Name: Biolumineszenz-Bildgebung für die Beurteilung von Immunantworten nach der Implantation von Engineered Heart Tissue (EHT) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Erfahren Sie, wie Biolumineszenz-Bildgebung Immunantworten nach EHT-Implantation bei Ratten nicht-invasiv überwacht. Diese Methode ermöglicht tägliche Langzeitbeobachtung von Transplantatüberleben und Abstoßungsreaktionen.

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Sonja Schrepfer, Lenard Conradi und Arne Hansen erhielt finanzielle Unterstützung von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1, CO 858/1-1, HA 3423/3-1). Die Arbeit wurde auch durch Zuschüsse der Europäischen Union zu Thomas Eschenhagen (EUGeneHeart und Angioscaff) unterstützt.

1. EHT-Generation und Kulturbedingungen Herstellung von Fibrin-basierten EHT erfolgte wie an anderer Stelle beschrieben 4. In kurzen, an Fibrin-basierten EHT für die Implantation Zwecke zu generieren, wurde ein Master-Mix hergestellt, die Zellen von Neugeborenen ROSA / Luciferase-LEW transgenen Rattenherzen, Rinder-Fibrinogen und Matrigel isoliert. Agarose Gussformen wurden unter Verwendung von Teflon Abstandshalter in 6-well Kulturschalen gelegt. Nach dem Erstarren der Agarose wurden Abstandhalter entfernt und Silikon-Post-Racks wurden auf Kulturschalen mit einem Thema bis in die Formen gelegt. Zur Erzeugung von EHT, war der Mastermix kurz mit einer berechneten Menge von Thrombin gemischt und pipettiert in die Form. Nach der Polymerisation von Fibrinogen, wurden Silikon-Racks mit EHTs Einhaltung der Beiträge vorsichtig aus dem Agarose-Gießformen, die mit neuen 6-well Zellkulturschalen und in einer 37 ° C, 7% CO 2 Zellkulturbrutschrank entfernt mit maßgeschneiderten Zellkulturmedium. EHT wurden unter Zellkultur-Bedingungen bis zum zehnten Tag gehalten. Während dieser Zeitspanne begann neugeborenen Ratten Herzzellen zu langgestreckten, Interconnect und richten entlang Kraftlinien zwischen Silikon-Beiträge. Zum Zeitpunkt der Implantation wurden spontane kohärente Kontraktionen beobachtet, Ablenkung Silikon Beiträge. 2. EHT Implantation EHT-Implantation war in beiden immunkompetenten Brown Norway (BN) Ratten oder immundefizienten Nacktratten durchgeführt, um die allogene Immunantwort zu untersuchen. BN und nackte Ratten mit einem Gewicht von 100 bis 150 g wurden von Charles River Deutschland (Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld) erworben und beherbergte unter üblichen Bedingungen, gefüttert Standard Rattenfutter und Wasser ad libidum. Immundefizienten Ratten sind in sterilen Betten, Käfige und keimfreies Wasser verwendet untergebracht. Die deutsche Ethikkommission geprüft und genehmigt das Tier Verfahren. Alle chirurgischen Instrumente sind vor dem Gebrauch sterilisiert. Die Implantation sind wie folgt durchgeführt: Rat sind mit Isofluran (2.5-3%) mit einer Induktion Kammer narkotisiert. Exposition des Menschen gegenüber Isofluran kann durch Arbeiten in einem Fallstrom Tabelle oder Nicht-Rückführung Motorhaube reduziert werden. Die Körpertemperatur ist während des chirurgischen Eingriffs beibehalten. <ol><li> Shave Bauchbereich und gelten Augensalbe auf die Augen vor dem Austrocknen während der Narkose zu verhindern. </li><li> Legen Sie die Ratte auf den Rücken und legen Sie eine Gesichtsmaske über seinen Mund und Nase zu halten die Anästhesie. </li><li> Desinfizieren Sie den Bauchbereich mit Betadine und dann 80% Ethanol. Swab von Clean bis schmutzig, von der Mitte des rasierten Bereich bewegt nach außen in Richtung der behaarten Bereich. </li><li> Überprüfen Reflexe kneifen die Hinterfüße sicher sein, dass die Ratte ausreichend betäubt ist. </li><li> Hängen Sie die Tiere und führen Sie eine Mittellinie Bauchschnitt Trennung der Haut und Muskeln in zwei Schritten auf den Bauch zu öffnen. Hot bead Sterilisation zwischen Haut und Muskel Öffnung verwendet. </li><li> Setzen Sie den Darm in einer angewärmten Kochsalzlösung befeuchtet puderfrei Handschuhe. Klappen Sie den Handschuh um den Darm, um den Verlust von Feuchtigkeit zu verhindern. </li><li> Entfernen Fettgewebe und setzen die Milz. </li><li> Visualisieren