iClip - Transkriptom-weiten Mapping von Protein-RNA Wechselwirkungen mit Individual Nucleotide Resolution

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, eine transkriptomweite Karte der Bindungsstellen eines RNA-Bindungsproteins mit individueller Nukleotidauflösung zu erhalten. Dies wird durch UV-Bestrahlung lebender Zellen erreicht, um in einem zweiten Schritt Proteine und RNA in vivo kovalent zu vernetzen. Das RNA-bindende Protein wird unter strengen Bedingungen immungereinigt, um die vernetzten RNA-Fragmente zurückzugewinnen.

Als nächstes erzeugt die reverse Transkription CDNAs, die sich oft am angehängten Peptid abschneiden, wodurch die Information über die Vernetzungsposition innerhalb der RNA erhalten bleibt. Es werden Ergebnisse erhalten, die alle Bindungsstellen innerhalb des Transkriptoms zeigen, basierend auf der Hochdurchsatzsequenzierung der cDNA-Bibliothek. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der RNA-Biologie zu beantworten, z. B. wie das Zusammenspiel verschiedener RNA-Proteine die RNA-Prozessierung reguliert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir sowohl die Leistung als auch die Auflösung unserer transkriptomweiten Karten von Protein-RNA-Wechselwirkungen erhöhen, um mit dem Verfahren der UV-Vernetzung von Gewebekulturzellen zu beginnen.

Entferne das Medium von einer 10 Zentimeter großen Platte mit Heilzellen. Sechs Milliliter eiskaltes PBS dazugeben und die Teller auf Eis legen. Eine Platte reicht für drei Experimente.

Nehmen Sie den Deckel ab und bestrahlen Sie die Zellen. Sobald Sie bei 254 Nanometern mit 150 Millijoule pro Quadratzentimeter sind, ernten Sie die Zellen, indem Sie sie mit einem Zellheber von den Platten kratzen, und übertragen Sie zwei Milliliter Zellsuspension in jedes der drei Mikroröhrchen, um die Zellen zu pelletieren. Drehen Sie sie 10 Sekunden lang mit Höchstgeschwindigkeit bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie dann den Supinat-Snap, frieren Sie die Zellpellets auf Trockeneis ein und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Geben Sie 100 Mikroliter Protein, ein Dyna-Kügelchen pro Experiment, in ein frisches Mikroröhrchen. Wenn Sie mit Maus- oder Ziegenantikörpern arbeiten, verwenden Sie Protein G dyna-Kügelchen.

Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit Lysepuffer, der im beigefügten schriftlichen Protokoll zu finden ist. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 Mikrolitern Lysepuffer mit zwei bis 10 Mikrogramm Antikörper. Drehen Sie das Rohr 30 bis 60 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Kügelchen dann dreimal mit 900 Mikrolitern Lysepuffer und lassen Sie sie in der letzten Wäsche, bis Sie bereit sind, fortzufahren. Zur Immunpräzipitation Thor-Zellpalast auf Eis. Resus in einem Milliliter Lysepuffer suspendiert und in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen überführen.

Bereiten Sie eine Verdünnung von RNAs von eins bis 500 vor. Geben Sie dann 10 Mikroliter zusammen mit zwei Mikrolitern Turbo-DNA in die Zelle. Lysat. Inkubieren Sie die Proben genau drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius, schütteln Sie sie mit 1.100 Umdrehungen pro Minute und geben Sie sie sofort auf Eis.

Schleudern Sie dann die Proben 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius und 22.000-facher Schwerkraft, um das Lysat zu reinigen, sammeln Sie vorsichtig das SUP-Nativmittel und lassen Sie etwa 50 Mikroliter Lysat mit dem Pellet zurück, um die Kügelchen immunauszufällen. Entfernen Sie den Waschpuffer und fügen Sie dann die vorbereiteten Zelllysate hinzu. Drehen Sie die Proben zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius.

Entsorgen Sie das SUP-Mittel und waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 900 Mikrolitern Puffer mit hohem Salzgehalt, der im beigefügten schriftlichen Protokoll zu finden ist. Zum Schluss waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 900 Mikrolitern Waschpuffer. Fahren Sie dann mit dem Dephosphorylat fort und fügen Sie der RNA an den drei Primzahlen einen Linker hinzu.

Um die RNA zu markieren, arbeiten fünf Primzahlen hinter einer Plexiglasschild. Entfernen Sie das Supinat aus der letzten Wäsche der Linkerligationsreaktion und suspendieren Sie die Kügelchen in acht Mikrolitern heißer PNK-Mischung. Fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Die heiße PNK-Mischung herausnehmen und wieder verwenden. Suspendieren Sie die Perlen in 20 Mikrolitern des einmal neuen Seitenladepuffers. Anschließend wird die Probe auf einem Thermomischer 10 Minuten lang bei 70 Grad Celsius inkubiert.

Legen Sie die Probe sofort auf einen Magneten, um die leeren Kügelchen auszufällen. Laden Sie die Beispiele auf eine vier bis 12 % neue Seite. Biss-Gel nach Herstellerangaben.

