Name: Eine Methode zur Ovarialfollikel Encapsulation und Kultur in einem Proteolytisch Degradable 3 Dimensional-System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Erfahren Sie die Kapselung von Ovarialfollikeln in einem 3D-Fibrin-Alginate-Netzwerk zur In-vitro-Kultur. Diese Methode unterstützt das Wachstum unreifer Follikel zu reifen Eizellen.

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Diese Arbeit wurde vom NIH (U54HD41857 und PL1EB008542, ein P30 Biomaterialien Kern innerhalb der Oncofertility Consortium Roadmap Zuschuss) gefördert.

1. Follikel Isolation Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die National Institutes of Health Guide Set für die Pflege und Verwendung von Labortieren und die etablierten institutionellen Tiere Benutzung und Pflege-Protokoll an der Northwestern University durchgeführt. Für optimale Ergebnisse sind alle Sektionen in L15 Medien zur pH-Kontrolle bei Umgebungstemperaturen von CO 2 durchgeführt, auf 37 ° C erhitzt, Stadien für die Temperaturregelung und auf einer sauberen Werkbank, um bakterielle Verunreinigungen zu minimieren. Die Dissektion Medien (DM) ist mit L15-Medien mit 50 IU / mL Penicillin und 50 &amp;mgr; l / ml Streptomycin und 1% FBS vorbereitet. Die Wartung Medien (MM) ist mit αMEM Medien mit 50 IU / mL Penicillin und 50 &amp;mgr; l / ml Streptomycin und 1% FBS vorbereitet. <ol><li> Transfer frisch präparierten Ovarien von 16 Tage alten Maus in eine neue 35-mm-Petrischale mit 1-2 mL MM mit 0,1% Collagenase und 0,1% DNase. Inkubieren für 15 Minuten in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Nach der Inkubation, führen mehrere Waschschritte in DM um Kollagenase zu entfernen, und dann übertragen auf eine 35 mm Petrischale mit frischem DM. Isolieren Follikel aus dem Eierstock durch leichtes Schnippen (oder Schneiden) Follikel weg von den ganzen Eierstock mit zwei 28 8.5 Gauge-Nadeln an Einwegspritzen. Entfernen Sie so viel Stroma wie möglich, ohne die Integrität der Follikel. Herauspräparieren 20-40 sekundären Follikel pro Ovar (130-150mm). Diese Follikel haben in der Regel 2-3 Schichten von somatischen Zellen. </li><li> 1 ml MM an die zentrale Vertiefung einer 60 mm IVF (In-vitro-Fertilisation) Petrischale und 3 mL MM mit dem Außenring. Transfer intakter Follikel mit einer Pipette auf den äußeren Ring des IVF Schüssel kurz abspülen und dann selektiv übertragen sie in die zentrale Vertiefung (siehe 1.4). Bewahren Sie diese IVF Gericht in den Inkubator. </li><li> Nach all den Follikel erhoben werden, erfolgt die Auswahl Schritt unter einem Binokular mit einem 5-8fache Vergrößerung durchgeführt. Gesunde Follikel haben folgende morphologische Merkmale: <ul><li> 2-3 somatische Zellschichten </li><li> 130-150 mm </li><li> Keine Trennung zwischen Oozyte und somatischen Zellen </li><li> Intakte und rund Oozyten Übertragen Sie die gesunde Follikel in das Zentrum der IVF Gerichte für die Verkapselung. </li></ul></li></ol> 2. Follikel Encapsulation, Methode 1 - "The Drop-Methode" <ol><li> 1 ml von 50 IU / ml Thrombin in TBS mit 40 mM CaCl 2 in die Mitte und der IVF Gericht. Tauwetter und halten Fibrinogen Lager (50 mg / mL in TBS) auf Eis. Bringen Sie das Fibrinogen auf Raumtemperatur rechts vor dem Gebrauch. </li><li> Bereiten Sie die Fibrinogen / Alginat-Lösung durch Mischen 1x PBS, 0,5% Alginat in PBS-Lösung und 50 mg / mL Fibrinogen-Lösung bei einem Verhältnis 2:1:1 in einer 1,7 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen. Vermeiden Sie die Einführung Blasen in der Lösung. Vorsichtig vortexen und Spin-down. Die Lösung erscheint leicht bewölkt und sollte unmittelbar vor Gebrauch vorbereitet werden. </li><li> Legen Sie zwei Tropfen von Fibrinogen / Alginat-Lösung in den äußeren Ring einer IVF Gericht: eine 90 ul Tropfen für die Verkapselung und 10 ul Tropfen zum Waschen. Zur Verringerung Verdunstung, schalten Sie die Heizung Etappe auf dem Binokular. Transfer 10-15 Follikel in den 10 l Tropfen mit einer minimalen Menge von Kulturmedien (&lt;5 ul) mit einem 200 um Mikropipette Spitze, und schnell mischen. Übertragen Sie alle der Follikel in den 90 ul Tröpfchen mit einer minimalen Menge der Lösung (&lt;5 ul) aus dem ersten Tropfen, und mischen. </li><li> Gleichzeitig absaugen ein Follikel und 5 ul Fibrinogen / Alginat-Lösung mit einem 10 ul Pipettenspitze und Freisetzung in die Thrombin / Ca 2 +-Lösung in der IVF Gericht. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle die Follikel gekapselt sind. </li><li> Cross-Link die Perlen für 5-7 Minuten in der Thrombin / Ca 2 +-Lösung. Die Perlen wird dunkler als Fibringele. Übertragen Sie die Perlen in eine Petrischale mit MM, beginnend mit den dunkleren Perlen zuerst. Inkubieren Sie die Schale für 15-30 Minuten inder Inkubator abzuspülen die restlichen Thrombin. </li><li> Übertragen Sie die Perlen in einer 96-well-Kulturplatte mit 100 ul Follikelwachstum Medien und das Bild sofort. Das Wachstum Medien (GM) ist mit αMEM Medien mit 10 mIU / ml rekombinantes FSH, 3 mg / ml BSA ergänzt vorbereitet, 1 mg / ml bovinem Fetuin, 5 g / ml Insulin, 5 ug / ml Transferrin, und 5 ng / ml Selen. </li></ol> 3. Follikel Encapsulation, Methode 2 - "Der Parafilm Method" <ol><li> Bereiten Sie die Fibrinogen / Alginat-Lösung durch Mischen von 0,5% Alginat-Lösung und 50 mg / mL Fibrinogen-Lösung im Verhältnis 1:1 in einem 1,7 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Pipette 7,5 ul Tropfen der Fibrinogen / Alginat-Gemisch auf einem Parafilm beschichteten Objektträger mit 3 mm Abstandhalter. Transfer 1 Follikel in jedem Tropfen mit einem minimal Höhe von Medien. </li><li> Add 7,5 ul von Thrombin / Ca 2 +-Lösung, um jeden Tropfen. Das Mischen ist nicht erforderlich, da das Gel bildet fast augenblicklich. </li><li> Decken Sie die Gele mit dem zweiten Parafilm beschichteten Objektträger, legen Sie die Folien auf den Kopf in eine 100 mm Petrischale und Transfer in den Inkubator für 5 Minuten. </li><li> Übertragen Sie die Perlen in eine Petrischale mit MM, und dann in die Kultur gut wie zuvor beschrieben. Wenn die Perlen aneinander haften, die durch Vernetzung zwischen