der die Keimdrüse umgibt, indem du die beiden Stifte vorsichtig um sie herum kreuzt und sie vom Eierstock wegziehst. Platzieren Sie die isolierte Gonade auf dem Objektträger weg von den Fettkörperresten und entsorgen Sie die Fettkörperreste. Decken Sie die Folie mit der Abdeckung ab.

Gleiten lassen und mit Nagellack versiegeln. Visualisieren Sie den Eierstock direkt mit einem Konfokalmikroskop. Diese Zahlen stammen von zwei bis drei Eierstöcken, die mit unterschiedlichen Kombinationen von Antikörpern gefärbt wurden.

Im ersten Bild umreißt ein Antikörper die somatischen Zellen und Färbungen. Die durch die Pfeile angezeigten Fuso Fuso sind intrazelluläre Organellen. Innerhalb der primordialen Keimzellen, grün dargestellt, sind das terminale Filament und die Kappenzellen zu sehen, die zusammen die somatischen Zellen der Nische bilden, die Pfeilspitze zeigt auf die Kappenzellen.

Diese Abbildung zeigt die vermischten Zellen in Magenta, die direkt mit den blau dargestellten Keimzellen in Kontakt kommen. Die somatischen Zellen des Eierstocks sind nach seiner Entwicklung grün umrandet. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Stammzellbiologie den Weg, um die Nischenbildung und Stammzelletablierung im Tezo-Eierstock zu erforschen.