Laden Sie außerdem fünf Mikroliter eines vorgefärbten Proteingrößenmarkers. Lassen Sie das Gel 50 Minuten lang bei 180 Volt laufen. Die Protein-RNA-Komplexe aus dem Gel mit dem NOVA-Nasstransfergerät gemäß den Anweisungen des Herstellers auf eine Nitrozellulosemembran übertragen.

Spülen Sie die Membran nach dem Transfer in PBS-Puffer. Wickeln Sie es dann in Saran-Folie ein und belichten Sie es bei minus 80 Grad Celsius mit Film. Führen Sie Belichtungen für 30 Minuten, eine Stunde und über Nacht durch.

Als nächstes isolieren Sie die Membranregion entsprechend den Protein-RNA-Komplexen aus den niedrigen RNAs. Experimentieren Sie mit dem Autoradiogramm als Maske. Die RNA aus der Membran mit Proteinase-K-Verdau und Phenolchloroform-Extraktion zurückgewinnen.

Transkribieren Sie die RNA rückwärts mit einem der AYP-Primer, um die CDNA zu reinigen. Mischen Sie sechs Mikroliter CDNA-Probe mit sechs Mikrolitern zweifachem FSME-Harnstoff-Ladepuffer. Kurz bevor die Proben auf ein Gel geladen werden.

Erhitzen Sie die Proben drei Minuten lang auf 80 Grad Celsius. Laden Sie dann die Proben auf ein vorgefertigtes 6%TBE-Harnstoffgel zusammen mit einem Marker mit niedrigem Molekulargewicht. Lassen Sie das Gel 40 Minuten lang bei 180 Volt laufen, wie vom Hersteller beschrieben, indem Sie den oberen Farbstoff und die Markierungen auf dem Kunststoffgelträger verwenden, um die Exzision zu führen.

Schneiden Sie drei Banden bei 120 bis 200 Nukleotiden, 85 bis 120 Nukleotiden und 70 bis 85 Nukleotiden. Beachten Sie, dass der Arc-Lip-Primer und die L-Drei-Sequenz zusammen 52 Nukleotide der Clip-Sequenz ausmachen. Fügen Sie 400 Mikroliter te hinzu und zerkleinern Sie die Gelscheibe in kleine Stücke.

Inkubieren Sie die Gelstücke mit einem Ein-Milliliter-Spritzenkolben unter Schütteln bei 1.100 Umdrehungen pro Minute für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Platzieren Sie zwei Ein-Zentimeter-Glasvorfilter in einer CoStar Spinx-Säule. Übertragen Sie den flüssigen Teil der Probe in die Säule und drehen Sie ihn eine Minute lang mit 13.000 Umdrehungen pro Minute in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Fügen Sie 0,5 Mikroliter Glykoblau und 40 Mikroliter Natriumacetat mit einem pH-Wert von 5,5 hinzu. Dann die Probe mischen. Fügen Sie einen Milliliter 100%Ethanol hinzu.

Erneut mischen und die Probe über Nacht bei minus 20 Grad Celsius ausfällen. Zum Schluss zirkularisieren Sie die CD-NA-Moleküle, um den Adapterbereich an die fünf Primzahlen zu binden. Nach der Relinearisierung und PCR-Amplifikation gemäß dem begleitenden schriftlichen Protokoll vor der Sequenzierung der Augenclip-Bibliothek kann der Erfolg des Experiments in zwei Schritten überwacht werden.

Im Autoradio-Graphen des Protein-RNA-Komplexes nach dem Membrantransfer und im Gelbild der Autoradiographie der Proben mit niedriger RNA sollte die diffuse Radioaktivität oberhalb des Molekulargewichts des Proteins für Proben mit hoher RNA zu sehen sein. Diese Radioaktivität wird näher am Molekulargewicht des Proteins fokussiert. Wenn kein Antikörper bei der Immunpräzipitation verwendet wird, sollte kein Signal nachgewiesen werden.

Weitere wichtige Kontrollen für die Spezifität der Immunpräzipitation emittieren entweder UVE-Strahlung oder verwenden Zellen, die das interessierende Protein nicht exprimieren. Das Gelbild der PCR-Produkte sollte einen Größenbereich zeigen, der der CD-NA-Fraktion entspricht. Es ist zu beachten, dass die PCR-Primer P drei Celexa und P fünf Celexa zusätzliche 76 Nukleotide zur Größe der CD NA einführen. Wenn bei der Immunpräzipitation kein Antikörper verwendet wird, sollte kein entsprechendes PCR-Produkt nachgewiesen werden.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass jeder der 64 Schritte kritisch ist und mit hundertprozentiger Genauigkeit ausgeführt werden muss. ICL-Daten können rechnerisch mit transkriptweiten funktionellen Assays integriert werden. So lassen sich zum Beispiel Erkenntnisse über die positionsabhängige Regulation der RNA-Prozessierung gewinnen.

Für die computergestützte Datenanalyse möchten wir auf unsere jüngsten Veröffentlichungen in Zusammenarbeit mit Nicholas KA European Bioinformatics Institute und bla zupan an der Universität Liana verweisen. Und jetzt ist es an der Zeit, dass Sie Ihre eigenen Experimente starten. Viel Spass.