den Kügelchen ist, kann sie vorsichtig mit einer Pinzette getrennt werden. </li></ol> 4. Follikel Imaging and Media ändern <ol><li> Alle 2 Tage werden die kultivierten Follikel aufgenommen mit einem Lichtmikroskop und dem Follikel Durchmesser ist mit dem Software-Programm ImageJ gemessen. </li><li> Alle 2 Tage wird die Hälfte des Wachstums Medien (50 ul) durch frische, voräquilibriert Wachstum Medien ersetzt. </li></ol> 5. Follikel Erholung von der 3D-Matrix-und in vitro Eizellreifung (IVM) <ol><li> Nach 8 Tagen der Kultur erscheinen die Hydrogele klar durch Abbau des Fibrins Komponente vollständig, und die Follikel mit einem Durchmesser von 300-400 mu m zu erweitern. Die restlichen Alginat abgebaut wird Alginat-Lyase, einem pflanzlichen Enzym, das spezifisch degradiert Alginat und hat keinen Einfluss auf tierische Zellen. </li><li> Entfernen Nährmedien aus Brunnen mit den Perlen und 100 ml 10 IU / mL Alginat-Lyase in αMEM. Lassen Sie die Platte in den Brutschrank für 25-30 Minuten. </li><li> Entfernen Follikel aus dem aufgelösten Kügelchen mit einem stumpfen Ende Spitze. Transfer ersten bis zum äußeren Ring einer IVF Schale mit DM, und dann in der Mitte gut, auch mit DM zu waschen. </li><li> Nach dem Waschen, Transfer der Follikel auf die äußere und dann Innenring eines IVF Schale mit Reifung Medien. In-vitro-Maturation Medien (IVM) ist der αMEM, 10% FCS, 1,5 IU / mL hCG zusammengesetzt, und 5 ng / mL des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) </li><li> Transfer zum CO 2-Inkubator für 15-16 Stunden. Untersuchen Sie die Follikel für Kumuluszellen Expansion. Um die Cumulus-Zellen, die aus der Eizelle entfernt, hinzugefügt Hyaluronidase Lösung Endkonzentration 0,1 mg / mL und inkubieren in den Inkubator für 2-3 Minuten. Verwenden Sie eine 75 mm Mikropipette Spitze zu scheren die Cumulus-Zellen aus der Eizelle durch Auf-und Abpipettieren mehrmals. Bestimmen Sie Reifungsphase der Eizelle unter einem Licht oder einem Binokular. Die möglichen Stufen, von der geringsten zur höchsten Reife, sind: <ul><li> Degeneriert. Die Eizelle wird in zwei oder mehr Stücke zersplittert. </li><li> Keimbläschen (GV) der Bühne. Die Eizelle nicht wieder Meiose in Reaktion auf hCG Exposition, was sich durch die fortgesetzte Präsenz der Kern der Eizelle (GV) ist. </li><li> Keimbläschen Aufschlüsselung (GVBD). Die Kernmembran fehlt die Eizelle, aber es gibt keinen Polkörper vorhanden. Daher ist die Eizelle noch in der Meiose-I. </li><li> Metaphase-II verhaftet Eizelle (MII). Die Eizelle wieder Meiose, und ist nun in der Metaphase-II verhaftet. Ein Polkörper sichtbar sein soll auf einem hellen oder einem Binokular. Die Eizelle wird bei MII bleiben, es sei denn in späteren Experimenten befruchtet. </li></ul></li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Wir beschrieben eine neuartige Verkapselung Methode der Eibläschen in einem FA-IPN für In-vitro-Kultur (Abb. 1). Eibläschen bestehen aus einer Eizelle durch mehrere Schichten von somatischen Zellen umgeben. Die Kommunikation zwischen den mehreren zellulären Kompartimenten ist wichtig für gesunde Follikel Entwicklung und Eizellreifung. Follikel Kapselung in einer 3D-Hydrogel unterstützt Follikel Expansion unter Beibehaltung der Architektur des Follikels 9,11,12. Als Follikel entwickeln, baut ihr Volumen exponentiell und die Verkapselung von Biomaterial sollte diese Expansion ohne die Entwicklung einer Hemmung der Druckkraft zu ermöglichen. FA-IPN ist ein Netzwerk von zwei natürlichen Materialien, in denen Fibrin proteolytisch abbaubar durch Plasmin aktiviert durch die Follikel und Alginat ist biologisch inert 13 (Abbildung 2) gebaut. Während das Wachstum der Follikel, beginnt Fibrinabbauprodukten lokal in der Nähe der Follikel, und dauert bis das Fibrin aus dem Hydrogel deaktiviert ist. Die nicht-abbaubaren Alginat-Komponente, die intakt in die Kultur Zeit bleibt, unterstützt die 3D-Struktur des Hydrogels. Follikel wurden in der zweiten Stufe der Entwicklung (150-180 Mikrometer Durchmesser) isoliert und erweitert, um 400 um die antral Stadium der Entwicklung in den FA-IPN-Gelen. Mit hCG Stimulation kann der kultivierte Follikel unterziehen cumulus Zellexpansion und Eizellen können Meiose und Fortschritt zu Metaphase II wieder für die Befruchtung. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Kapselung Methode und das Einkapselungsmaterial Follikel Kultur und erfolgreiche Reifung in vitro (Abbildung 3) erlaubt. Fibrinabbauprodukten rund um die encapsulEINZELNEN SEKTOREN Follikel beginnt am ersten Tag der Kultur und wird von Tag 6 abgeschlossen. Aprotinin, einem löslichen Plasmin-Inhibitor, kann verwendet werden, um Fibrinabbauprodukten ändern und mechanische Gradienten in das Einkapselungsmaterial (Abbildung 4) zu verlängern. Wenn Follikel mit 0,01 TIU / mL Aprotinin kultiviert werden, ist das Fibrin abgebaut langsamer in den ersten 4 Tagen. Dennoch ist die Follikel noch die antral Bühne entwickeln und Eizellen zuständig bleiben, um die Meiose zu Metaphase II fortgesetzt, nachdem Aprotinin removed.A hohe Konzentration von Aprotinin (0,1 TIU / mL) deutlich hemmt Fibrinabbauprodukten verhindert Matrix Steifigkeit Follikel Expansion und somatischen Zellen Invasion in der Matrix zu beobachten ist. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Flowchart der Follikelentwicklung. Die Ovarialfollikel besteht aus einem zentral gelegenen Eizelle durch eine oder mehrere Lagen von somatischen Zellen, die Eizelle Entwicklung zu unterstützen umgeben. Als Follikel aus sekundären den präovulatorischen antral Bühne entwickeln, vermehren sich die somatischen Zellen rund um die Eizelle und zu differenzieren, und die Eizelle an Größe zunimmt. In-vitro-Maturation (IVM) ist der letzte Schritt für die Follikel Kultur, wenn die somatischen Zellen mit den benachbarten Eizelle bezeichnet Kumuluszellen nach hCG Stimulation zu erweitern, und die Eizelle wieder Meiose und schreitet zu einem Metaphase II (MII) Bühne. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2a.jpg" alt="Abbildung 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2a"> Abbildung 2a. Alginat und Fibrin-Alginat für 3D-Follikel Kultur in vitro. (A) Alginat ist ein natürliches Biomaterial, geeignet für in-vitro-Kultur Follikel wegen seiner sanften Gelierung und biochemischen Eigenschaften, wie Maschenweite, steuerbare Steifigkeit und biologischen Inertheit. Alginat ist ein lineares Polysaccharid Copolymer aus α-L-Guluronsäure (G) und β-D-Mannuronsäure (M). Bereiche mit sich wiederholenden G Monomeren, genannt "G-Blöcke", sind vernetzt, um ein Hydrogel, in Gegenwart von zweiwertigen Calcium-Ionen bilden. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2b.jpg" alt="Abbildung 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2b"> Abbildung 2b. (Bi) Small eingekapselt Follikel Erfahrung niedrige Druckkraft in Alginat zu Beginn der Kultur. Allerdings ist die Follikel das verdrängte Volumen in der Perle erweitert zunimmt, die in größeren Druckkraft in die entgegengesetzte Richtung des Follikel-Erweiterung (b-ii) Ergebnisse. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2c.jpg" alt="Abbildung 2c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2c"> Abbildung 2c. Die Ketten der einzelnen Polymere sind völlig verstrickt in das Fibrin-Alginat-Lösung vor Quervernetzung. Beide Komponenten des FA-IPN sofort anfangen zu vernetzen, wie sie zu der Mischung von Thrombin und Calcium ausgesetzt sind. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3a.jpg" alt="Abbildung 3a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3a"> Abbildung 3a. Flussdiagramm für Follikel Isolierung und Verkapselung in einem FA-IPN. Sekundäre Follikel sind von einer 16-Tage alten Maus (Ai) isoliert. Die Fortpflanzungsorgane sind seziert (A-ii) und isolierten Follikel werden, um ein Gericht mit Wartungs-Medien (A-iii) übertragen. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3b.jpg" alt="Abbildung 3b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3b"> Abbildung 3b Die Drop-Methode für Follikel Verkapselung in Fibrinogen Alginatlösung (B: i-iv).. Zwei Tropfen von Fibrinogen-Alginat-Lösung sind die Spül-drop (10 l) und die Kapselung Tropfen (90 ul) in die Schüssel (Bi) pipettiert. Nächsten 3-5 Follikel zu einem Spülen Drop (B-ii) übertragen. Nach dem Spülen und Medien Entfernung sind Follikel auf die Verkapselung Drop (B-iii) übertragen. Jeder Follikel ist mit 5 ul Fibrinogen-Alginat-Lösung mit einem 10 ul Pipettenspitze angesaugt und dann ausgewiesen in Thrombin / Calcium-Lösung (B-iv). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3c.jpg" alt="Abbildung 3c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3c"> Abbildung 3c. Die Perle Vernetzungen für 5 Minuten. Der Parafilm Methode zur Kapselung Follikel in Fibrinogen Alginatlösung (C: I-III). Fibrinogen-Alginat-Lösung (7,5 ul) ist auf dem Parafilm beschichteten Objektträger pipettiert und Follikel sind individuell auf jeden Tropfen übertragen nach dem Spülen (Ci, ii). Thrombin-Lösung (7,5 ul) ist zu jedem Tropfen (C-iii) aufgenommen. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3d_e.jpg" alt="Abbildung 3d-e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3d-e"> Abbildung 3d - e. Die Tropfen werden mit einem zweiten Parafilm beschichteten Objektträger abgedeckt und die FA-IPN ist in den Inkubator für 5 Minuten vernetzt. (D) Die gekapselten Follikel zum Wachstum Medien in einer 96-Well-Platte übertragen. (E) Ein Bild von einem gekapselten Follikel in der FA-IPN (weißer Pfeil). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Fibrin Abbau durch den wachsenden Follicle. Follikel degradieren das Fibrin des FA-IPN während der Anzucht, die durch eine klare Kreis um die Follikel nachgewiesen wird. Der Follikel ist 3D-Architektur wird durch die restlichen Alginat unterstützt. Am Tag 0 (D0) das Fibrin noch intakt ist und die Matrix um die Follikel ist bewölkt, nach 1 Tag in Kultur (D1) die klare Ring um die Follikel erscheint (weißer Pfeil) und die Fibrinabbauprodukten vorne weiterhin radial am Tag zu erweitern 2 (D2) und Tag 4 (D4) der Kultur. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Bilder von Follikelwachstum. Repräsentative Bilder ofsecondary Follikelwachstum in der FA-IPN am Tag 0 (A), 4 (B), 6 (C) und 8 (D) der Kultur. Nach 8 Tagen wurden Antralfollikeln in vitro gereift, und die daraus resultierenden MII-Oozyten Bühne gezeigt werden (E, die Polkörper mit schwarzer Pfeil). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Fibrin Degradation wurde durch Aprotinin gehemmt. Wachsenden Follikel am Tag 2, 4, 10 und 12 sind in der ersten Zeile angezeigt. Aprotinin in Konzentrationen 0,01 TIU / mL (zweite Reihe) und 0,1 TIU / mL wurde das Kulturmedium an den Tagen 0, 2 und 4 aufgenommen. Nur Follikel Kulturen mit 0,01 TIU / mL Aprotinin degradiert das Fibrin nach Aprotinin Entfernung und erreicht antral Bühne. Follikel in 0,1 kultiviert TIU / mL Aprotinin nicht in der FA-IPN wachsen. <table border="1"><tbody><tr><td> Abkürzung </td><td> Vollständiger Name </td></tr><tr><td> CO 2-Inkubator </td><td> 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 </td></tr><tr><td> COC </td><td> Cumulus Oozyten-Komplex </td></tr><tr><td> 3D </td><td> 3-dimensionale </td></tr><tr><td> DM </td><td> Dissection Medien </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Epidermal Growth Factor </td></tr><tr><td> FA-IPN </td><td> Fibrin-Alginat durchdringendes Netzwerk </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Fetal Bovine Serum </td></tr><tr><td> GM </td><td> Nährmedien </td></tr><tr><td> GV </td><td> Keimbläschen </td></tr><tr><td> hCG </td><td> Humanes Choriongonadotropin </td></tr><tr><td> ITS </td><td> Insulin Transferrin Selen ergänzen </td></tr><tr><td> IVF Gericht </td><td> Zentrum und 60 mm in-vitro-Fertilisation Gericht </td></tr><tr><td> MM </td><td> Wartung Medien </td></tr><tr><td> MII Bühne Eizelle </td><td> Metaphase II Stadium Eizelle </td></tr><tr><td> rFSH </td><td> Rekombinante Follicular Hormon </td></tr><tr><td> TBS </td><td> Tris-gepufferter Kochsalzlösung </td></tr><tr><td> TIU </td><td> Trypsin hemmenden Einheiten </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Abkürzungen

