Name: Eine Methode zur Ovarialfollikel Encapsulation und Kultur in einem Proteolytisch Degradable 3 Dimensional-System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Erfahren Sie die Kapselung von Ovarialfollikeln in einem 3D-Fibrin-Alginate-Netzwerk zur In-vitro-Kultur. Diese Methode unterstützt das Wachstum unreifer Follikel zu reifen Eizellen.

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Diese Arbeit wurde vom NIH (U54HD41857 und PL1EB008542, ein P30 Biomaterialien Kern innerhalb der Oncofertility Consortium Roadmap Zuschuss) gefördert.

1. Follikel Isolation Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die National Institutes of Health Guide Set für die Pflege und Verwendung von Labortieren und die etablierten institutionellen Tiere Benutzung und Pflege-Protokoll an der Northwestern University durchgeführt. Für optimale Ergebnisse sind alle Sektionen in L15 Medien zur pH-Kontrolle bei Umgebungstemperaturen von CO 2 durchgeführt, auf 37 ° C erhitzt, Stadien für die Temperaturregelung und auf einer sauberen Werkbank, um bakterielle Verunreinigungen zu minimieren. Die Dissektion Medien (DM) ist mit L15-Medien mit 50 IU / mL Penicillin und 50 &amp;mgr; l / ml Streptomycin und 1% FBS vorbereitet. Die Wartung Medien (MM) ist mit αMEM Medien mit 50 IU / mL Penicillin und 50 &amp;mgr; l / ml Streptomycin und 1% FBS vorbereitet. <ol><li> Transfer frisch präparierten Ovarien von 16 Tage alten Maus in eine neue 35-mm-Petrischale mit 1-2 mL MM mit 0,1% Collagenase und 0,1% DNase. Inkubieren für 15 Minuten in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Nach der Inkubation, führen mehrere Waschschritte in DM um Kollagenase zu entfernen, und dann übertragen auf eine 35 mm Petrischale mit frischem DM. Isolieren Follikel aus dem Eierstock durch leichtes Schnippen (oder Schneiden) Follikel weg von den ganzen Eierstock mit zwei 28 8.5 Gauge-Nadeln an Einwegspritzen. Entfernen Sie so viel Stroma wie möglich, ohne die Integrität der Follikel. Herauspräparieren 20-40 sekundären Follikel pro Ovar (130-150mm). Diese Follikel haben in der Regel 2-3 Schichten von somatischen Zellen. </li><li> 1 ml MM an die zentrale Vertiefung einer 60 mm IVF (In-vitro-Fertilisation) Petrischale und 3 mL MM mit dem Außenring. Transfer intakter Follikel mit einer Pipette auf den äußeren Ring des IVF Schüssel kurz abspülen und dann selektiv übertragen sie in die zentrale Vertiefung (siehe 1.4). Bewahren Sie diese IVF Gericht in den Inkubator. </li><li> Nach all den Follikel erhoben werden, erfolgt die Auswahl Schritt unter einem Binokular mit einem 5-8fache Vergrößerung durchgeführt. Gesunde Follikel haben folgende morphologische Merkmale: <ul><li> 2-3 somatische Zellschichten </li><li> 130-150 mm </li><li> Keine Trennung zwischen Oozyte und somatischen Zellen </li><li> Intakte und rund Oozyten Übertragen Sie die gesunde Follikel in das Zentrum der IVF Gerichte für die Verkapselung. </li></ul></li></ol> 2. Follikel Encapsulation, Methode 1 - "The Drop-Methode" <ol><li> 1 ml von 50 IU / ml Thrombin in TBS mit 40 mM CaCl 2 in die Mitte und der IVF Gericht. Tauwetter und halten Fibrinogen Lager (50 mg / mL in TBS) auf Eis. Bringen Sie das Fibrinogen auf Raumtemperatur rechts vor dem Gebrauch. </li><li> Bereiten Sie die Fibrinogen / Alginat-Lösung durch Mischen 1x PBS, 0,5% Alginat in PBS-Lösung und 50 mg / mL Fibrinogen-Lösung bei einem Verhältnis 2:1:1 in einer 1,7 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen. Vermeiden Sie die Einführung Blasen in der Lösung. Vorsichtig