Name: iClip - Transkriptom-weiten Mapping von Protein-RNA Wechselwirkungen mit Individual Nucleotide Resolution (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Lernen Sie die iCLIP-Methode zur Kartierung von Protein-RNA-Wechselwirkungen mit Einzelnukleotidauflösung im Transkriptom. Diese Technik ermöglicht präzise Einblicke in die posttranskriptionale Regulation.

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Die Autoren danken allen Mitgliedern der Ule, Luscombe und Zupan Labors für die Diskussion und experimentelle Mitarbeit. Wir danken James Hadfield und Nik Matthews für Hochdurchsatz-Sequenzierung. Wir möchten darauf hinweisen, dass der iClip hier beschriebene Verfahren teilt mehrere Schritte mit dem Original-CLIP-Protokoll von Kirk Jensen und JU im Labor von Robert Darnell entwickelt. Diese Arbeit wurde von der European Research Council gewähren 206726-CLIP zur JU und eine langfristige Human Frontiers Science Program Stipendium für JK unterstützt

1. UV-Vernetzung von Gewebekulturzellen <ol><li> Entfernen Sie die Medien und 6 ml eiskaltem PBS, um Zellen in einer 10 cm Platte (reicht für drei Versuchen) gewachsen. </li><li> Entfernen Sie den Deckel und auf Eis stellen. Bestrahlen einmal mit 150 mJ / cm 2 bei 254 nm. </li><li> Ernten Sie die Zellen, die durch Kratzen mit einem Zell-Lifter. </li><li> Transfer 2 ml Zellsuspension jeweils drei Röhrchen. Spin bei Höchstgeschwindigkeit für 10 sec bei 4 ° C zu Pellet-Zellen, dann entfernen Überstand. </li><li> Snap-freeze die Zellpellets auf Trockeneis und bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Bead Vorbereitung <ol><li> 100 l Protein A Dynabeads (Dynal, 100,02) pro Experiment zu einem frischen Mikroröhrchen (Use Protein G Dynabeads für eine Maus oder Ziege-Antikörper). </li><li> Wash Perlen 2x mit Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% Natriumdeoxycholat; 1 / 100 Protease-Inhibitor-Cocktail III, Calbiochem). </li><li> Resuspendieren Perlen in 100 ul Lysepuffer mit 2-10 pg Antikörper. </li><li> Drehen Röhrchen bei Raumtemperatur für 30-60 min. </li><li> Waschen mit 900 ul Lysepuffer 3x und verlassen in der letzten Waschung bis bereit, um fortzufahren auf 4,1 Schritt. </li></ol> 3. Zelllyse und partielle RNA Verdauung <ol><li> Zellpellet in 1 ml Lysepuffer und Transfer bis 1,5 ml Röhrchen. </li><li> Bereiten Sie eine 1 / 500 Verdünnung von RNase I (Ambion, AM2295). Fügen Sie 10 ul RNase I Verdünnung sowie 2 ul Turbo DNase dem Zelllysat (1 / 500 RNase I Verdünnungen [low RNase] sind für die Bibliothek der Zubereitung verwendet, 1 / 50 Verdünnungen [high RNase] notwendig sind, um für die Antikörper-Spezifität control) . </li><li> Inkubieren Sie die Proben für exakt 3 min bei 37 ° C, Schütteln bei 1.100 Umdrehungen pro Minute. Sofort auf Eis zu übertragen. </li><li> Spin bei 4 ° C und 22.000 g für 20 min zum Lysat klar. Vorsichtig den Überstand (leave etwa 50 ul Lysat mit dem Pellet). </li></ol> 4. Immunpräzipitation <ol><li> Entfernen Sie den Waschpuffer aus den Perlen (aus Schritt 2,5), dann fügen Sie das Zelllysat (aus Schritt 3.4). </li><li> Drehen Sie die Proben für 2 h bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und waschen Sie die Perlen 2x mit 900 ul High-Salz-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% Natriumdeoxycholat). </li><li> Wash 2x mit 900 ul Waschpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl 2, 0,2% Tween-20). </li></ol> 5. Dephosphorylierung von RNA 3'-Enden <ol><li> Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Kügelchen in 20 ul PNK-Mix (15 ul Wasser, 4 ul 5x PNK pH 6,5-Puffer [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl 2 25mMdithiothreitol]; 0,5 ul PNK Enzym, 0,5 ul RNasin [Promega]). </li><li> Inkubieren für 20 min bei 37 ° C. </li><li> Add 