Ein Optic Nerve Crush Injury Mausmodell zur retinalen Ganglienzellen Survival Study

Dieses Verfahren demonstriert die Verletzung der Sehnervenquetschung und die anschließende Analyse des Überlebens von retinalen Ganglienzellen in einem Mausmodell. Dies wird durch die Injektion eines Fluoreszenzfarbstoffs in den Colliculus superior erreicht. Am ersten Tag ist die DI retrograd und wird zu den retinalen Ganglienzellen transportiert, um diese Zellpopulation in einem zweiten Schritt zu markieren.

Am vierten Tag wird eine Quetschverletzung des Sehnervs durchgeführt, um eine Degeneration des Sehnervs zu verursachen, die zu einem allmählichen Absterben der retinalen Ganglienzellen führt. Am Tag 11 wird die Netzhaut präpariert, um das Überleben der retinalen Ganglienzellen zu untersuchen. Das Ergebnis dieses Verfahrens zeigt die Anzahl der verbleibenden lebensfähigen retinalen Ganglienzellen auf der Grundlage eines mittels Fluoreszenzmikroskopie durchgeführten Berichts von flora Gold-markierten retinalen Ganglienzellen.

Hallo, ich bin von Dr.Lab im National Eye Institute, NIH. Jetzt zeige ich Ihnen, wie Sie das Modell der optischen Nervenunfallverletzung der Maus durchführen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine einfache, stabile und effiziente Möglichkeit bietet, Gangling-Zellen der Netzhaut zu markieren und das Überleben oder die Degeneration der optischen Quetschverletzung zu untersuchen.

Diese Messung kann helfen, wichtige Fragen im Bereich des optischen Neuros, wie z. B. das Glaukom, zu beantworten. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie, wenn wir eine Behandlung wie Wachstumsfaktoren oder einige Rezeptoragonisten oder -inhibitoren vor oder gleichzeitig mit dem Zusammenstoß des Sehnervs anwenden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten Blutungen treten häufig am Anfang auf, da die optischen Blutgefäße sichtbar sind.

Daher ist die visuelle Demonstration dieser Methode von entscheidender Bedeutung, da der Teil der Sehnervengarage schwer zu erlernen ist. Die Praxis würde es jedoch einfacher machen, nachdem die Maus mit einem zugelassenen Anästhetikum tief betäubt wurde. Rasieren Sie die Haare auf dem Kopf um den Bereich der Inzisionsstelle.

Setzen Sie die Maus vorsichtig in das stereotaktische Gerät ein und stellen Sie sicher, dass der Kopf stabil steht. Desinfizieren Sie die Kopfhaut jeweils dreimal mit Jod und einer 70%igen Alkohollösung, abwechselnd mit jeder Lösung. Machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen sagittalen Schnitt in der Kopfhaut, um den Schädel freizulegen.

Reinigen Sie den Schädel mit 3% Wasserstoffperoxid. Identifizieren Sie dann bgma an der Stelle, an der die sagittale Naht die koronale Naht am Schädel schneidet. Messen Sie 2,9 Millimeter posterior und 0,5 Millimeter laterales Torema.

Und markieren Sie diesen Punkt, bohren Sie vorsichtig ein kleines Loch an der Stelle der zweiten Markierung. Tragen Sie während des Bohrens Kochsalzlösung auf die Stelle auf, an der das Loch gebohrt wird, um eine sekundäre Wärmeschädigung zu vermeiden. Sobald ein geeignetes Loch gebohrt wurde, positionieren Sie eine Hamilton-Spritze über dem Loch.

Stellen Sie sicher, dass die Nadel einen freien Durchgang durch die Hirnhäute hat, und senken Sie die Spitze der Spritze bis zu einer Tiefe von 1,6 Millimetern von der Gehirnoberfläche ab. Injizieren Sie dann sehr langsam mit einer Flussrate von 0,2 Mikrolitern pro Minute einen Mikroliter Fluorgold Neural Tracer Farbstoff in den Colliculus superior. Lassen Sie die Nadel fünf Minuten lang an Ort und Stelle sitzen, um zu verhindern, dass das Fluorgold entlang der Nadelbahn nach oben diffundiert.

Ziehen Sie anschließend die Nadel vorsichtig zurück und verschließen Sie die Schnittstelle mit Nähten. Lösen Sie dann die Maus aus dem stereotaktischen Gerät. Verabreichen Sie eine subkutane Injektion von Buprenorphin zur Analgesie.

Bewegen Sie die Maus an einen warmen, trockenen Ort. Überwachen Sie das Tier, bis es in der Lage ist, eine aufrechte Haltung einzunehmen. Geben Sie es dann für die ersten drei Tage nach dem Etikettierungsvorgang in den Heimkäfig zurück.

