Dissection et la coloration des Drosophile Ovaires larvaires

L’objectif global de cette procédure est de visualiser au microscope confocal des ovaires isolés de larves de drosophile du troisième stade tardif. Pour ce faire, il faut d’abord sélectionner les larves femelles dans une population synchronisée. La deuxième étape de la procédure consiste à disséquer un corps adipeux intact, à le séparer de l’intestin et de la cuticule et à le placer sur de la glace.

La troisième étape de la procédure consiste à fixer, colorer et laver le corps adipeux avec des ovaires intégrés. La dernière étape de la procédure consiste à séparer les ovaires du corps adipeux lors du montage. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent une coloration spécifique à la cellule par microscopie d’immunofluorescence.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car les dissections fines et le montage nécessitent beaucoup de pratique. Cinq jours avant la dissection, ajoutez de la levure dans un flacon frais de 25 millimètres de nourriture pour mouches. Placez sept à 16 mouches femelles accouplées dans le flacon.

Laissez les femelles pondre des œufs pendant deux à quatre heures ou jusqu’à ce qu’il y ait environ 30 œufs par flacon. Incuber l’œuf contenant les flacons à 25 degrés Celsius avec un minimum de 70 % d’humidité. Après cinq jours, les larves ont atteint la fin du troisième stade.

Remplissez un plat de dissection en verre à neuf puits avec du médium de sonnerie. Ensuite, préparez des moules spécialement conçus équipés d’un filet en nylon dans la boîte de Pétri contenant les sonnettes. Douleur moyenne. Placez le plat sur de la glace à l’aide d’une pince fine.

Prélevez 10 à 15 larves sur les parois du flacon et placez-les dans le plat de dissection. Placez la boîte de dissection sous un microscope pour la sélection et la dissection des femelles. Les larves femelles se distinguent des mâles par leurs aiguillons.

Les testicules masculins sont facilement identifiables comme de grands ovales clairs encastrés dans le tiers postérieur du corps adipeux. Les ovaires féminins situés dans la même partie du corps adipeux peuvent être identifiés comme des sphères rondes beaucoup plus petites et claires. Si les ovaires ne sont pas visibles, les larves femelles sont identifiées par l’absence de testicules.

Pour commencer la dissection, utilisez des pinces pour maintenir les larves juste derrière le cerveau. Retirez la tête à l’aide d’une deuxième paire de pinces. Placez la partie postérieure restante des larves sur la face dorsale, la trachée vers le bas.

Tenez les larves par les sphères postérieures à l’aide d’une paire de pinces. Ensuite, poussez lentement la pince vers l’intérieur en même temps, utilisez l’autre paire de pinces pour faire glisser la cuticule vers l’arrière jusqu’à ce qu’environ la moitié du corps adipeux larvaire émerge fermement. Tenez l’extrémité postérieure de la cuticule avec une paire de pinces et tenez lâchement le reste de la cuticule avec l’autre paire doucement et tirez lentement l’extrémité postérieure vers l’extérieur afin que la cuticule et les intestins attachés glissent à travers l’espace.

À la fin de ce processus, déconnectez l’intestin et la cuticule de la partie antérieure du corps adipeux. Mouillez soigneusement une pipette de pâturage avec des bagueurs provenant d’un puits contenant des larves disséquées. À l’aide de la pipette de pâturage, transférez le corps adipeux dans le milieu glacé des bagues dans la crépine cellulaire.

L’étape suivante consiste à fixer et à colorer la préparation à 5 % de formaldéhyde dans un milieu de ringer et à incuber le corps adipeux pendant 20 minutes avec une légère agitation sur un agitateur orbital. Sauf indication contraire, toutes les étapes sont effectuées à température ambiante. Lavez le corps adipeux trois fois avec 1 % de PBT, la première fois pendant cinq minutes, la deuxième fois pendant 10 minutes et la troisième fois pendant 45 minutes.

Bloquer avec 0,3 % de PBTB pendant une heure en agitant doucement. Suite à l’agitation. Transférez le corps adipeux dans un tube de 0,2 millilitre.

Retirez l’excès de liquide et ajoutez le premier anticorps souhaité dilué dans du PBTB à 0,3 % et incubez pendant la nuit à quatre degrés Celsius en agitant doucement sur un rouleau. Le lendemain, transférez le corps gras dans le moule. Ensuite, lavez le corps adipeux trois fois pendant 30 minutes chacune avec 0,3 % de PBTB avec une agitation douce.

Puis bloquez avec 0,3 % de PBTB complété par 5 % de sérum d’âne normal pendant une heure. Avec une agitation douce, transférez le corps adipeux dans un tube de 0,2 millilitre et ajoutez un anticorps fluorescent secondaire approprié dilué dans la solution de blocage. Placez le tube dans une grille et placez la grille sur un rouleau d’incubation pendant deux heures avec une légère agitation.

Si l’anticorps est fluorescent, incuber dans l’obscurité à partir de ce moment. Après deux heures, transférez le corps adipeux dans le moule et lavez-le trois fois pendant 30 minutes avec 0,3 % PBT avec une légère agitation pour disséquer et monter les ovaires. Transférez très soigneusement le corps adipeux dans un tube einor propre.

Retirez tous les liquides à l’aide d’une pipette de pâturage et recouvrez immédiatement d’un bouclier vectoriel. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette et aspirez soigneusement le corps gras avec un volume minimal de support de montage. Transférez le corps adipeux sur une lame de microscope.

L’étape suivante consiste à utiliser deux porte-broches nickelés tenant des broches de 0,1 millimètre de diamètre pour étaler le corps adipeux sous un microscope stéréoscopique, localiser les ovaires en regardant dans le tiers postérieur du corps adipeux. Le corps adipeux a une forme de fleur où il entoure les ovaires. Disséquez les fleurs du reste du corps gras et jetez l’échelle.

Retirez le corps adipeux entourant la gonade en croisant soigneusement les deux broches autour d’elle et en la taquinant loin de l’ovaire. Placez la gonade isolée sur la lame à l’écart des résidus de corps adipeux et jetez les résidus de corps adipeux. Couvrez la diapositive avec le couvercle.

Glissez et scellez avec du vernis à ongles. Visualisez l’ovaire directement à l’aide d’un microscope confocal. Ces chiffres proviennent de deux ou trois ovaires colorés avec différentes combinaisons d’anticorps.

Dans la première image, un anticorps décrit les cellules somatiques et les colore. Le fuso fuso indiqué par les flèches sont des organites intracellulaires. À l’intérieur des cellules germinales primordiales, en vert, se trouvent le filament terminal et les cellules de la coiffe, qui forment ensemble les cellules somatiques de la niche, la pointe de la flèche pointe vers les cellules de la coiffe.

Cette figure montre les cellules entremêlées en magenta, qui entrent directement en contact avec les cellules germinales représentées en bleu. Les cellules somatiques de l’ovaire sont délimitées en vert après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des cellules souches pour explorer la formation de niches et l’établissement de cellules souches dans l’ovaire Tezo.