500 ul Waschpuffer waschen 1x mit Hochsalzpuffer. </li><li> Wash 2x mit Waschpuffer. </li></ol> 6. Linkerligation bis 3 'Enden RNA <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Perlen in 20 ul Ligationsgemisch (9 ul Wasser, 4 ul 4x Ligationspuffer [200 mM Tris-HCl, 40 MM GCL 2; 40 mM Dithiothreitol], 1 ul RNA-Ligase [NEB]; 0,5 ul RNasin [Promega]; 1,5 ul pre-adenylierte Linker L3 [20 uM]; 4 ul PEG400 [81170, Sigma]). </li><li> Inkubieren über Nacht bei 16 ° C. </li><li> Add 500 ul Waschpuffer und dann waschen mit 1 ml Hochsalzpuffer 2x. </li><li> Wash 2x mit 1 ml Waschpuffer und in 1 ml der zweiten waschen zu lassen. </li></ol> 7. RNA 5 'Ende Kennzeichnung <ol><li> Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Perlen in 8 ul heißen PNK-Mix (0,4 ul PNK [NEB], 0,8 ul 32 P-γ-ATP, 0,8 ul 10x PNK-Puffer [NEB]; 6 ul Wasser). </li><li> Inkubieren für 5 min bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie die heißen PNK-Mix und resuspendieren die Perlen in 20 ul 1x NuPAGE Ladepuffer (Invitrogen). </li><li> Inkubieren auf einem Thermomixer bei 70 ° C für 10 min. </li><li> Unmittelbar auf einem Magneten Ort, um Niederschlag der leeren Perlen und Last der Überstand auf das Gel (siehe Schritt 8). </li></ol> 8. SDS-PAGE und Membran übertragen <ol><li> Laden Sie die Proben auf einem 4-12% NuPAGE Bis-Tris-Gel (Invitrogen) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie 0,5 l 1x MOPS-Laufpuffer (Invitrogen). Auch Last 5 ul einer pre-gefärbten Protein-Größenmarker (zB PAGE Herrscher plus, Fermentas, SM1811). </li><li> Führen Sie das Gel für 50 min bei 180 V. </li><li> Entfernen Sie das Gel vor und entsorgen Sie als feste Abfälle (enthält freie radioaktive ATP). </li><li> Übertragen Sie die Protein-RNA-Komplexen aus dem Gel auf eine Nitrozellulosemembran mit dem Novex nassen Übertragung gemäß den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen, je 1 h bei 30 V). </li><li> Nach der Übertragung, spülen Sie die Membran in PBS-Puffer, dann wickeln Sie es in Frischhaltefolie und setzen Sie es zu einem Fuji-Film bei -80 ° C (statt einem fluoreszierenden Aufkleber neben der Membran zu einem späteren Zeitpunkt align ter Film und die Membran; durchführen Forderungen für 30 min, 1h und über Nacht). </li></ol> 9. RNA-Isolierung <ol><li> Isolieren Sie die Protein-RNA-Komplexen aus dem Low-RNase Experiment mit dem Autoradiogramm von Schritt 8.5 als eine Maske. Cut dieses Stück Membran in mehrere kleine Scheiben schneiden und diese in ein 1,5 ml Mikroröhrchen. </li><li> Geben Sie 200 ul PK-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA) und 10 ul Proteinase K (Roche, 03115828001) an die Membran Stücke. Inkubieren Schütteln bei 1.100 rpm für 20 min bei 37 ° C. </li><li> Add 200 ul PKurea Puffer (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 7 M Harnstoff) und Inkubation für 20 min bei 37 ° C. </li><li> Sammeln Sie die Lösung und fügen Sie ihn zusammen mit 400 ul RNA Phenol / Chloroform (Ambion, 9722) zu einem 2 ml Phase Lock Gel Schwere Rohr (713 bis 2536, VWR). </li><li> Inkubieren für 5 min bei 30 ° C, Schütteln bei 1.100 Umdrehungen pro Minute. Trennen Sie die Phasen, durch Drehen für 5 min bei 13.000 rpm bei Raumtemperatur. </li><li> Übertragen Sie die wässrige Schicht in ein neues Röhrchen (darauf achten, nicht auf das Gel mit der Pipette berühren). Add 0,5 ul glycoblue (Ambion, 9510) und 40 ul 3 M Natriumacetat pH 5,5 und mischen. Dann fügen Sie 1 ml 100% Ethanol, nochmals mischen und Niederschlag über Nacht bei -20 ° C. </li></ol> 10. Reverse Transkription <ol><li> Spin für 20 min bei 15.000 rpm und 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und wäscht das Pellet mit 0,5 ml 80% Ethanol. </li><li> Das Pellet in 7,25 ul RNA / Primer-Mix (6,25 &amp;mgr; l Wasser, 0,5 ul