Name: Dissection und Färbung von Drosophila Larven Ovarien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Lernen Sie die Präparation und Färbung von Drosophila-Larvenovarien für die Entwicklungsbiologie. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Keimbahnstammzellen und deren Nischen mittels konfokaler Mikroskopie.

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IM wird durch die Marie Curie Reintegration zu gewähren unterstützt. Diese Arbeit wurde von der Israel Science Fund Stipendium nicht unterstützt. 1146-1108, von der Helen und Martin Kimmel Institut für Stammzellforschung am Weizmann Institute of Science und der Leir Charitable Foundation.

1. Eiablage <ol><li> Fünf Tage vor ihrer Zerlegung: allow begatteten Weibchen die Eier für 2-4 Stunden auf frische Lebensmittel mit Hefe ergänzt legen. Um synchronisiert und gut entwickelte Larven, ist es wichtig, nicht zu überfüllt sind kultiviert (ca. 30 Eier / 25mm Durchstechflasche). Typischerweise werden 7-16 Weibchen pro Fläschchen verwendet, je nachdem, wie gut sie lag. </li></ol> 2. Die Auswahl Larven <ol><li> Bereiten Sie eine 9-sowie Glas Sezieren Schale mit Ringer-Medium (128mm NaCl, 2 mM KCl, 1,8 CaCl 2, 4 mm MgCl 2, 35,5 mm Saccharose, 5 mM Hepes pH 6,9) gefüllt. </li><li> Bereiten Zelle Siebe in einem Sechs-Well-Platte mit Ringer-Medium und stellen Sie ihn auf Eis. Alternativ verwenden wir speziell angefertigte Formen mit einer Nylon-Mesh ausgestattet. </li><li> Pick-timed Larven von Fläschchen Wände mit feinen biologischen Pinzetten (Pinzette) und legen Sie sie in die Ringer-mit Sezieren Gericht. </li><li> Übertragen einer weiblichen Larve, um eine saubere gut. Wir unterscheiden Weibchen von Männchen durch ihre Keimdrüsen. Männliche Hoden sind einfach so groß klar Ovale in das hintere Drittel des Fettes eingebettet identifiziert. Weiblichen Eierstöcken, gleichzeitig ein Teil des Fettes Körpers befindet, kann als eine viel kleinere, klar, rund Sphären identifiziert werden. </li></ol> 3. Dissection der Larve <ol><li> Halten Sie die Larve sich unmittelbar hinter dem Gehirn mit einer Pinzette und entfernen Sie den Kopf mit einer zweiten Pinzette. </li><li> Die restlichen hinteren Teil auf der Rückenseite, mit der Luftröhre nach unten. </li><li> Halten Sie die Larve durch die hinteren Luftlöcher mit einer Pinzette und schieben Sie ihn nach innen langsam, während das andere Paar gleitet die Nagelhaut hinten, bis etwa die Hälfte der Larven fetten Körper entsteht. </li><li> Halten Sie das hintere Ende und mit der anderen Pinzette zu locker halten die Schuppenschicht. Langsam und vorsichtig wegziehen hinteren Ende, so dass die Kutikula und der beigefügten Darm schieben durch den Spalt. Am Ende dieses Prozesses sollten die fetten Körper vollständig aus dem Darm und die Kutikula getrennt werden. Trennen Sie den Darm aus dem vorderen Teil der fetten Körper. Um Fleckenbildung und Montage zu erleichtern, ist es wichtig, dass die fetten Körper intakt bleibt. </li><li> Wet einer Weide Pipette gründlich mit Ringer-Medium, vorzugsweise aus einem Brunnen mit seziert Larven. Dies hilft Mantel der Pipette und verhindert, dass die fetten Körper hängen bleibt. Verwenden Sie die Weide Pipette auf die fetten Körper in die eiskalte Ringerlösung Medium in die Zelle Sieb übertragen. </li></ol> 4. Fixierung und Färbung Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, mit Ausnahme der Inkubation mit dem ersten Antikörper, bei 4 ° C. <ol><li> Inkubieren Sie die fetten Körper in 5% Formaldehyd in Ringer-Medium. für 20 Minuten unter leichtem Schütteln. </li><li> Wash für 5 Minuten mit 1% PBT (1% Triton x-100 in PBS). Wiederholen Sie diesen Schritt für 10 Minuten und ein drittes Mal für 45 Minuten. 