und breitete das große Netz mit einer Pinzette. </li><li> Schneiden Sie vorsichtig EHT vom Aussetzung Silikon Beiträge und Übertragung auf das große Netz. </li><li> Wickeln Sie das größere omentus rund um die EHT und fix mit zwei Einzelbetten 7-0 Prolene Fäden (Ethicon, Norderstedt, Deutschland) </li><li> Nächstes verschieben Sie den Darm wieder in den Bauch. </li><li> Spülen Sie den Bauch mit vorgewärmtem steriler Kochsalzlösung. </li><li> Schließen Sie die Muskelschicht der Bauchwand mit 6-0 Prolene fortlaufenden Nähten (Ethicon, Norderstedt, Deutschland). </li><li> Verwenden Sie 5-0 Prolene (Ethicon, Norderstedt, Deutschland) läuft Nähte auf der Haut zu schließen. </li><li> Während die Ratte immer noch in Narkose, injizieren 5 mg / kg Carprofen subkutan. </li><li> Um eine ausreichende Analgesie für diese Art von Verfahren, ein Analgetikum (z. B. Metamizol) ist mit dem Trinkwasser (50 mg Metamizol pro 100 ml) für Schmerzmittel für 3 Tage nach der Transplantation gegeben sind. </li></ol> 3. Biolumineszenz-Bildgebung des EHT nach der Implantation Die IVIS Bioimaging Plattform (Xenogen, Alameda, CA, USA) ist für nicht-invasive Biolumineszenz-Bildgebung in vivo verwendet und die Ergebnisse werden mit Hilfe der IVIS Wohnen Image (Xenogen) Software-Paket. Imaging durchgeführt wird täglich ab 2 Stunden postoperativ. Anesthetize Ratte mit Isofluran (2,5 bis 3%) mit einer Induktion Kammer. <ol><li> Desinfizieren Sie die Bauch-und Brustbereich weit über Provo-Jod, nächsten Einsatz 80% Ethanol, wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. </li><li> Inject d-Luciferin (Xenogen; 375 mg / kg Körpergewicht) ip </li><li> Legen Sie narkotisierten Ratten in die IVIS Bildgebung Kammer (bis zu 4 Ratten können gleichzeitig analysiert werden). </li><li> Beurteilen Signalintensität luc + Zellen innerhalb EHT in Einheiten von Photonen / sec / cm 2 / steridianin der region of interest (ROI) zu Studienbeginn (120 Minuten nach der Implantation) und an den Tagen 1, 2, 3, 5, 7, 10, und in den Wochen 2, 3 und 4. Beachten Sie die Peak-Signal (erscheint ca. 20 Minuten nach dem D-Luciferin-Injektion). </li></ol> Erstellen Sie eine Grafik (Excel) zeigt die Signalstärke über die Zeit. 4. Korrelation von BLI Ergebnisse und ELISPOT Die zellulären in-vivo Immunantworten in immunkompetenten BN und immundefizienten nude Ratten wurden nach EHT Transplantation untersucht. Die Milz des Empfängers Tieren geerntet wurde 5 Tage nach EHT Transplantation Empfänger Splenozyten zu isolieren. Elispot Assays unter Verwendung von Mitomycin-gehemmte EHTs (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) als Stimulator und 5 x10 6 Empfänger Splenozyten als Responder-Zellen nach dem Protokoll des Herstellers (BD Biosciences) mit IFN-γ und IL-4 beschichtete durchgeführt wurden Platten zu untersuchen, TH1-und TH2-Antwort, bzw.. IFN-γ-und IL-4-Spots waren signifikant höher in der immunkompetenten, Modell im Vergleich zu den immundefizienten Modell (IFN-γ: p = 0,001; IL-4: p = 0,023; Student-t-Test). 5. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2605/2605fig1.jpg" alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Korrelation von BLI Ergebnisse und ELISPOT a) Die zellulären in vivo Immunantworten in immunkompetenten Brown Norwegen und immundefizienten nude Ratten wurden nach EHT-Implantation untersucht. Empfänger Splenozyten wurden 5 Tage nach der Implantation EHT geerntet. IFN? und IL-4-Expression wurde durch ELISPOT-Assays mit Mitomycin-gehemmte EHT als Stimulatoren und 5x106 Empfänger Splenozyten als Responder-Zellen ausgewertet. Th1 und Th2-Antworten waren signifikant höher in der immunkompetenten Modell im Vergleich zu den immundefizienten Modell als durch IFNy-und IL-4 Produktion bzw. belegt. b) Luc + EHTs wurden in den größeren omentus entweder immunkompetenten BN Ratten oder immundefizienten nude Ratten transplantiert. Überleben der Zellen wurde in Längsrichtung durch BLI gefolgt. Die Rate der Tiere, dass die transplantierten EHTs abgelehnt wird vorgestellt. Alle BN Ratten schnell wies die EHT-Transplantationen, während die Zellen überlebten in T-Zell-defizienten Ratten.