Rclip Primer [0.5pmol/μl]; 0,5 ul dNTP-Mix [10 mM]). Für jedes Experiment oder replizieren, verwenden Sie ein anderes Rclip Primer mit individuellen Barcode-Sequenzen (siehe 14). </li><li> Inkubieren für 5 min bei 70 ° C vor dem Abkühlen auf 25 ° C. </li><li> Add 2,75 ul RT-Mix (2 ul 5x RT-Puffer, 0,5 ul 0,1 M DTT, 0,25 ul Superscript III-Reverse-Transkriptase [Invitrogen]). </li><li> Inkubieren 5 min bei 25 ° C, 20 min bei 42 ° C, 40 min bei 50 ° C und 5 min bei 80 ° C vor dem Abkühlen auf 4 ° C. </li><li> Add 90 ul TE-Puffer, 0,5 ul glycoblue und 10 ul Natriumacetat pH 5,5 und mischen. Dann fügen Sie 250 ul 100% Ethanol, nochmals mischen und Niederschlag über Nacht bei -20 ° C. </li></ol> 11. Gel Reinigung der cDNA <ol><li> Spin nach unten und waschen Sie die Proben (siehe 10,1), dann das Sediment resuspendieren in 6 l Wasser. </li><li> Add 6 ul 2x TBE-Harnstoff-Ladepuffer (Invitrogen). Hitze Proben bis 80 ° C für 3 min direkt vor dem Laden. </li><li> Laden Sie die Proben auf einem vorgefertigten 6% TBE-Harnstoff-Gel (Invitrogen) und führen Sie für 40 min bei 180 V, wie vom Hersteller beschrieben. Auch Last mit niedrigem Molekulargewicht-Marker für die spätere Schneiden (siehe unten). </li><li> Cut drei Bands bei 120-200 nt (hoch), 85-120 nt (medium) und 70-85 nt (low). Verwenden Sie theupper Farbstoff und die Markierungen auf der Kunststoff-Gel unterstützt Exzision Guide (siehe Abbildung 3). Beachten Sie, dass die Rclip Primer und der L3-Sequenz machen zusammen über 52 nt der CLIP-Sequenz. </li><li> Add 400 ul TE zugeben und Gelscheibe in kleine Stücke mit einer 1 ml Spritze Kolben. Inkubieren Schütteln bei 1.100 rpm für 2 h bei 37 ° C. </li><li> Legen Sie zwei 1 cm Glas Vorfilter (Whatman, 1823010) in eine Costar SpinX Spalte (Corning Incorporated, 8161). Die Flüssigkeit Teil der Probe auf die Säule. Spin für 1 min bei 13.000 rpm in ein 1,5 ml-Tube. </li><li> Add 0,5 ul glycoblue und 40 ul Natriumacetat pH 5,5, dann mischen Sie die Probe. 1 ml 100% Ethanol, nochmals mischen und Niederschlag über Nacht bei -20 ° C. </li></ol> 12. Ligation der Primer 5'-Ende der cDNA <ol><li> Spin nach unten und waschen Sie die Proben (siehe 10,1), dann das Sediment resuspendieren in 8 ul Ligationsgemisch (6,5 ul Wasser, 0,8 ul 10x CircLigase Buffer II, 0,4 ul 50 mM MnCl 2, 0,3 ul; Circligase II [Epicentre]) und inkubieren 1 h bei 60 ° C. </li><li> Zugabe von 30 ul Oligo Glühen Mix (26 ul Wasser, 3 ul FastDigest Buffer [Fermentas], 1 ul cut_oligo [10 uM]). Inkubation für 1 min bei 95 ° C. Dann verringern Sie die Temperatur alle 20 sec um 1 ° C bis 25 ° C erreicht sind. </li><li> Add 2 ul BamHI (Fast Fermentas) und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Dann werden 50 ul TE und 0,5 ul glycoblue und mischen. Fügen Sie 10 ul Natriumacetat pH 5,5 und mischen, dann fügen Sie 250 ul 100% Ethanol. Mix wieder und Niederschlag über Nacht bei -20 ° C. </li></ol> 13. PCR-Amplifikation <ol><li> Spin nach unten und waschen Sie die Proben (siehe 10,1), dann das Pellet in 19 ul Wasser. </li><li> Bereiten Sie die PCR-Mix (19 ul cDNA, 1 ul Primer-Mix P5/P3 Solexa, 10 uM jedes, 20 ul Accuprime Supermix 1-Enzym [Invitrogen]). </li><li> Führen Sie den folgenden PCR-Programm: 94 ° C für 2 min, [94 ° C für 15 sec, 65 ° C für 30 sec, 68 ° C für 30 sec] 25-35 Zyklen, 68 ° C für 3 min, 4 ° C für immer. </li><li> Mix 8 ul PCR-Produkt mit 2 ul 5x TBE-Ladepuffer und Last auf einem vorgefertigten 6% TBE-Gel (InvitRogen). Stain das Gel mit SybrGreen I (Invitrogen) und zu analysieren, mit einem Gel-Imager. </li><li> Der Barcode in der Rclip Primer erlauben Multiplex verschiedenen Proben vor der Einreichung für Hochdurchsatz-Sequenzierung. Submit 15 ul der Bibliothek für die Sequenzierung und speichern Sie die Ruhe. </li></ol> 