<ol><li>Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+maturation%2C+fertilization+and+embryo+development+of+immature+oocytes+from+early+preantral+follicles+from+prepuberal+mice+in+a+simplified+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system.</a> Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).</li>
<li>Smitz, J., Cortvrindt, R., Hu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+combined+with+recombinant+human+chorionic+gonadotrophin+improves+meiotic+progression+in+mouse+follicle-enclosed+oocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor combined with recombinant human chorionic gonadotrophin improves meiotic progression in mouse follicle-enclosed oocyte culture.</a> Human Reproduction. 13, 664-669 (1998).</li>
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Die vorgestellten Ovarialfollikel Verkapselungsmethode in einem FA-IPN ermöglicht Follikel Kultur in einer 3D-Umgebung in vitro. Ein FA-IPN ist ein dynamisches, Zell-responsive Matrix, in der die ersten mechanischen Eigenschaften durch die Kombination der beiden Fibrin und Alginat bestimmt werden. Während der Kultur, aktiviert die gekapselte Follikel Proteasen, die nur eine Komponente des IPN, das Fibrin, das in einer allmählich abnehmenden Gel Steifigkeit, die ausschließlich durch die restlichen Alginat am End...

<table><tbody><tr><td>Fetuin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Roche Group</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>039-00475</td><td>40 mM</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>rFSH</td><td>National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CG-5</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1603</td><td></td></tr><tr><td>ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884-1VL</td><td></td></tr><tr><td>L-15</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM+Gluta MAX</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>32561</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28379</td><td></td></tr><tr><td>Tisseel-Fibrin-Kit</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>921030</td><td></td></tr><tr><td>Natrium-Alginat</td><td>FMC BioPolymers</td><td>LF200DL</td><td>Mw 418kDa</td></tr></tbody></table>

eine methode zur ovarialfollikel encapsulation und kultur in einem proteolytisch degradable 3 dimensional-system