<ol><li>Eschenhagen, T., Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+myocardial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering myocardial tissue.</a> Circ Res. 97, 1220-1231 (2005).</li>
<li>van der Bogt, K. E., Schrepfer, S., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+transplantation+of+adipose+tissue-+and+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+the+infarcted+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of transplantation of adipose tissue- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the infarcted heart.</a> Transplantation. 87, 642-652 (2009).</li>
<li>Hakamata, Y., Murakami, T., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Firefly+rats%22+as+an+organ%2Fcellular+source+for+long-term+in+vivo+bioluminescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">"Firefly rats" as an organ/cellular source for long-term in vivo bioluminescent imaging.</a> Transplantation. 81, 1179-1184 (2006).</li>
<li>Hansen, A., Eder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Drug+Screening+Platform+Based+on+Engineered+Heart+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a Drug Screening Platform Based on Engineered Heart Tissue.</a> Circ Res. , (2010).</li>
</ol>

Bevor klinische Umsetzung der EHT-Technologie für die Herz-Reparatur, müssen grundlegende Fragen wie die Immunogenität der beiden Mobilfunk-und Matrix-Komponenten oder Transplantat-Überlebens nach der Implantation in experimentellen Modellen bewertet werden. In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung stellt eine nützliche neue Technik für die Überwachung der das Überleben der Zelle nach der Transplantation . Wir haben erfolgreich Fibrin-basierten EHT generiert mit Luciferase positive (luc +) Herzzellen durch Anpassung e...

<ul><li> LEW-Tg (Gt (ROSA) 26Sor-luc) 11Jmsk Ratten (NBPR Ratte Nummer 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/) </li><li> Bovine Fibrinogen (Stammlösung: 200 mg / ml plus Aprotinin 5 ug / ml Fibrinogen in NaCl 0,9%, Sigma F4753) </li><li> Matrigel (BD Bioscience 356235) </li><li> DMEM (Biochrome F0415) </li><li> Pferdeserum (Gibco 26050) </li><li> Penicillin / Streptomycin (Gibco 15140) </li><li> Insulin (Sigma-Aldrich I9278) </li><li> Aprotinin (Sigma Aldrich A1153) </li><li> d-Luciferin (Biosynth L-8220) </li><li> Enzyme-Linked Immuno Spot (ELISPOT) Assay-Platten (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99) </li></ul>

biolumineszenz-bildgebung für die beurteilung von immunantworten nach der implantation von engineered heart tissue (eht)

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Verschiedene Techniken der kardialen Tissue Engineering haben in den vergangenen Jahrzehnten auch Gerüste Strategien entweder nativ oder bioartifiziellen Gerüstmaterial, Einschluss von Herzmuskelzellen in Hydrogele wie Fibrin oder Kollagen und Stapeln von Myozyten Monoschichten dem 1. verfolgt. Diese Konzepte zielen auf die Wiederherstellung der Herzfunktion (z. B. nach Myokardinfarkt) oder als experimentelle Modelle (zB zur prädiktiven Toxikologie und Wirkstoff-Screening oder Krankheit Modellierung). Präzise Überwachung der das Überleben der Zelle nach Implantation von Engineered Heart Tissue (EHT) ist inzwischen möglich, mit in-vivo Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) Techniken 2. Hier beschreiben wir die Erzeugung von Fibrin-basierten EHT aus einem transgenen Ratten-Stamm mit ubiquitäre Expression von Luciferase (ROSA / Luciferase-LEW Tg, 3). Die Implantation ist in das große Netz verschiedener Zuchtlinien, um Immunreaktionen des Empfängerorganismus folgenden EHT Implantation beurteilen durchgeführt. Ein Vergleich der Ergebnisse von BLI und die Enzyme Linked Immuno Spot Technique (ELISPOT) bestätigen die Verwendbarkeit von BLI für die Beurteilung der Immunantwort generiert.

Dieses Video demonstriert die Verwendung von<em&gt; In vivo</em&gt; Biolumineszenz-Bildgebung zu Immunreaktionen nach Implantation von Engineered Heart Tissue (EHT) in Ratten zu untersuchen.