14. Linker und Primersequenzen Pre-adenylierte 3 'Linker-DNA: [Wir bestellen die DNA-Adapter von IDT und dann Aliquots von 20 um.] <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig0.jpg" alt="DNA" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="DNA"> 15. Repräsentative Ergebnisse: Vor Sequenzierung des iClip Bibliothek kann der Erfolg des Experiments auf zwei Schritte überwacht werden: die Autoradiogramm des Protein-RNA-Komplex nach Membran übertragen (Schritt 8,5) und das Gel Bild der PCR-Produkte (Schritt 13,4). Im Autoradiogramm des Low-RNase Proben sollten diffuse Radioaktivität über dem Molekulargewicht des Proteins (Abbildung 2, Probe 4) gesehen werden. Für High-RNase Proben ist diese Radioaktivität konzentriert näher an das Molekulargewicht des Proteins (Abbildung 2, Probe 3). Wenn keine Antikörper in der Immunpräzipitation verwendet wird, sollte kein Signal erkannt wird (Abb. 2, Proben 1 und 2). Weitere wichtige Steuerelemente für die Spezifität der Immunpräzipitation entweder weglassen UV-Bestrahlung oder Zellen, die nicht exprimieren das Protein von Interesse 14. Das Gel Bild der PCR-Produkte (Schritt 13.4) sollte eine Größenordnung, die die cDNA Fraktion (hoch, mittel oder niedrig) in Schritt 11,4 (Abbildung 4, Spuren 4-6) gereinigt entspricht. Beachten Sie, dass die PCR-Primer P3Solexa und P5Solexa eine zusätzliche 76 nt einzuführen, um die Größe der cDNA. Wenn keine Antikörper während der Immunpräzipitation verwendet wird, sollte keine entsprechende PCR-Produkten nachgewiesen werden (Abbildung 4, Spuren 1-3). Primer-Dimer Produkt kann bei etwa 140 nt erscheinen. Für repräsentative Ergebnisse der Hochdurchsatz-Sequenzierung und anschließende bioinformatischen Analysen siehe 14. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Schematische Darstellung der iClip-Protokoll. Protein-RNA-Komplexen sind kovalent in vivo mittels UV-Bestrahlung (Schritt 1)-vernetzt. Das Protein von Interesse ist zusammen mit der gebundenen RNA (Schritte 2-5) gereinigt. Um für die Sequenz-spezifische Grundierung der reversen Transkription wird eine RNA-Adapter an den 3 ligiert 'Ende der RNA, während das 5'-Ende radioaktiv markiert wird (Schritt 6 und 7). Vernetzte Protein-RNA-Komplexe werden von freien RNA mittels SDS-PAGE und Membran übertragen (Schritt 8) gereinigt. Die RNA wird von der Membran durch Verdau des Proteins mit Proteinase K Verlassen eines Polypeptids Verbleib in der Cross-Link Nukleotid (Stufe 9) gewonnen. Reverse Transkription (RT) schneidet bei den restlichen Polypeptid und führt zwei spaltbare Adapter Regionen und Barcode-Sequenzen (Schritt 10). Größe Auswahl entfernt freies RT Primer vor Umlaufverfahren. Die folgenden Linearisierung erzeugt geeignete Vorlagen für die PCR-Amplifikation (Schritte 11-15). Schließlich erzeugt der Hochdurchsatz-Sequenzierung liest, in dem die Barcode-Sequenzen unmittelbar von den letzten Nukleotid der cDNA (Schritt 16). Da diese Nukleotid lokalisiert eine Position vor dem vernetzten Nukleotid kann die Bindungsstelle mit hoher Auflösung abgeleitet werden. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Autoradiogramm vernetzten hnRNP C-RNA-Komplexen mit denaturierende Gelelektrophorese und Membran übertragen. hnRNP C-RNA-Komplexe wurden aus Zellextrakten mit einem Antikörper gegen hnRNP C Immun-gereinigt (α hnRNP C, die Proben 3 und 4). RNA wurde teilweise verdaut mit niedriger (+) oder hohen (+ +)-Konzentration von RNase. Komplexe Verschiebung nach oben aus der Größe des Proteins (40 kDa) zu beobachten (Probe 4). Die Verschiebung ist weniger ausgeprägt, wenn hohe Konzentrationen von RNase verwendet wurden (Probe 3). Das radioaktive Signal verschwindet, wenn keine Antikörper in der Immunpräzipitation verwendet wurde (Proben 1 und 