Systemische Analgetika und topische Antibiotikasalben werden zweimal täglich verabreicht und die Maus wird engmaschig überwacht. Drei Tage nach der Tracer-Farbstoff-Injektion wird die Maus mit einem zugelassenen Anästhetikum tief betäubt. Legen Sie die Maus unter das Präpariermikroskop und senden Sie sie an die Maus, um das Auge sichtbar zu machen.

Verwenden Sie eine Federschere, um die Bindehaut des linken Auges in der Vier-Uhr-Position einzuschneiden. Präparieren Sie anschließend vorsichtig die Augenhöhlenmuskulatur und bewegen Sie sie zur Seite. Darauf achten, dass keine Blutgefäße beschädigt werden.

Legen Sie den weißen Sehnerv auf Höhe seines Austritts aus dem Augengloben frei. Dann mit einer Kreuzschlagzange. Zerquetschen Sie den Sehnerv in einem Abstand von zwei Millimetern vom Augapfel und üben Sie drei Sekunden lang Druck aus.

Nach Abschluss der Quetschverletzung den Sehnerv mit dem verschobenen Gewebe und der Bindehaut abdecken und mit 10 Seidennahtmaterial der Größe Null vernähen. Tragen Sie nach dem Nähen und bevor sich die Maus von der Narkose erholt, etwas antibiotische Augensalbe auf die Augen auf und verabreichen Sie eine Injektion von Buprenorphin zur Analgesie. Bewegen Sie die Maus schließlich in einen warmen und trockenen Erholungsbereich.

Überwachen Sie das Tier, bis es sich ausreichend von der Narkose erholt hat, um eine aufrechte Haltung einzunehmen. Setzen Sie das Tier dann wieder in den heimischen Käfig ein. Stellen Sie sicher, dass das Tier engmaschig überwacht wird, und verabreichen Sie zweimal täglich systemische Analgetika und topische Antibiotika.

In den ersten drei Tagen nach der Sehnervenquetschung wurde die Netzhaut sieben Tage nach der Sehnervenquetschung entnommen. Nachdem Sie die Maus durch Kohlendioxid, Erstickung und Gebärmutterhalsdislokation eingeschläfert haben, verwenden Sie eine Pinzette, um die Augen zu entkernen, indem Sie Druck auf die Augenhöhle ausüben. Tauchen Sie die Augen zwei Stunden lang in 4%para Formaldehyd, um sie zu fixieren.

Entfernen Sie dann das 4%para-Formaldehyd und waschen Sie die Augen dreimal in PBS. Nach der Fixierung präparieren Sie die Netzhaut. Gemäß dem zuvor veröffentlichten Protokollbild kann aus diesen Bildern die überlebenden lebensfähigen retinalen Ganglienzellen in definierten Bereichen der Netzhaut unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops berechnet werden, die Dichte der retinalen Ganglienzellen in jeder Region.

Dieses Mikroskopbild zeigt eine fixierte, abgeflachte und montierte Netzhaut. Dieses Bild zeigt die mit Flora Gold markierten retinalen Ganglienzellen vor einer Verletzung des Sehnervenquetsches in einer unverletzten normalen Netzhaut. Die retinalen Ganglienzellen wurden retrograd markiert und mit grüner Flora markiert, einem goldenen neuralen Tracer-Farbstoff, der in den Colliculus superior injiziert wird.

Dieses Bild zeigt die mit Flora Gold markierten retinalen Ganglienzellen sieben Tage nach der Verletzung der Sehnervenquetschung. Verglichen mit dem bisherigen Bild von retinalen Ganglienzellen in der unverletzten normalen Netzhaut ist die Anzahl lebensfähiger retinaler Ganglienzellen in der Netzhaut mit einer Sehnervenquetschverletzung signifikant geringer. Sobald die Markierung der retinalen Ganglienzellen im ersten Teil erfolgt ist, kann sie in 20 Minuten erfolgen.

Der zweite Teil, der Absturz des Sehnervs, kann in fünf Minuten durchgeführt werden, während Sie dieses Verfahren versuchen, es ist wichtig, nicht zu viel Kraft anzuwenden und nicht zu lange abzustürzen, da dies zu einer Schädigung der Augenarterie unter dem Sturz führen kann. Anschließend ist die Netzhaut, das Spiegelmodell der optischen Nervenunfallverletzung, nützlich, um den Prozess des retinafarbenen Ganglions, des Zelltods und des Überlebens zu untersuchen. Dieses Modell wird auch häufig verwendet, um die Wirkung verschiedener Regionen und der Gene auf retinale Ganglionen, Zellen und Proptosis und das Überleben zu untersuchen.

Ein Vorteil dieses Modells ist, dass es ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit aufweist, also viel Glück bei der Arbeit.