1% Triton X-100 ist erforderlich, um die Larven Eierstock perforieren und damit ausreichend Antikörper gegen sie zu durchdringen. </li><li> Block mit 0,3% PBTB (0,3% Triton x-100 und 1% BSA in PBS) für 1 Stunde unter leichtem Schütteln </li><li> Inkubieren mit dem gewünschten 1 st Antikörper in 0,3% PBTB über Nacht bei 4 ° C verdünnt unter leichtem Schütteln. Dieser Schritt ist in der Regel in 0,2 ml Röhrchen auf einem Rollenprüfstand durchgeführt. </li><li> Transfer fetten Körper zurück zu Zelle Siebe. </li><li> 3 x waschen, jeweils 30 Minuten, mit 0,3% PBTB unter leichtem Schütteln. </li><li> Block mit 0,3% PBTB mit 5% normalem Esel-Serum für 1 Stunde unter leichtem Schütteln ergänzt. </li><li> Inkubieren mit einem geeigneten sekundären Antikörper verdünnt (nach Herstellerangaben) in Blocking-Lösung (0,3% PBTB mit 5% normalem Esel-Serum in 0,3% PBT ergänzt) für 2 Stunden unter leichtem Schütteln. Wenn der Antikörper ist fluoreszierend, in der Dunkelheit ab diesem Zeitpunkt zu inkubieren. Dieser Schritt ist in der Regel in 0,2 ml Röhrchen auf einem Rollenprüfstand durchgeführt. </li><li> Wash 3 mal für jeweils 30 Minuten mit 0,3% PBT unter leichtem Schütteln. </li></ol> 5. Montage <ol><li> Übertragen Sie die fetten Körper, um eine saubere Eppendorf-Röhrchen. Sehr vorsichtig alle Flüssigkeiten entfernt und sofort mit Vectashield Montage Medien abdecken. Wir verwenden Vectashield routinemäßig, da sie nicht verhärten, während die Eierstöcke aus dem fetten Körper getrennt sind. Die Proben können bei der Montage Medien bei 4 ° C gelagert werden bis zu einer Woche. </li><li> Schneiden Sie das Ende einer Pipettenspitze und verwenden Sie es sorgfältig zu überweisen Sie den fetten Körper mit minimalem Volumen von Montage-Medien (etwa 30 ul für einen 30mm Deckglas) auf einen Objektträger. </li><li> Verwenden Sie zwei vernickelten Pin-Halter, hält 0,1 mm Durchmesser Stifte, um sich auszubreiten die fetten Körper. Die Eierstöcke sind an der hinteren Drittel der fetten Körper entfernt. Die fetten Körper, die sie umgibt, ist in der Regel wie eine "Blume" geprägt. Dies hilft bei der Identifizierung der Lage der Eierstöcke. Sezieren die "Blumen" aus dem Rest der fetten Körper und entsorgen Sie diese. </li><li> Entfernen Sie die fetten Körper Surrounding der Gonade durch Kreuzung der beiden Stifte vorsichtig um ihn herum. Legen Sie die isoliert Gonade auf der Folie von der fetten Körper Rückstand. </li><li> Abdeckung mit einem Deckglas und Dichtung mit Nagellack. </li><li> Visualisieren Sie direkt mit einem konfokalen Mikroskop. Die Proben können bei 4 ° C gelagert werden bis zu drei Wochen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Wir haben die oben genannten Protokoll verwendet, um die Einrichtung mehrerer Zelllinien im Rahmen der somatischen Eierstock, darunter GSCS und ihre somatischen Nischen folgen. Zu diesem Zweck verwenden wir spezifische Antikörper und Marker, um zwischen den verschiedenen Zelltypen in den Entwicklungsländern Gonade zu unterscheiden. Hier zeigen wir ein Beispiel von zwei LL3 Eierstöcke mit verschiedenen Kombinationen von Antikörpern gefärbt. Abbildung 1A Highlights Terminal Filament-und cap-Zellen (grün), die zusammen die somatischen Zellen der Nische. Abbildung 1B zeigt die vermischten Zellen (ICs, magenta), die direkt an Keimzellen (blau). <img src="/files/ftp_upload/2537/2537fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. LL3 Eierstöcke. (A) monoklonale Antikörper 1B1 (magenta) skizziert somatischen Zellen und färbt die fusome, einem intrazellulären Organellen innerhalb PGCs (Pfeile). Die Enhancer-trap hh-lacZ (anti β-Galactosidase, Grün) befindet sich im Terminal Filamente ausgedrückt. An der Basis des Filaments somatischen Zellen Kappe (Pfeilspitzen) beobachtet werden können. (B) 1B1-Antikörper (grün) beschreibt alle somatischen Zellen in den Eierstöcken. Anti-Vasa (blau) Etiketten aller PGCs. PGCs direkt an den vermischten Zellen (ICs, Anti-Stau, magenta). Bar (für A und B) ist 20 um.