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

Die Ovarialfollikel ist die funktionelle Einheit des Eierstocks, dass Sexualhormone absondert und unterstützt Eizellreifung. In-vitro-Follikel-Techniken bieten ein Werkzeug zur Modellierung Follikelentwicklung, um Grundlagen der Biologie zu untersuchen, und werden weiter als eine Technik, um die Fruchtbarkeit in der Erhaltung entwickelt Klinik 1-4. Unsere in vitro-Kultur-System nutzt Hydrogele, um die einheimischen Eierstock-Umgebung durch die Beibehaltung des 3D-follikuläre Architektur, Zell-Zell-Interaktionen und parakrine signalisiert, dass direkte Follikel Entwicklung 5 zu imitieren. Bisher wurden Follikel erfolgreich in Alginat, einem inerten Algen gewonnene Polysaccharid, dass die Gelbildung unterzogen mit Calciumionen 6-8 kultiviert. Alginat-Hydrogele in einer Konzentration von 0,25% w / v gebildet waren die permissive für Follikel Kultur, und behielt die höchste Entwicklungskompetenz 9. Alginat-Hydrogele sind nicht abbaubar und somit eine Erhöhung der Follikel Durchmesser ergibt sich eine Druckkraft auf die Follikel, Follikel Wachstum 10 auswirken können. Wir Folge entwickelte eine Kultur, das auf einem Fibrin-Alginat durchdringendes Netzwerk (FA-IPN), in dem eine Mischung aus Fibrin und Alginat gleichzeitig gelierte basiert. Diese Kombination bietet eine dynamische mechanische Umwelt, weil beide Komponenten Matrix Steifigkeit beitragen zunächst, allerdings verschlechtern Proteasen, die durch den wachsenden Follikel sezerniert Fibrin in der Matrix so dass nur Alginat zu unterstützen. Mit dem IPN, kann das Alginat-Gehalt unter 0,25%, was nicht mit Alginat allein 5 möglich reduziert werden. So, wie die Follikel erweitert, wird sie erleben eine reduzierte Druckkraft aufgrund der geringeren Feststoffgehalt. Hier beschreiben wir eine Kapselung Verfahren und eine in-vitro-Kultur-System für Eibläschen in einem FA-IPN. Die dynamisch-mechanischen Umfeld ahmt die natürliche Eierstock-Umfeld, in dem kleine Follikel in eine starre Kortex befinden und bewegen, um eine permissive Medulla als sie erhöhen in Größe 11. Die abbaubaren Komponente kann als besonders kritisch für die klinische Übersetzung, um die größer als 10 6-fachen Anstieg des Volumens, dass die menschliche Follikel in der Regel durchlaufen in vivo zu unterstützen.

Eine neue Methode zur Ovarialfollikel Kapselung in einer 3D-Fibrin-Alginat durchdringendes Netzwerk beschrieben. Dieses System kombiniert strukturelle Unterstützung mit proteolytischen Abbau der Entwicklung von unreifen Follikeln Unterstützung, um zu reifen Eizellen zu produzieren. Diese Methode kann zur Kultur Zellaggregate angewendet werden, um Zell-Zell-Kontakte ohne Beschränkungen für die Ausweitung aufrecht zu erhalten.

Eine Methode zur Ovarialfollikel Encapsulation und Kultur in einem Proteolytisch Degradable 3 Dimensional-System

Der Ovarialfollikel ist die funktionelle Einheit des Eierstocks, die Sexualhormone sekretiert und die Reifung der Oozyte unterstützt. In-vitro-Follikeltechniken bieten ...