2). <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Schematische 6% TBE-Harnstoff-Gel (Invitrogen) zur Führung der Exzision iClip cDNA-Produkte. Das Gel wird für 40 min bei 180 V führt zu einem reproduzierbaren Migration Muster von cDNAs und Farbstoffe (hell-und dunkelblau) in das Gel laufen. Verwenden einer Rasierklinge zu schneiden (rote Linie) die hohe (H), medium (M) und niedrig (L) cDNA-Fraktionen. Beginnen Sie mit dem Schneiden in der Mitte des hellblauen Farbstoff und unmittelbar oberhalb der Markierung auf der Kunststoff-Gel-Kassette. Teilen Sie die mittleren und niedrigen Fraktionen und schneiden den hohen Anteil von etwa 1 cm oberhalb der leichten blauen Farbstoff. Verwenden Sie vertikale Schnitte durch die Taschen und der Farbstoff geführt, um die verschiedenen Bahnen (in diesem Beispiel 1-4) zu trennen. Der Marker Spur (m) ergibt gebeizt und abgebildet, die KontrolleGrößen nach dem Schneiden. Fragmentgrößen sind auf der rechten Seite angegeben. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Analyse von PCR-amplifizierten iClip cDNA-Bibliotheken unter Verwendung von Gel-Elektrophorese. RNA erholte sich von der Membran (Abbildung 1) wurde revers transkribiert und die Größe der unter Verwendung denaturierende Gelelektrophorese (Abbildung 2). Drei Kornfraktionen von cDNA (hohe [H]: 120-200 nt-, mittel-[M]: 85-120 nt und niedrige [L]: 70-85 nt) wurden gewonnen, zirkularisiert, wieder linearisiert und PCR-amplifiziert. PCR-Produkte von unterschiedlichen Größenverteilung kann als Ergebnis der unterschiedlichen Größen der Eingangs-Fraktionen beobachtet werden. Da die PCR-Primer stellt 76 nt der cDNA sollte Größen zwischen 196-276 nt für hohe, 161-196 nt Bereich für mittlere und 146-161 nt für geringe Größe Fraktionen. PCR-Produkte fehlen, wenn keine Antikörper für die Immunpräzipitation (Spuren 1-3) verwendet wurde.

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Da die iClip Protokoll enthält ein breites Spektrum von enzymatischen Reaktionen und Reinigungsschritte, ist es nicht immer leicht zu einem Problem, wenn ein Experiment nicht zu identifizieren. Um die Spezifität der identifizierten RNA Cross-Link-Sites kontrollieren, sollten eine oder mehrere negative Kontrollen während des gesamten Experiments und anschließender rechnerische Analysen beibehalten werden. Diese Kontrollen können die nicht-Antikörper-Probe, die nicht-vernetzten Zellen oder Immunpräzipitation von Knockout-Zellen oder Gewebe sein. Idealerweise sollten diese Kontrollversuche nicht reinigen jedes Protein-RNA-Komplexen, und sollte daher kein Signal auf dem SDS-PAGE-Gel und keine nachweisbaren Produkte nach PCR-Amplifikation zu geben. Hochdurchsatz-Sequenzierung dieser Kontrolle Bibliotheken zurückgeben sollte nur sehr wenige eindeutige Sequenzen. Knockdown-Zellen sind nicht als Ablaufsteuerung empfohlen, da die resultierenden Sequenzen noch zu vernetzen Standorte des gleichen Proteins, das aus Knockdown-Zellen in kleineren Mengen gereinigt entsprechen. Es sollten Vorkehrungen getroffen werden, um eine Kontamination mit PCR-Produkten aus früheren Experimenten zu vermeiden. Der beste Weg, um dieses Problem zu minimieren, ist räumlich getrennt Pre-und Post-PCR-Schritte. Idealerweise sollte die Analyse der PCR-Produkte und alle nachfolgenden Schritte in einem separaten Raum durchgeführt werden. Darüber hinaus sollte jedes Mitglied der Labor seinen eigenen Satz von Puffern und anderen Reagenzien. Auf diese Weise können Kontaminationsquellen leichter identifiziert werden.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2638">iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution</a>. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to: "...as well as 2 &#x03BC;l Turbo DNase..." instead of: "...as well as 2 ml Turbo DNase..."