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<li>Gilboa, L., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+primordial+germ+cell+differentiation+parallels+germ+line+stem+cell+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Repression of primordial germ cell differentiation parallels germ line stem cell maintenance.</a> Curr Biol. 14, 981-986 (2004).</li>
<li>Gilboa, L., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soma-germline+interactions+coordinate+homeostasis+and+growth+in+the+Drosophila+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Soma-germline interactions coordinate homeostasis and growth in the Drosophila gonad.</a> Nature. 443, 97-100 (2006).</li>
</ol>

Dieses Video zeigt eine Isolation und Färbeprotokoll des späten dritten Larvenstadium Larven Eierstöcke. Um dieses Protokoll regelmäßig und zuverlässig, sollten ihr Augenmerk auf die folgenden Punkte beachtet werden: <ol><li> Für synchronisiert und gut entwickelte Larven, muss über Verdrängung vermieden werden. </li><li> Zur Vermeidung von Verlust der kleine, durchsichtige Eierstöcke, stellen Sie sicher, sezieren die fetten Körper intakt. Dies wird auch bei der Lokalisierung der Eierstöcke bei der Montage der Bühne ...

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>JT Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kcl</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>JT Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin Bovine Fraction V</td><td>MP Biomedicals</td><td>160069</td><td></td></tr><tr><td>Dumont-Biologiepinzette 5 dumstar poliert</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Nickelbeschichteter Nadelhalter</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl-Minutenstifte, 0,1 mm Durchmesser, 10 mm lang</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>9-Loch-Platten 85×100 mm, 22 mm Außendurchmesser × 7 mm Tiefe</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Stereo-Mikroskop MZ 16,5 mit Standard-Durchlichtbasis TL ST</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-Loch-Platten</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Menzel-Glaser</td><td>798</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Corning</td><td>2940-223</td><td></td></tr><tr><td>Einbettmedium</td><td>Vectashield</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Zellfilter</td><td>Falcon BD</td><td>FAL352350</td><td></td></tr><tr><td>1B1-Antikörper</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Traffic Jam</td><td>Laboratorium von Dr. Dorothea Godt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Vasa</td><td>Laboratorium von Dr. Ruth Lehmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-&amp;#946;-Galactosidase</td><td>Cappel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sekundäre Antikörper</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection und färbung von drosophila larven ovarien