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Einschließungsmethode von Eierstockfollikeln in einem fibrin-alginathaltigen, miteinander verflochtenen Netzwerk für die Kultur in vitro. Sekundäre Follikel bestehen aus einem zentral gelegenen Oozyt, der von mehreren Schichten somatischer Zellen umgeben ist, die die Oozytentwicklung unterstützen. Die Einschließung und Kultur der Follikel in einer dreidimensionalen Umgebung ermöglicht die Ausdehnung der Follikel, unterstützt gleichzeitig die Kommunikation zwischen mehreren zellulären Kompartimenten und erhält die kugelförmige Struktur des Follikels aufrecht. Im ersten Schritt dieses Protokolls werden sekundäre Follikel aus Eierstöcken 16 Tage alter Mäuse für die Tropfenmethode isoliert.Spülen Sie die Follikel und überführen Sie sie in eine Verkapselungslösung. Aspirieren Sie jeden Follikel mit Fibrinogen-Alginat-Lösung und pipettieren Sie ihn in Thrombin-Calcium-Lösung, und lassen Sie die Kügelchen für die Paraform-Methode vernetzen. Überführen Sie einzelne Follikel in Tropfen der Fibrinogen-Alginat-Lösung auf einem mit Paraform beschichteten Objektträger und geben Sie Thrombin-Lösung hinzu, um die F-A-I-P-N-Vernetzung zu initiieren.Überführen Sie dann die eingeschlossenen Follikel in ein Wachstumsmedium und nehmen Sie ein Bild des eingeschlossenen Follikels im FA-IPN auf. Da dieses System strukturelle Unterstützung mit biologischer Empfindlichkeit kombiniert, um das Wachstum und die Entwicklung unreifer Follikel zur Eizellproduktion zu fördern, könnte es zur Kultivierung von Zellaggregaten angewendet werden, um die Zell-Zell-Kontakte beizubehalten, ohne die Expansion einzuschränken. Hallo, mein Name ist Lonnie Shea, und in Zusammenarbeit mit Three Wood Drip haben wir ein Kultursystem zur in-vitro-Maturation von Eierstockfollikeln entwickelt.Und diese Kulturstudie spiegelt tatsächlich eine echte Zusammenarbeit zwischen Bioingenieurwesen und Reproduktionsbiologie wider. Heute werden die Personen, die dieses Kultursystem tatsächlich entwickelt haben, Ihnen die Methoden vorstellen. Zunächst ist Ariel Checkoff ein Postdoktorand im Bereich Bioingenieurwesen, der das Biomaterialsystem entwickelt hat.Als Nächstes folgt Minsu, ein Reproduktionsbiologe aus der Abteilung für Geburtsmedizin und Gynäkologie, der die Handhabungsverfahren für das Ovarialgewebe entwickelt hat. Gemeinsam werden sie Ihnen die Methoden zur eigentlichen Einschließung und Kultivierung von Ovarialgewebe vorstellen. Der Hauptvorteil der beschriebenen Technik im Vergleich zu etablierten Methoden, wie der Standardkultur auf flachen Kunststoffoberflächen, ist, dass das Fibrin-Alginat-System die dreidimensionale Architektur des Follikels unterstützt und gleichzeitig eine mechanisch dynamische Umgebung für den sich schnell vergrößernden Follikel bietet.Das dynamische mechanische Mikromilieu im vorliegenden Verfahren bietet zusätzliche Vorteile, wenn diese Technologie vom Massenmodell auf eine potenzielle klinische Anwendung übertragen wird, da im menschlichen Follikel ein weitaus umfangreicheres Wachstum erforderlich ist, um reife und befruchtungsfähige Eizellen für optimale Ergebnisse zu erzeugen. Führen Sie alle Dissektionen in auf L15 basierenden Medien zur pH-Kontrolle auf 37 Grad Celsius erhitzten Stufen für die Temperaturkontrolle und auf einer sauberen Arbeitsbank durch, um bakterielle Kontaminationen zu minimieren. Überführen Sie frisch dissezierte Ovarien in eine neue 35-Millimeter-Petri-Schale mit ein bis zwei Millilitern Wartungsmedium, das 0,1 % Collagenase und 0,1 % DNase enthält, und inkubieren Sie 15 Minuten lang in einem Kohlendioxid-Inkubator.Spülen Sie die Proben in DM, um Kollagenase zu entfernen, und überführen Sie sie anschließend in eine 35 Millimeter große Petrischale mit frischem DM, um Follikel aus dem Eierstock zu isolieren. Lösen Sie die Follikel vorsichtig mit zwei 28,5–8-Gauge-Nadeln, die an Insulinspritzen befestigt sind, vom gesamten Eierstock ab. Entfernen Sie so viele Stromazellen wie möglich, ohne die Integrität des Follikels zu beschädigen.Isolieren Sie 20 bis 40 sekundäre Follikel mit einem Durchmesser von 130 bis 150 Mikron pro Ovar. Diese Follikel weisen gewöhnlich zwei bis drei Schichten von Granulosazellen auf. Geben Sie nun in eine IVF-Schale ein Milliliter mm in die zentrale Vertiefung und drei Milliliter mm in den äußeren Ring.Überführen Sie intakte Follikel mit der Pipette in den äußeren Ring der IVF-Schale. Halten Sie diese IVF-Schale im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nachdem alle Follikel gesammelt wurden.Untersuchen Sie die Proben unter einem Stereomikroskop mit einer Vergrößerung von fünf- bis achtfacher Größe und wählen Sie Follikel mit einer Größe von 130 bis 150 Mikron aus, die eine gesunde Morphologie aufweisen, einschließlich zwei bis drei Granulosazellschichten, keiner Trennung zwischen Oozyt und Granulosazellen sowie intakter und runder Oozyten. Überführen Sie die gesunden Follikel in die Mitte einer anderen IVF-Schale zur Einschließung. Für die Tropfenmethode der Follikeleinschließung geben Sie ein Milliliter einer Thrombinlösung mit 50 internationalen Einheiten pro Milliliter in die mittlere Vertiefung einer IVF-Schale; tauen Sie die Fibrinogen-Stammlösung auf und bewahren Sie sie auf Eis auf.Und bringen Sie das Fibrinogen unmittelbar vor der Einschließung auf Raumtemperatur. Unmittelbar vor der Verwendung bereiten Sie die Fibrinogen-Alginat-Lösung zu, indem Sie 1× PBS, 0,5 % Alginat und 50 Milligramm pro Milliliter mischen.Fibrinogen im Verhältnis zwei zu eins zu eins in einem sterilen 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Vorsichtig verwirbeln und die leicht trübe Lösung zentrifugieren, um die Verdunstung zu verringern. Die Heizstufe am Stereomikroskop ausschalten und in der Ecke des äußeren Rings einer IVF-Schale platzieren.90 Mikroliter Fibrinogen-Alginat-Lösung zur Einschließung und ein zweiter Tropfen mit 10 Mikrolitern für einen Waschschritt. Überführen Sie 10 bis 15 Follikel mit einer minimalen Menge an Kulturmedium in den Tropfen mit 10 Mikrolitern und vermischen Sie diese schnell mit einer minimalen Menge an Lösung. Überführen Sie alle Follikel in den Tropfen mit 90 Mikrolitern und mischen Sie sie erneut. Aspirieren Sie einen Follikel innerhalb von fünf Mikrolitern Fibrinogen-Alginat-Lösung mit einer 10-Mikroliter-Spitze und geben Sie die Fibrinogen-Alginat-Lösung zusammen mit dem Follikel in die Thrombin-Lösung in der Mitte der IVF-Schale ab. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Follikel eingeschlossen sind.Lassen Sie die Kügelchen fünf bis sieben Minuten lang stehen, um das Gel in der Thrombin-Calcium-Lösung zu vernetzen. Die Kügelchen werden dunkler, während Fibrin gebildet wird. Überführen Sie die Kügelchen in das Erhaltungsmedium, beginnend mit den dunkleren Kügelchen.Erst 15 bis 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren und anschließend das verbleibende Thrombin abspülen. Schließlich die Kügelchen in eine Kulturplatte überführen und abbilden. Unmittelbar danach die Fibrinogen-Alginat-Lösung herstellen, indem 0,5 % Alginat und 50 Milligramm pro Milliliter gemischt werden.Fibrinogen im Verhältnis eins zu eins in eine sterile 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenprobe pipettieren; 7,5-Mikroliter-Tropfen der Fibrinogen-Alginat-Mischung auf das parfümierte beschichtete Glas geben. Mit einem drei Millimeter Abstandshalter verschieben und einen Follikel in jeden Tropfen überführen. Mit einer minimalen Menge an Medium. Fügen Sie 7,5 Mikroliter Thrombinlösung zu jedem Tropfen hinzu, ohne den Tropfen mit dem Follikel zu berühren oder zu vermischen, da das Gel sich nahezu augenblicklich bildet. Bedecken Sie die Gele mit dem zweiten mit Parafilm beschichteten Glas. Verschieben und platzieren Sie es für fünf Minuten verkehrt herum in eine 100-Millimeter-Schale im Inkubator.Überführen Sie die klebrigen Perlen gegebenenfalls mit einer Pinzette in das Erhaltungsmedium und anschließend alle zwei Tage in eine Kulturmulde. Bilden Sie die kultivierten Follikel mit einem Lichtmikroskop ab und messen Sie den Follikeldurchmesser mit ImageJ. Ersetzen Sie außerdem alle zwei Tage die Hälfte des Wachstumsmediums durch frisches, equilibriertes Wachstumsmedium. Nach acht Tagen Kultur sollte das Hydrogel aufgrund des vollständigen Abbaus der Fibrinbestandteile klar erscheinen, und die Follikel können ihre Endgröße mit einem Durchmesser von mehr als 400 Mikrometern erreichen. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und geben Sie 100 Mikroliter einer Lösung mit 10 internationalen Einheiten pro Milliliter hinzu.Alginate lia in Alpha-MEM, um das Alginate abzubauen. Stellen Sie die Platte 25 bis 30 Minuten in einen Inkubator. Entfernen Sie anschließend die Follikel mit einer stumpfen Pipettenspitze aus den teilweise aufgelösten Kügelchen.Überführen Sie die Follikel in den äußeren Ring einer IVF-Schale mit Dissektionsmedium, um das Alginate-Gel zu entfernen, und anschließend in den inneren Ring. Danach überführen Sie die antralen Follikel in den äußeren und dann in den inneren Ring der IVF-Schale mit Reifungsmedium, das HCG und EGF enthält, und inkubieren sie 15 bis 16 Stunden in einem Kohlendioxid-Inkubator. Überprüfen Sie die Kulturen auf Expansion der Cumuluszellen, um diese zu entfernen.Geben Sie eine höhere IDE-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie für zwei bis drei Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Pipettieren Sie mit dem Mund, um die Oozyten von den Cumuluszellen zu lösen, und bestimmen Sie schließlich unter dem Mikroskop ihr Reifungsstadium.Alginate ist ein natürliches Biomaterial, das aufgrund seiner schonenden Gelierung und biochemischen Eigenschaften wie Maschenweite, kontrollierbarer Steifigkeit und biologischer Inertheit für die in-vitro-Follikelkultur geeignet ist. Kleine eingekapselte Follikel erfahren zu Beginn der Kultur eine geringe Druckbelastung im Alginate. Allerdings nimmt mit der Ausdehnung des Follikels das verdrängte Volumen in der Kugel zu, was zu einer höheren Druckkraft in der der Follikelausdehnung entgegengesetzten Richtung führt.Die Ketten einzelner Polymere sind vor der Vernetzung in der Fibrillin-Alginat-Lösung vollständig verflochten. Beide Bestandteile von F-A-I-P-N beginnen unmittelbar mit der Vernetzung, sobald sie mit der Mischung aus Thrombin und Kalzium in Kontakt kommen. Während der Kultivierungszeit bauen die Follikel die Fibrin-Komponente von F-A-I-P-N ab, was sich durch einen deutlichen klaren Kreis um den Follikel zeigt. Die dreidimensionale Architektur des Follikels wird durch das verbleibende Alginat gestützt.Diese Bilder zeigen das Wachstum sekundärer Follikel in F-A-I-P-N im Zeitverlauf von Tag 0, 4, 6 und acht bis zum resultierenden M-Zwei-Stadium X. Mit Polkörper ist ein Pronin ein Proteaseinhibitor, der dem Kulturmedium hinzugefügt werden kann, um den Fibrinabbau zu verlangsamen. Wenn 0,01 TIU pro Milliliter Aprotinin den ersten vier Tage dem Kulturmedium zugesetzt werden, können die Follikel die Matrix nicht abbauen. Nach der Entfernung des Proteins setzen die Follikel ihr Wachstum fort und erreichen das antrale Stadium.Jedoch zeigten Follikel, die anfänglich in einer höheren Konzentration von Aprotinin kultiviert wurden, ein gehemmtes Wachstum. Heute stellen wir eine neue Technik zur variablen Follikeleinschließung und In-vitro-Kultur in einem dreidimensionalen Fibrin-Alginat-Netzwerk vor. Das System erhält nicht nur die intakte Follikelstruktur während der Kultur aufrecht, sondern unterstützt auch eine erfolgreiche follikuläre Genese in vitro, was in einer M-Zwei-Stufen-O-Site resultiert.Diese Technologie ist wichtig, um zu verstehen, wie der ovariale Follikel funktioniert, und könnte jungen Krebspatienten allgemeiner betrachtet Fortpflanzungsoptionen bieten. Dieses Kultursystem kann zur Kultivierung von Zellverbänden oder zur Kultivierung von Zellen verwendet werden, während sie sich zu Strukturen organisieren. Diese 3D-Kultursysteme werden wertvolle Werkzeuge zur molekularen Aufklärung des Gewebewachstums liefern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Kultur von normalen Zellen in ihrer dreidimensionalen Kontext stellt eine alternative Methode zur frühen Ereignisse für die zelluläre Transformation und Tumorentstehung erforderlich studieren. Diese Methode wird verwendet, um normale Eierstock-und Eileiter Zellen wachsen zu frühen Ereignisse bei Eierstockkrebs Bildung zu studieren.