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Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

Für Gel-Elektrophorese und die Membran übertragen, empfehlen wir t er Einsatz von XCell SureLock ® Mini-Cell und XCell II ™ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), die mit dem Einsatz der verschiedenen vorgefertigten Minigele, dass in dem Protokoll angegeben werden, ist . Die Marke und die Bestellnummer aller verwendeten Materialien ist bei der Protokoll erwähnt. Die Liste der Enzyme in das verwendete Protokoll ist in der nachfolgenden Tabelle dargestellt. <table border="1"><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Protein A Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 10001D </td><td> Verwendung Protein G für Maus oder Ziegen-Antikörper </td></tr><tr><td> RNase I </td><td> Ambion </td><td> AM2295 </td><td> Aktivität kann von Charge zu Charge ändern </td></tr><tr><td> T4 RNA-Ligase I </td><td> NEB </td><td> M0204S </td><td> </td></tr><tr><td> PNK </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Roche </td><td> 03115828001 </td><td> </td></tr><tr><td> Superscript III-Reverse-Transkriptase </td><td> Invitrogen </td><td> 18080044 </td><td> </td></tr><tr><td> Circligase II </td><td> Epicentre </td><td> CL9021K </td><td> </td></tr><tr><td> FastDigest ® BamHI </td><td> Fermentas </td><td> FD0054 </td><td> </td></tr><tr><td> AccuPrime ™ SuperMix I </td><td> Invitrogen </td><td> 12342010 </td><td> Diese PCR-Mix die besten Ergebnisse in unseren Händen </td></tr></table>

iclip - transkriptom-weiten mapping von protein-rna wechselwirkungen mit individual nucleotide resolution

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

Die einzigartige Zusammensetzung und räumliche Anordnung der RNA-bindende Proteine ​​(RBPs) auf ein Transkript führen die vielfältigen Aspekte der post-transkriptionellen Regulation 1. Daher ist ein wesentlicher Schritt zum Verständnis Transkript Regulierung auf der molekularen Ebene bis Positionsinformationen auf die Bindungsstellen der RBPs 2 Gain. Protein-RNA Wechselwirkungen untersucht mit Hilfe biochemischer Methoden, aber diese Ansätze beziehen sich nicht auf RNA-Bindung in seiner nativen zellulären Kontext. Erste Versuche zur Protein-RNA-Komplexen in ihrer zellulären Umgebung Studie beschäftigt Affinitätsreinigung oder Immunpräzipitation mit Differential-Display-oder Mikroarray-Analyse (RIP-CHIP) 3-5 zusammengefasst. Diese Ansätze waren anfällig für die Identifizierung indirekte oder nicht-physiologischen Wechselwirkungen 6. Um die Spezifität und Ortsauflösung zu erhöhen, bezeichnet eine Strategie, um als CLIP (UV-Vernetzung und Immunpräzipitation) 7,8 eingeführt wurde. CLIP kombiniert UV-Vernetzung von Proteinen und RNA-Moleküle mit rigorosen Reinigung Systeme einschließlich denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese. In Kombination mit High-Throughput-Sequenzierung Technologien hat CLIP als ein mächtiges Werkzeug, um Protein-RNA-Wechselwirkungen auf einem genomweiten Maßstab (bezeichnet als HITS-CLIP oder CLIP-seq) 9,10 Studie unter Beweis gestellt. Kürzlich wurde PAR-CLIP eingeführt, photoreaktiven Ribonukleosid Analoga verwendet zur Vernetzung 11,12. Trotz der hohen Spezifität der erhaltenen Daten, CLIP Experimente erzeugen oft cDNA-Bibliotheken von begrenzter Komplexität Folge. Dies ist zum Teil aufgrund der beschränkten Menge an Co-gereinigten RNA und die beiden ineffizient RNA Ligationsreaktionen für Bibliotheks-Vorbereitung erforderlich. Darüber hinaus gaben Primer Extension Assays, dass viele cDNAs vorzeitig abgeschnitten bei den vernetzten Nukleotid 13. Solche abgeschnitten cDNAs sind während der Standard-CLIP-Bibliothek Vorbereitung Protokoll verloren. Wir haben vor kurzem iClip (Einzel-Nukleotid-Auflösung CLIP), der die abgeschnittenen cDNAs erfasst durch den Ersatz eines der ineffizienten intermolekularen RNA Ligationsschritten mit einer effizienteren intramolekularen cDNA Umlaufverfahren (Abbildung 1) 14 entwickelt. Wichtig ist, dass die Sequenzierung des abgeschnitten cDNAs bietet Einblicke in die Position des Cross-Link-Website unter Nukleotid-Auflösung. Wir haben erfolgreich angewendet iClip zu hnRNP C Partikel Organisation auf einem genomweiten Maßstab Untersuchung und Bewertung ihrer Rolle in Spleißen Regel 14.

Die räumliche Anordnung der RNA-bindenden Proteinen auf eine Abschrift ist eine wichtige Determinante der post-transkriptionellen Regulation. Deshalb entwickelten wir individuelle-Nukleotid-Auflösung UV-Vernetzung und Immunpräzipitation (iClip), die eine präzise genomweite Kartierung der Bindungsstellen eines RNA-bindenden Proteins erlaubt.