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Viele Organe sind abhängig von Stammzellen für ihre Entwicklung während der Embryogenese und zur Wartung oder Reparatur im Erwachsenenalter. Zu verstehen, wie Stammzellen zu bilden, und wie sie mit ihrer Umwelt interagieren, ist daher von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Entwicklung, Homöostase und Krankheit. Der Eierstock der Fruchtfliege Drosophila melanogaster als ein einflussreiches Modell für das Zusammenwirken von Keimbahn-Stammzellen (GSCS) mit ihren somatischen Stützzellen (Nischen-) 1, 2 serviert. Die bekannte Position der Nische und die GSCS, gekoppelt mit der Fähigkeit, genetisch zu manipulieren, ist Forschern erlaubt, eine Vielzahl von Wechselwirkungen zwischen Stammzellen und ihren Nischen 3-12 aufzuklären. Trotz der Fülle von Informationen über Mechanismen, die GSC Wartung und Differenzierung, ist relativ wenig darüber, wie GSCS und ihre somatischen Nischen bilden während der Entwicklung bekannt. Etwa 18 somatische Nischen, deren zelluläre Komponenten umfassen Terminal Filament-und cap-Zellen (Abbildung 1) bilden im dritten Larvenstadium 13-17. GSCS stammen aus primordialen Keimzellen (PGC). PGCs wuchern in den frühen Larvenstadien, aber nach der Bildung der Nische eine Untergruppe von PGCs wird GSCS 7, 16, 18, ​​19. Zusammen bilden die somatischen Zellen Nische und die GSCS eine funktionelle Einheit, die Eier produziert während der gesamten Lebensdauer des Organismus. Viele Fragen bezüglich der Bildung der GSC-Einheit bleiben unbeantwortet. Prozesse wie die Koordinierung zwischen Vorläuferzellen für Nischen und Stammzell-Vorstufen, oder die Erzeugung der Asymmetrie innerhalb PGCs, wie sie GSCS werden, lässt sich am besten in der Larve untersucht werden. Allerdings ist eine methodische Untersuchung der Larven Eierstock Entwicklung körperlich anspruchsvoll. Erstens sind Larven Eierstöcke klein. Selbst am späten Larvenstadien sind sie nur 100 um across. Darüber hinaus werden die Eierstöcke transparent und werden in einem weißen Fett eingebettet. Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung von Eierstöcken von späten dritten Larvenstadium (LL3) Drosophila-Larven, durch Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern. Wir bieten einige technische Lösungen für Probleme wie das Auffinden der Eierstöcke, Färbung und Waschen Gewebe, die nicht untergehen, und sicherzustellen, dass Antikörper in das Gewebe eindringen. Dieses Protokoll kann zu früheren Larvenstadien und Larven Hoden als auch angewandt werden.

Wie Nischen und Stammzellen während der Entwicklung bilden eine wichtige Frage mit praktischen Auswirkungen. Im<em&gt; Drosophila</em&gt; Eierstock Keimbahn-Stammzellen und ihre somatischen Nischen bilden sich während Larvalentwicklung. Dieses Video zeigt, wie zu sezieren, Flecken und montieren weiblichen Keimdrüsen von späten dritten Larvenstadium (LL3)<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven.

Dissection und Färbung von Drosophila Larven Ovarien

Viele Organe sind für ihre Entwicklung während der Embryogenese sowie für die Erhaltung oder Reparatur im Erwachsenenalter auf Stammzellen angewiesen. Das Verständnis darüber, wie Stammzellen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, isolierte Ovarien von Drosophila-Larven des späten dritten Larvenstadiums mittels konfokaler Mikroskopie sichtbar zu machen. Dies wird zunächst durch die Auswahl weiblicher Larven aus einer synchronisierten Population erreicht. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, einen intakten Fettkörper zu präparieren, diesen vom Darm und der Cuticula zu trennen und auf Eis zu legen.Der dritte Schritt des Verfahrens ist das Fixieren der Färbung und das Waschen des Fettkörpers mit eingebetteten Ovarien. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Ovarien vom Fettkörper zu trennen, während sie eingebettet werden. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zellspezifische Färbungen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die feinen Dissektionen und das Montieren viel Übung erfordern. Fügen Sie fünf Tage vor der Dissektion Hefe zu einem frischen 25-mm-Gefäß mit Fliegenfutter hinzu. Geben Sie sieben bis 16 begattete weibliche Fruchtfliegen in das Gefäß.Lassen Sie die Weibchen zwei bis vier Stunden lang Eier legen oder bis sich etwa

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video beschreibt die allgemeine Anatomie des Drosophila-Eierstocks und zeigt eine Methode zum Präparieren von Eierstöcken für Live- oder fixierte Bildgebung.

Drosophila melanogaster Ovarialdissektion: Eine Technik zur ex vivo Gewebepräparation

Immunfärbung ist eine effektive Technik zur Visualisierung spezifischer Zelltypen und Proteine innerhalb von Geweben. Durch die Verwendung von Ultraschall verringert das hier beschriebene Protokoll die Notwendigkeit, Drosophila melanogaster-Gewebe von Embryonen und Larven im Spätstadium vor der Immunfärbung zu präparieren. Wir bieten eine effiziente Methodik für die Immunfärbung von Formaldehyd-fixierten Whole-Mount-Larven.

Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe<em&gt; In-situ</em

Die adulten Strukturen von Drosophila stammen von sackartigen Strukturen ab, die imaginale Scheiben genannt werden. Die Analyse dieser Scheiben bietet Einblicke in viele Entwicklungsprozesse, einschließlich der Gewebebestimmung, der Etablierung von Kompartimentgrenzen, der Zellproliferation, der Spezifikation des Zellschicksals und der planaren Zellpolarität. Dieses Protokoll wird verwendet, um imaginale Scheiben für die Licht-/Fluoreszenzmikroskopie vorzubereiten.

Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus Drosophila melanogaster

Die in diesem Protokoll beschriebene aufrechte Bildgebungsmethode ermöglicht die detaillierte Visualisierung der Pole eines sich entwickelnden Drosophila melanogaster-Eies.  Diese End-on-Ansicht bietet eine neue Perspektive auf die Anordnungen und Morphologien mehrerer Zelltypen im follikulären Epithel.

Upright-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Es wird ein Protokoll der Ganzbett-Immunfärbung an Blattlausembryonen vorgestellt, in dem kritische Bedingungen für die Verringerung der Hintergrundfärbung und die Erhöhung der Gewebepermeabilität behandelt werden. Diese Bedingungen wurden speziell für den effektiven Nachweis der Proteinexpression im embryonalen Gewebe von Blattläusen entwickelt.

Identifizierung kritischer Bedingungen für die Immunfärbung in der Erbsenblattlaus Embryos: Erhöhung Gewebepermeabilität und abnehmender Hintergrundfärbung

Wir beschreiben ein Protokoll für die Präparation, Fixierung und Immunfärbung von steroidogenen Organen in Drosophila - Larven und erwachsenen Frauen Steroidhormon - Biosynthese und ihren Regulationsmechanismus zu studieren. Neben steroidogenen Organe visualisieren wir die Innervation steroidogenen Organe sowie steroidogenen Zielzellen wie Keimbahn-Stammzellen.

Protokolle für die Visualisierung Steroidogenic Organe und deren Interactive Organe mit Immunostaining in der Fruchtfliege<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila Eierstock ist ein hervorragendes Modell für Stammzell-Nische Entwicklung zu studieren. Obwohl Methoden für die Larven und adulten Eierstöcke sezieren veröffentlicht wurden, erfordern pupal Eierstock Sezierungen verschiedene Techniken, die nicht im Detail veröffentlicht wurden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum sezieren, Beizen und Montage pupal Eierstöcke.

Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke

Hier werden detaillierte Methoden zur Zerlegung und Lipidtröpfchenfärbung von Önozyten in Drosophila-Larven mit BODIPY 493/503, einem Lipidtropfen-spezifischen fluoreszierenden Farbstoff, vorgestellt.

Dissektion und Lipid Tröpfchen Färbung von Oenocytes in Drosophila Larven

Hier stellen wir ein Sezierprotokoll zur Verfügung, das erforderlich ist, um die spätembryonale Drosophila-Gonade live zu fotografieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung dynamischer zellulärer Prozesse unter normalen Bedingungen oder nach transgener oder pharmakologischer Manipulation.

Dissektion und Live-Imaging der späten embryonalen Drosophila-Gonade

Das Ziel dieses Protokolls ist es, live Bildgebung zu verwenden, um die Auswirkungen von oxidativen Schäden auf die Lokalisierung und Dynamik subzellulärer Strukturen in Drosophila-Ovarien zu visualisieren.

Visualisierung der Auswirkungen oxidativer Schäden auf Drosophila-Eierkammern mit Live Imaging

Die Basalmembran ist essentiell für die Gewebe- und Organmorphogenese während der Entwicklung. Um die Mechanismen, die zur richtigen Platzierung dieser Struktur führen, besser zu verstehen, beschreibt das vorgestellte Protokoll Methoden zur Visualisierung und Charakterisierung des intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen in Epithelzellen mittels konfokaler und hochauflösender Mikroskopie.

Konfokale und hochauflösende Bildgebung des polarisierten intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen während der Drosophila-Oogenese

Lernen Sie die Präparation und Färbung von Drosophila-Larvenovarien für die Entwicklungsbiologie. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Keimbahnstammzellen und deren Nischen mittels konfokaler Mikroskopie.

Dissection und Färbung von Drosophila Larven Ovarien

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