vortexen und Spin-down. Die Lösung erscheint leicht bewölkt und sollte unmittelbar vor Gebrauch vorbereitet werden. </li><li> Legen Sie zwei Tropfen von Fibrinogen / Alginat-Lösung in den äußeren Ring einer IVF Gericht: eine 90 ul Tropfen für die Verkapselung und 10 ul Tropfen zum Waschen. Zur Verringerung Verdunstung, schalten Sie die Heizung Etappe auf dem Binokular. Transfer 10-15 Follikel in den 10 l Tropfen mit einer minimalen Menge von Kulturmedien (&lt;5 ul) mit einem 200 um Mikropipette Spitze, und schnell mischen. Übertragen Sie alle der Follikel in den 90 ul Tröpfchen mit einer minimalen Menge der Lösung (&lt;5 ul) aus dem ersten Tropfen, und mischen. </li><li> Gleichzeitig absaugen ein Follikel und 5 ul Fibrinogen / Alginat-Lösung mit einem 10 ul Pipettenspitze und Freisetzung in die Thrombin / Ca 2 +-Lösung in der IVF Gericht. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle die Follikel gekapselt sind. </li><li> Cross-Link die Perlen für 5-7 Minuten in der Thrombin / Ca 2 +-Lösung. Die Perlen wird dunkler als Fibringele. Übertragen Sie die Perlen in eine Petrischale mit MM, beginnend mit den dunkleren Perlen zuerst. Inkubieren Sie die Schale für 15-30 Minuten inder Inkubator abzuspülen die restlichen Thrombin. </li><li> Übertragen Sie die Perlen in einer 96-well-Kulturplatte mit 100 ul Follikelwachstum Medien und das Bild sofort. Das Wachstum Medien (GM) ist mit αMEM Medien mit 10 mIU / ml rekombinantes FSH, 3 mg / ml BSA ergänzt vorbereitet, 1 mg / ml bovinem Fetuin, 5 g / ml Insulin, 5 ug / ml Transferrin, und 5 ng / ml Selen. </li></ol> 3. Follikel Encapsulation, Methode 2 - "Der Parafilm Method" <ol><li> Bereiten Sie die Fibrinogen / Alginat-Lösung durch Mischen von 0,5% Alginat-Lösung und 50 mg / mL Fibrinogen-Lösung im Verhältnis 1:1 in einem 1,7 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Pipette 7,5 ul Tropfen der Fibrinogen / Alginat-Gemisch auf einem Parafilm beschichteten Objektträger mit 3 mm Abstandhalter. Transfer 1 Follikel in jedem Tropfen mit einem minimal Höhe von Medien. </li><li> Add 7,5 ul von Thrombin / Ca 2 +-Lösung, um jeden Tropfen. Das Mischen ist nicht erforderlich, da das Gel bildet fast augenblicklich. </li><li> Decken Sie die Gele mit dem zweiten Parafilm beschichteten Objektträger, legen Sie die Folien auf den Kopf in eine 100 mm Petrischale und Transfer in den Inkubator für 5 Minuten. </li><li> Übertragen Sie die Perlen in eine Petrischale mit MM, und dann in die Kultur gut wie zuvor beschrieben. Wenn die Perlen aneinander haften, die durch Vernetzung zwischen den Kügelchen ist, kann sie vorsichtig mit einer Pinzette getrennt werden. </li></ol> 4. Follikel Imaging and Media ändern <ol><li> Alle 2 Tage werden die kultivierten Follikel aufgenommen mit einem Lichtmikroskop und dem Follikel Durchmesser ist mit dem Software-Programm ImageJ gemessen. </li><li> Alle 2 Tage wird die Hälfte des Wachstums Medien (50 ul) durch frische, voräquilibriert Wachstum Medien ersetzt. </li></ol> 5. Follikel Erholung von der 3D-Matrix-und in vitro Eizellreifung (IVM) <ol><li> Nach 8 Tagen der Kultur erscheinen die Hydrogele klar durch Abbau des Fibrins Komponente vollständig, und die Follikel mit einem Durchmesser von 300-400 mu m zu erweitern. Die restlichen Alginat abgebaut wird Alginat-Lyase, einem pflanzlichen Enzym, das spezifisch degradiert Alginat und hat keinen Einfluss auf tierische Zellen. </li><li> Entfernen Nährmedien aus Brunnen mit den Perlen und 100 ml 10 IU / mL Alginat-Lyase in αMEM. Lassen Sie die Platte in den