iClip - Transkriptom-weiten Mapping von Protein-RNA Wechselwirkungen mit Individual Nucleotide Resolution

Die einzigartige Zusammensetzung und räumliche Anordnung von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) auf einem Transkript steuern die vielfältigen Aspekte der posttranskriptionalen ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine transkriptomweite Karte der Bindungsstellen eines RNA-Bindungsproteins mit einzelner Nukleotidauflösung zu erhalten. Dazu wird als zweiter Schritt eine UV-Bestrahlung lebender Zellen durchgeführt, um Proteine und RNA in vivo kovalent zu vernetzen. Das RNA-Bindungsprotein wird unter strengen Bedingungen immunpräzipitiert, um die vernetzten RNA-Fragmente anzureichern.Die anschließende Reverse Transkription erzeugt cDNAs, die häufig an dem angebundenen Peptid abgeschnitten werden, wodurch die Information über die Vernetzungsposition innerhalb der RNA erhalten bleibt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen alle Bindungsstellen innerhalb des Transkriptoms, basierend auf der Hochdurchsatzsequenzierung der cDNA-Bibliothek. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der RNA-Biologie zu beantworten, beispielsweise wie das Zusammenspiel verschiedener RNA-bindender Proteine die RNA-Prozessierung reguliert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir sowohl die Leistungsfähigkeit als auch die Auflösung unserer transkriptomweiten Karten der Protein-RNA-Interaktionen erhöhen. Um mit dem Verfahren der UV-Vernetzung von Zellkulturzellen zu beginnen.Entfernen Sie das Medium von einer 10 cm großen Platte mit Healer-Zellen. Geben Sie sechs Milliliter eiskalte PBS hinzu und stellen Sie die Platten auf Eis. Eine Platte reicht für drei Experimente aus.Entfernen Sie den Deckel und bestrahlen Sie die Zellen, einmal mit 254 Nanometern bei 150 Millijoule pro Quadratzentimeter. Sammeln Sie die Zellen, indem Sie sie mit einem Zellabstreifer von den Platten abkratzen, und überführen Sie zwei Milliliter Zellsuspension in jeweils drei Mikroröhrchen, um die Zellen zu pelletieren. Zentrifugieren Sie sie für 10 Sekunden bei maximaler Drehzahl bei vier Grad Celsius.Entfernen Sie dann die Supinatschnappe, gefrieren Sie die Zellpellets auf Trockeneis ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius bis zur Verwendung. Geben Sie 100 Mikroliter Protein A Dynabeads pro Experiment in ein frisches Mikroröhrchen. Wenn Sie mit Maus- oder Ziegenantikörpern arbeiten, verwenden Sie Protein G Dynabeads.Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit Lysepuffer, der im beigefügten schriftlichen Protokoll zu finden ist. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 Mikrolitern Lysepuffer mit zwei bis 10 Mikrogramm Antikörper. Drehen Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur 30 bis 60 Minuten lang. Waschen Sie die Kügelchen anschließend dreimal mit 900 Mikrolitern Lysepuffer und lassen Sie sie im letzten Waschschritt zurück, bis Sie fortfahren möchten. Führen Sie die Immunpräzipitation von Thor-Zellkomplexen auf Eis durch. Resuspendieren Sie in einem Milliliter Lysepuffer und überführen Sie die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen.Stellen Sie eine Verdünnung von RNA eins im Verhältnis 1:500 her. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter zusammen mit zwei Mikrolitern Turbo-DNase zum Zelllysat. Inkubieren Sie die Proben genau drei Minuten bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 1.100 Umdrehungen pro Minute und stellen Sie sie anschließend sofort auf Eis.Danach die Proben bei vier Grad Celsius und 22.000 × g für 20 Minuten zentrifugieren, um das Lysat zu klären; sammeln Sie vorsichtig das Überstand, wobei etwa 50 Mikroliter Lysat mit dem Pellet verbleiben, um die Perlen immunpräzipitativ zu behandeln. Entfernen Sie den Waschpuffer und geben Sie dann die vorbereiteten Zelllysate hinzu. Inkubieren Sie die Proben unter Schwenken zwei Stunden bei vier Grad Celsius.Entsorgen Sie das SUP-Reagenz und waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 900 Mikrolitern Puffer mit hohem Salzgehalt, der in der beigefügten schriftlichen Anleitung zu finden ist. Waschen Sie die Kügelchen abschließend zweimal mit 900 Mikrolitern Waschpuffer. Fahren Sie dann mit der Dephosphorylierung fort und fügen Sie einen Linker an die drei-prim-Enden der RNA hinzu.Um die RNA an den 5'-Enden zu markieren, hinter einem Plexiglasschild arbeiten. Die Überstände der letzten Waschung der Linkerligationsreaktion entfernen und die Pellets in acht Mikrolitern heißer PNK-Mischung resuspendieren. Fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.Entfernen Sie die heiße PNK-Mischung und wiederverwenden Sie sie. Suspendieren Sie die Kügelchen in 20 Mikrolitern eines frischen 1× PAGE-Ladepuffers. Inkubieren Sie anschließend die Probe 10 Minuten lang bei 70 Grad Celsius in