Alginat Hydrogele für Three-Dimensional Organ Culture der Eierstöcke und Eileitern

Dieses Video beschreibt die Protokolle zur Verkapselung von Schweine-Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) in Fibrin-Alginat-Kügelchen, um eine 3D-Kultur zu etablieren. Dieses In-vitro-Reifungssystem hält die normale Zell-zu-Zell-Kommunikation aufrecht, stellt die Eizellreifung sicher und behält die Lebensfähigkeit bei.

3D-Kultur von Schweine-KOK: Ein Verfahren zur Verkapselung von Kumulus-Oozytenkomplexen in Fibrin-Alginat-Polymer-Hydrogel-Kügelchen

In diesem Video beschreiben wir ein Protokoll für die Verkapselung von Schweineeizellen in hydrophoben Mikrobioreaktoren.

Mikrobioreaktorsystem aus flüssigem Marmor: Ein 3D-Kulturprotokoll für die Verkapselung von Schweineeizellen

Dieses Protokoll beschreibt die Primärkultur / Co-Kultur von Maus-Eierstockgewebe, mit Eierstöcke von neugeborenen Mäusen und individuelle Eibläschen von präpubertären Mäusen. Die Kulturtechniken unterstützt Entwicklung in einer hoch physiologischer Weise ermöglicht Untersuchung der Wirkung von äußeren Mitteln an den Eierstöcken und der Wechselwirkungen zwischen Follikeln.

Kultur und Co-Kultur von Maus Eierstöcke und Eibläschen

Hier werden zwei Protokolle für die Verkapselung von Schweineeioozyten unter 3D-Kulturbedingungen vorgestellt. In der ersten werden Cumulus-Oozyten-Komplexe (COCs) in Fibrin-Alginat-Perlen eingekapselt. In der zweiten werden sie mit fluorierten Ethylenpropylenpulverpartikeln (Mikrobioreaktoren) umschlossen. Beide Systeme sorgen für optimale Bedingungen, um ihre 3D-Organisation aufrechtzuerhalten.

Proteolytisch abgebaute Alginat-Hydrogele und hydrophobe Mikrobioreaktoren zur Poren-Oozyten-Verkapselung

Dieses Protokoll beschreibt ein neuartiges dreidimensionales (3-D) Kulturmodell, bei dem ein Tyramin-gebundenes Hyaluronan-Hydrogel verwendet wird, um präantrale Follikel aus dem Eierstock der Maus zu verkapseln und zu kultivieren. Wir beschreiben auch zwei Ansätze zur Kryokonservierung von Eierstockfollikeln durch Vitrifikation.

Anwendung eines neuartigen Hyaluron-Hydrogels für die dreidimensionale Follikelkultur und Methodik für die Kryokonservierung von Ovarialfollikeln in der Maus

Wir beschreiben Methoden zur Kultivierung von Ovarialfollikeln in einer neuartigen gerüstfreien Agaroseform, die die in vitro Gametogenese ergänzen.

Herstellung und Verwendung von anpassbaren Agaroseformen für die gerüstfreie Ovarialfollikelkultur von Mäusen

Wir beschreiben Methoden zur Isolierung somatischer maus-ovarialer Zellen aus einem stroma-angereicherten Anteil des Eierstocks und zur Erzeugung maus-ovarialer somatischer Organoide mittels eines gerüstfreien Ansatzes.

Untersuchung des Ovarialmikroumfelds: Methoden zur Isolierung, 2D-Kultur und organoiden Kultur somatischer Maus-Ovarialzellen

Es wird ein Verfahren zur Herstellung einer 3-dimensionalen Matrix, bestehend aus Kollagen Typ I und primären humanen Fibroblasten beschrieben. Diese organotypischen Gel dient als nützliches Substrat invasive Zellmigration beurteilen, da es grundlegende Funktionen von Gewebestroma nachahmt und ist offen für viele Formen der Mikroskopie.

Organotypische Collagen I Assay: A Temperguss Platform to Cell Verhalten in 3-Dimensional Kontext beurteilen

Selbstorganisierte Monoschichten (SAMs) aus langkettigen Alkan Thiolen auf Gold gebildet ist gut definierten Substraten für die Bildung von Protein-Muster-und Zell-Entbindung. Mikrokontaktdruck von Hexadecanthiol mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempel durch Verfüllung mit folgten einem Glykol-terminierte Alkanthiol Monomer erzeugt ein Muster, bei dem Protein und Zellen adsorbieren nur den Stempel Hexadecanthiol Region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Erfahren Sie die Kapselung von Ovarialfollikeln in einem 3D-Fibrin-Alginate-Netzwerk zur In-vitro-Kultur. Diese Methode unterstützt das Wachstum unreifer Follikel zu reifen Eizellen.

Eine Methode zur Ovarialfollikel Encapsulation und Kultur in einem Proteolytisch Degradable 3 Dimensional-System

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