Biolumineszenz-Bildgebung für die Beurteilung von Immunantworten nach der Implantation von Engineered Heart Tissue (EHT)

In den vergangenen Jahrzehnten wurden verschiedene Techniken des Cardiac Tissue Engineering verfolgt, darunter Scaffolding-Strategien unter Verwendung entweder nativer oder ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe der in-vivo-Biolumineszenzbildgebung Immunantworten nach der Implantation von hergestelltem Herzgewebe oder EHT bei Ratten zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst Luciferase-positive EHS erzeugt werden. Anschließend werden EHS, die Luciferase stabil exprimieren, in das große Omentum von Empfängerratten transplantiert.Anschließend kann an den Empfängertieren eine in vivo-Biolumineszenz-Bildgebung durchgeführt werden, um das Überleben und die Abstoßung von EHTs nichtinvasiv und longitudinal zu überwachen. Mithilfe dieses Modells lässt sich beispielsweise die Intensität und Kinetik der akuten Abstoßung mit dem zeitabhängigen Rückgang der beobachteten Biolumineszenz-Signalintensität korrelieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Histologie besteht darin, dass tägliche Messungen eine nichtinvasive, longitudinale Beurteilung des Transplantatüberlebens ermöglichen.Diese Methode kann Einblicke in das Überleben und die Abstoßung von hergestellten Herzgeweben geben, sie kann jedoch auch auf andere Fragestellungen angewendet werden. Zum Beispiel auf den Stoffwechsel von ehs. Die Bili-Technik wird von Christiana Parman demonstriert, die diese Technik täglich durchführt.In meinem Labor werden transgene Herzzellen zunächst aus Luciferase-Lu-Neugeborenenratten isoliert, um fibrinbasiertes DHT zu Implantationszwecken herzustellen; bereiten Sie eine Master-Mischung vor, die aus Zellen besteht, die aus neonatalen Luciferase-Lu-transgenen Rattenherzen isoliert wurden, sowie aus bovinem Fibrinogen und Matrigel, die zu X-D-M-E-M und NKM gegeben werden. Bereiten Sie Aros-Abformformen vor, indem Sie neun Milliliter 2 % Aros in PBS in jedes Loch von sechswelligen Kulturschalen geben und anschließend Teflon-Abstandshalter in die Löcher einsetzen. Nachdem das Aros erstarrt ist, entfernen Sie die Abstandshalter und platzieren Sie Silikonpfostenhalterungen auf den Kulturschalen, wobei die Pfosten in die Formen hineinragen.Um EHT herzustellen, mischen Sie die Master-Mix vorsichtig, geben anschließend eine berechnete Menge Thrombin in die Master-Mix und mischen kurz. Pipettieren Sie dann schnell 1100 Mikroliter der Master-Mix in jede Form. Nachdem das Fibrinogen polymerisiert ist, entfernen Sie die Gestelle mit den Säulen, an denen nun das adhärierte EHT haftet, vorsichtig aus den Agaros-Gussformen und überführen die Gestelle in neue sechswellige Zellkulturschalen, die je Vertiefung acht Milliliter speziell hergestelltes Medium enthalten.EHT werden 10 Tage lang in einem Zellkulturinkubator bei 37 Grad Celsius und 7 % Kohlendioxid aufbewahrt. Das Medium wird dreimal pro Woche gewechselt. Während dieser Kultivierungszeit beginnen die Herzzellen von neugeborenen Ratten, sich zu verlängern, miteinander zu verbinden und entlang der Kraftlinien zwischen den Silikonpfosten auszurichten.Zum Zeitpunkt der Implantation werden spontane, koordinierte Kontraktionen beobachtet. Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente vor der Verwendung durch Autoklavierung und erwärmen Sie 30 Milliliter sterile Kochsalzlösung. Ratten für die Implantation sollten ein Gewicht von 100 bis 150 Gramm haben und unter konventionellen Bedingungen gehalten werden, mit Standard-Rattenfutter und Wasser ad libitum versorgt.In diesem Video werden nach Anästhesierung braune Norweger-Ratten verwendet; sedieren Sie die Ratten vor der Operation und bestätigen Sie die Sedierung durch das Fehlen einer Reaktion auf eine Zehenquetschung, während sich die Ratte unter Anästhesie befindet. Injizieren Sie fünf Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht Carprofen subkutan in den Bauchbereich, rasieren Sie den Bauchbereich und tragen Sie Augensalbe auf, um zu verhindern, dass die Augen des Tieres