einem Thermomischer.Stellen Sie die Probe sofort auf einen Magneten, um die leeren Perlen auszufällen. Laden Sie die Proben auf ein 4–12%-New-Page-Bis-Gel gemäß den Anweisungen des Herstellers auf. Außerdem fünf Mikroliter eines vorgefärbten Protein-Größenmarkers laden. Das Gel 50 Minuten lang bei 180 Volt laufen lassen. Die Protein-RNA-Komplexe mithilfe der NOVA-Blottingvorrichtung für Nassübertragung gemäß den Herstelleranweisungen vom Gel auf eine Nitrocellulosemembran übertragen.Nach der Übertragung die Membran in PBS-Puffer spülen. Anschließend in Frischhaltefolie einwickeln und bei minus 80 Grad Celsius dem Film aussetzen. Belichtungen für 30 Minuten, eine Stunde und über Nacht durchführen.Als Nächstes isolieren Sie den Membranbereich entsprechend den Protein-RNA-Komplexen von den niedrigmolekularen RNAs. Führen Sie das Experiment unter Verwendung des Autoradiogramms als Maske durch. Gewinnen Sie die RNA aus der Membran durch Proteinase-K-Digestion und Phenol-Chloroform-Extraktion zurück.Transkribieren Sie die RNA mit einem der AYP-Primer, um die CDNA per Gelelektrophorese zu reinigen. Mischen Sie sechs Mikroliter der CDNA-Probe mit sechs Mikrolitern zweifach konzentrierter TBE-Harnstoff-Laufpufferlösung. Direkt vor dem Auftragen der Proben auf ein Gel.Erhitzen Sie die Proben auf 80 Grad Celsius für drei Minuten. Anschließend laden Sie die Proben zusammen mit einem Marker für niedriges Molekulargewicht auf ein vorgefertigtes 6 % TBE-Harnstoffgel auf. Lassen Sie das Gel 40 Minuten lang bei 180 Volt laufen, wie vom Hersteller beschrieben, und verwenden Sie den oberen Farbstoff und die Markierungen am Kunststoffgelträger als Orientierungshilfe für die Ausschneidung.Schneiden Sie drei Banden bei 120 bis 200 Nukleotiden, 85 bis 120 Nukleotiden und 70 bis 85 Nukleotiden aus. Beachten Sie, dass der Arc-Lip-Primer und die L3-Sequenz zusammen 52 Nukleotide der CLIP-Sequenz ausmachen. Geben Sie 400 µL TE hinzu und zerkleinern Sie den Gelstück in kleine Stücke.Unter Schütteln mit 1.100 Umdrehungen pro Minute für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius die Gelecken mit einem Eins-Milliliter-Spritzenstößel inkubieren. Zwei ein Zentimeter große Glas-Vorfilter in eine CoStar Spinx-Säule geben. Den flüssigen Anteil der Probe in die Säule überführen und eine Minute bei 13.000 Umdrehungen pro Minute in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen zentrifugieren.Fügen Sie 0,5 µL Glyco-Blau und 40 µL Natriumacetat pH 5,5 hinzu. Anschließend mischen Sie die Probe. Geben Sie ein Milliliter 100 %igen Ethanol hinzu.Mischen Sie erneut und präzipitieren Sie die Probe über Nacht bei minus 20 Grad Celsius. Schließen Sie schließlich die cDNA-Moleküle kreisförmig, um die Adapterregion an das 5'-Ende anzubinden. Danach wieder linearisieren und PCR-amplifizieren gemäß dem beigefügten schriftlichen Protokoll, bevor die Sequenzierung der Eye-Clip-Bibliothek erfolgt. Der Erfolg des Experiments kann in zwei Schritten überwacht werden.Das Autoradiogramm des Protein-RNA-Komplexes nach Membrantransfer und das Gelelektrophoresebild der PCR-Produkte im Autoradiogramm der RNA-armen Proben zeigen bei RNA-reichen Proben eine diffuse Radioaktivität oberhalb des Molekulargewichts des Proteins. Diese Radioaktivität ist bei RNA-reichen Proben näher am Molekulargewicht des Proteins lokalisiert. Wird bei der Immunpräzipitation kein Antikörper verwendet, sollte kein Signal nachweisbar sein.Weitere wichtige Kontrollen zur Spezifität der Immunpräzipitation bestehen entweder im Einsatz von UVE-Bestrahlung oder in der Verwendung von Zellen, die das Protein von Interesse nicht exprimieren. Das Gelelektrophoresebild der PCR-Produkte sollte einen Größenbereich zeigen, der der cDNA-Fraktion entspricht. Beachten Sie, dass die PCR-Primer P drei Celexa und P fünf Celexa zusätzliche 76 Nukleotide zur Größe der cDNA hinzufügen. Wenn während der Immunpräzipitation kein Antikörper verwendet wird, sollte kein entsprechendes PCR-Produkt nachweisbar sein.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass jeder der 64 Schritte entscheidend ist und mit hundertprozentiger Genauigkeit durchgeführt werden muss. ICL-Daten können rechnergestützt mit transkriptomweiten Funktionsanalysen integriert werden. Dies kann beispielsweise Einblicke in die positionsabhängige Regulation der RNA-Verarbeitung liefern.Für die computergestützte Datenanalyse verweisen wir auf unsere jüngsten Publikationen in Zusammenarbeit mit Nicholas KA vom European Bioinformatics Institute und bla zupan von der Universität Liana. Nun ist es an der Zeit, dass Sie mit Ihren eigenen Experimenten beginnen. Viel Spaß.

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iClip - Transkriptom-weiten Mapping von Protein-RNA Wechselwirkungen mit Individual Nucleotide Resolution

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