austrocknen. Desinfizieren Sie während der Anästhesie den Bauchbereich mit Betadine und anschließend durch Abwischen mit 80 %igem Ethanol von sauber zu schmutzig. Wiederholen Sie diese Desinfektion.Gehen Sie dreimal vor, drapieren Sie das Tier und führen Sie einen medianen Bauchschnitt durch, wobei Sie Haut und Muskulatur in zwei Schritten trennen, um die Bauchhöhle zu öffnen. Verwenden Sie nach jedem Schnitt die heiße Perle zur Sterilisation der Instrumente. Befeuchten Sie einen Puderfreihandschuh mit der Kochsalzlösung.Legen Sie die Därme in den Handschuh. Falten Sie den Handschuh um die Därme, um Feuchtigkeitsverlust zu verhindern. Weiten Sie den Schnitt und legen Sie die Milz frei.Identifizieren und entfalten Sie das größere Momentum mit einer Pinzette. Schneiden Sie das EHT vorsichtig von den haltenden Silikonpfosten ab und übertragen Sie es auf das größere Momentum. Wickeln Sie das größere Momentum um das EHT und fixieren Sie es mit zwei einzelnen Sieben-Ohm-Prolin-Nähten.Als Nächstes bringen Sie den Darm zurück in die Bauchhöhle. Spülen Sie die Bauchhöhle mit einem Milliliter vorgewärmter steriler Kochsalzlösung aus. Schließen Sie die MuskelSchicht der Bauchwand mit sechs 6-0-Proline-Nähten in fortlaufender Technik.Verwenden Sie fünf 0-Prolin-Nahtfäden, um die Haut zu verschließen, um eine ausreichende Analgesie für diese Art von Eingriff zu gewährleisten. Geben Sie 50 Milligramm pro 100 Milliliter Ole im Trinkwasser für drei Tage nach der Implantation. Die IVUS-Bioimaging-Plattform wird für die nichtinvasive Biolumineszenz-Bildgebung in vivo verwendet, und die Ergebnisse werden mit der IVUS-Living-Image-Software analysiert.Die Bildgebung wird täglich durchgeführt, beginnend zwei Stunden nach der Operation. Vor der Visualisierung der Biolumineszenz des EHT wird die Ratte anästhesiert und die Sedierung durch Zehenquetschung überprüft. Desinfizieren Sie den Bauchbereich.Spritzen Sie Lucifer initial mit 375 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht ein und legen Sie die anästhesierte Ratte in die IVIS-Bildgebungskammer. Bis zu vier Ratten können gleichzeitig analysiert werden. Verwenden Sie die IVIS-Living-Image-Software, um das Signalmaximum zu beobachten und aufzuzeichnen, das etwa 20 Minuten nach der Lucifer-Injektion erscheint.Danach die Basissignalintensität von Luciferase-positiven Zellen innerhalb des EHT in Einheiten von Photonen pro Sekunde pro Quadratzentimeter pro Ceridian in der interessierenden Region 120 Minuten nach der Implantation sowie an den Tagen 1, 2, 3, 5, 7, 10 und in den Wochen zwei, drei und vier bestimmen. Die Daten können grafisch dargestellt werden, wobei die Signalintensität über die Zeit aufgezeigt wird. Die zellulären in-vivo-Immunantworten bei immunkompetenten Brown-Norway- und immundefizienten Tieren.Nacktratten wurden nach der Implantation von EHT untersucht, wobei SP-Zellen fünf Tage nach der EHT-Implantation gewonnen wurden. Die Expression von Interferon, Gamma und IL-4 wurde mittels Lysa-Assays unter Verwendung mit Mitomycin gehemmter EHT als Stimulatoren und fünfmal 10 der sechs Empfängerzellen als Reaktionszellen evaluiert. Die TH1- und TH2-Antworten waren im immunkompetenten Modell im Vergleich zum immundefizienten Modell signifikant höher, wie durch die Produktion von Interferon, Gamma bzw. IL-4 belegt wurde.LUCIFERASE-positive EHS wurden in das große Netz von entweder immunkompetenten PN-Ratten oder immundefizienten Nude-Ratten transplantiert. Das Zellüberleben wurde longitudinal mittels BLI verfolgt. Die Rate der Tiere, die die transplantierten EHS abstoßen, ist dargestellt.Alle BN-Ratten wiesen die EHT-Transplantate rasch ab, während die Zellen in T-Zell-defizienten Ratten überlebten. Sobald die chirurgischen Techniken beherrscht sind, können die Eingriffe innerhalb weniger Minuten durchgeführt werden, sofern die Technik korrekt angewendet wird. Weitere Methoden wie immunologische Assays und Histologie können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich Zellinfiltration und humoraler Antwort zu beantworten.

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