Brutschrank für 25-30 Minuten. </li><li> Entfernen Follikel aus dem aufgelösten Kügelchen mit einem stumpfen Ende Spitze. Transfer ersten bis zum äußeren Ring einer IVF Schale mit DM, und dann in der Mitte gut, auch mit DM zu waschen. </li><li> Nach dem Waschen, Transfer der Follikel auf die äußere und dann Innenring eines IVF Schale mit Reifung Medien. In-vitro-Maturation Medien (IVM) ist der αMEM, 10% FCS, 1,5 IU / mL hCG zusammengesetzt, und 5 ng / mL des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) </li><li> Transfer zum CO 2-Inkubator für 15-16 Stunden. Untersuchen Sie die Follikel für Kumuluszellen Expansion. Um die Cumulus-Zellen, die aus der Eizelle entfernt, hinzugefügt Hyaluronidase Lösung Endkonzentration 0,1 mg / mL und inkubieren in den Inkubator für 2-3 Minuten. Verwenden Sie eine 75 mm Mikropipette Spitze zu scheren die Cumulus-Zellen aus der Eizelle durch Auf-und Abpipettieren mehrmals. Bestimmen Sie Reifungsphase der Eizelle unter einem Licht oder einem Binokular. Die möglichen Stufen, von der geringsten zur höchsten Reife, sind: <ul><li> Degeneriert. Die Eizelle wird in zwei oder mehr Stücke zersplittert. </li><li> Keimbläschen (GV) der Bühne. Die Eizelle nicht wieder Meiose in Reaktion auf hCG Exposition, was sich durch die fortgesetzte Präsenz der Kern der Eizelle (GV) ist. </li><li> Keimbläschen Aufschlüsselung (GVBD). Die Kernmembran fehlt die Eizelle, aber es gibt keinen Polkörper vorhanden. Daher ist die Eizelle noch in der Meiose-I. </li><li> Metaphase-II verhaftet Eizelle (MII). Die Eizelle wieder Meiose, und ist nun in der Metaphase-II verhaftet. Ein Polkörper sichtbar sein soll auf einem hellen oder einem Binokular. Die Eizelle wird bei MII bleiben, es sei denn in späteren Experimenten befruchtet. </li></ul></li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Wir beschrieben eine neuartige Verkapselung Methode der Eibläschen in einem FA-IPN für In-vitro-Kultur (Abb. 1). Eibläschen bestehen aus einer Eizelle durch mehrere Schichten von somatischen Zellen umgeben. Die Kommunikation zwischen den mehreren zellulären Kompartimenten ist wichtig für gesunde Follikel Entwicklung und Eizellreifung. Follikel Kapselung in einer 3D-Hydrogel unterstützt Follikel Expansion unter Beibehaltung der Architektur des Follikels 9,11,12. Als Follikel entwickeln, baut ihr Volumen exponentiell und die Verkapselung von Biomaterial sollte diese Expansion ohne die Entwicklung einer Hemmung der Druckkraft zu ermöglichen. FA-IPN ist ein Netzwerk von zwei natürlichen Materialien, in denen Fibrin proteolytisch abbaubar durch Plasmin aktiviert durch die Follikel und Alginat ist biologisch inert 13 (Abbildung 2) gebaut. Während das Wachstum der Follikel, beginnt Fibrinabbauprodukten lokal in der Nähe der Follikel, und dauert bis das Fibrin aus dem Hydrogel deaktiviert ist. Die nicht-abbaubaren Alginat-Komponente, die intakt in die Kultur Zeit bleibt, unterstützt die 3D-Struktur des Hydrogels. Follikel wurden in der zweiten Stufe der Entwicklung (150-180 Mikrometer Durchmesser) isoliert und erweitert, um 400 um die antral Stadium der Entwicklung in den FA-IPN-Gelen. Mit hCG Stimulation kann der kultivierte Follikel unterziehen cumulus Zellexpansion und Eizellen können Meiose und Fortschritt zu Metaphase II wieder für die Befruchtung. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Kapselung Methode und das Einkapselungsmaterial Follikel Kultur und erfolgreiche Reifung in vitro (Abbildung 3) erlaubt. Fibrinabbauprodukten rund um die encapsulEINZELNEN SEKTOREN Follikel beginnt am ersten Tag der Kultur und wird von Tag 6 abgeschlossen. Aprotinin, einem löslichen Plasmin-Inhibitor, kann verwendet werden, um Fibrinabbauprodukten ändern und mechanische Gradienten in das Einkapselungsmaterial (Abbildung 4) zu verlängern. Wenn Follikel mit 0,01 TIU / mL Aprotinin kultiviert werden, ist das Fibrin abgebaut langsamer in den ersten 4 Tagen. Dennoch ist die Follikel noch die antral Bühne entwickeln und Eizellen zuständig bleiben, um die Meiose zu Metaphase II fortgesetzt, nachdem Aprotinin removed.A hohe Konzentration von Aprotinin (0,1 TIU / mL) deutlich hemmt Fibrinabbauprodukten verhindert Matrix Steifigkeit Follikel Expansion und somatischen Zellen Invasion in der Matrix zu beobachten ist. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Flowchart der Follikelentwicklung. Die Ovarialfollikel besteht aus einem zentral gelegenen Eizelle durch eine oder mehrere Lagen von somatischen Zellen, die Eizelle Entwicklung zu unterstützen umgeben. Als Follikel aus sekundären den präovulatorischen antral Bühne entwickeln, vermehren sich die somatischen Zellen rund um die Eizelle und zu differenzieren, und die Eizelle an Größe zunimmt. In-vitro-Maturation (IVM) ist der letzte Schritt für die Follikel Kultur, wenn die somatischen Zellen mit den benachbarten Eizelle bezeichnet Kumuluszellen nach hCG Stimulation zu erweitern, und die Eizelle wieder Meiose und schreitet zu einem Metaphase II (MII) Bühne. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2a.jpg" alt="Abbildung 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2a"> Abbildung 2a. Alginat und Fibrin-Alginat für 3D-Follikel Kultur in vitro. (A) Alginat ist ein natürliches Biomaterial, geeignet für in-vitro-Kultur Follikel wegen seiner sanften Gelierung und biochemischen Eigenschaften, wie Maschenweite, steuerbare Steifigkeit und biologischen Inertheit. Alginat ist ein lineares Polysaccharid Copolymer aus α-L-Guluronsäure (G) und β-D-Mannuronsäure (M). Bereiche mit sich wiederholenden G Monomeren, genannt "G-Blöcke", sind vernetzt, um ein Hydrogel, in Gegenwart von zweiwertigen Calcium-Ionen bilden. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2b.jpg" alt="Abbildung 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2b"> Abbildung 2b. (Bi) Small eingekapselt Follikel Erfahrung niedrige Druckkraft in Alginat zu Beginn der Kultur. Allerdings ist die Follikel das verdrängte Volumen in der Perle erweitert zunimmt, die in größeren Druckkraft in die entgegengesetzte Richtung des Follikel-Erweiterung (b-ii) Ergebnisse. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2c.jpg" alt="Abbildung 2c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2c"> Abbildung 2c. Die Ketten der einzelnen Polymere sind völlig verstrickt in das Fibrin-Alginat-Lösung vor Quervernetzung. Beide Komponenten des FA-IPN sofort anfangen zu vernetzen, wie sie zu der Mischung von Thrombin und Calcium ausgesetzt sind. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3a.jpg" alt="Abbildung 3a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3a"> Abbildung 3a. Flussdiagramm für Follikel Isolierung und Verkapselung in einem FA-IPN. Sekundäre Follikel sind von einer 16-Tage alten Maus (Ai) isoliert. Die Fortpflanzungsorgane sind seziert (A-ii) und isolierten Follikel werden, um ein Gericht mit Wartungs-Medien (A-iii) übertragen. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3b.jpg" alt="Abbildung 3b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3b"> Abbildung 3b Die Drop-Methode für Follikel Verkapselung in Fibrinogen Alginatlösung (B: i-iv).. Zwei Tropfen von Fibrinogen-Alginat-Lösung sind die Spül-drop (10 l) und die Kapselung Tropfen (90 ul) in die Schüssel (Bi) pipettiert. Nächsten 3-5 Follikel zu einem Spülen Drop (B-ii) übertragen. Nach dem Spülen und Medien Entfernung sind Follikel auf die Verkapselung Drop (B-iii) übertragen. Jeder Follikel ist mit 5 ul Fibrinogen-Alginat-Lösung mit einem 10 ul Pipettenspitze angesaugt und dann ausgewiesen in Thrombin / Calcium-Lösung (B-iv). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3c.jpg" alt="Abbildung 3c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3c"> Abbildung 3c. Die Perle Vernetzungen für 5 Minuten. Der Parafilm Methode zur Kapselung Follikel in Fibrinogen Alginatlösung (C: I-III). Fibrinogen-Alginat-Lösung (7,5 ul) ist auf dem Parafilm beschichteten Objektträger pipettiert und Follikel sind individuell auf jeden Tropfen übertragen nach dem Spülen (Ci, ii). Thrombin-Lösung (7,5 ul) ist zu jedem Tropfen (C-iii) aufgenommen. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3d_e.jpg" alt="Abbildung 3d-e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3d-e"> Abbildung 3d - e. Die Tropfen werden mit einem zweiten Parafilm beschichteten Objektträger abgedeckt und die FA-IPN ist in den Inkubator für 5 Minuten vernetzt. (D) Die gekapselten Follikel zum Wachstum Medien in einer 96-Well-Platte übertragen. (E) Ein Bild von einem gekapselten Follikel in der FA-IPN (weißer Pfeil). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Fibrin Abbau durch den wachsenden Follicle. Follikel degradieren das Fibrin des FA-IPN während der Anzucht, die durch eine klare Kreis um die Follikel nachgewiesen wird. Der Follikel ist 3D-Architektur wird durch die restlichen Alginat unterstützt. Am Tag 0 (D0) das Fibrin noch intakt ist und die Matrix um die Follikel ist bewölkt, nach 1 Tag in Kultur (D1) die klare Ring um die Follikel erscheint (weißer Pfeil) und die Fibrinabbauprodukten vorne weiterhin radial am Tag zu erweitern 2 (D2) und Tag 4 (D4) der Kultur. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Bilder von Follikelwachstum. Repräsentative Bilder ofsecondary Follikelwachstum in der FA-IPN am Tag 0 (A), 4 (B), 6 (C) und 8 (D) der Kultur. Nach 8 Tagen wurden Antralfollikeln in vitro gereift, und die daraus resultierenden MII-Oozyten Bühne gezeigt werden (E, die Polkörper mit schwarzer Pfeil). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Fibrin Degradation wurde durch Aprotinin gehemmt. Wachsenden Follikel am Tag 2, 4, 10 und 12 sind in der ersten Zeile angezeigt. Aprotinin in Konzentrationen 0,01 TIU / mL (zweite Reihe) und 0,1 TIU / mL wurde das Kulturmedium an den Tagen 0, 2 und 4 aufgenommen. Nur Follikel Kulturen mit 0,01 TIU / mL Aprotinin degradiert das Fibrin nach Aprotinin Entfernung und erreicht antral Bühne. Follikel in 0,1 kultiviert TIU / mL Aprotinin nicht in der FA-IPN wachsen. <table border="1"><tbody><tr><td> Abkürzung </td><td> Vollständiger Name </td></tr><tr><td> CO 2-Inkubator </td><td> 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 </td></tr><tr><td> COC </td><td> Cumulus Oozyten-Komplex </td></tr><tr><td> 3D </td><td> 3-dimensionale </td></tr><tr><td> DM </td><td> Dissection Medien </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Epidermal Growth Factor </td></tr><tr><td> FA-IPN </td><td> Fibrin-Alginat durchdringendes Netzwerk </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Fetal Bovine Serum </td></tr><tr><td> GM </td><td> Nährmedien </td></tr><tr><td> GV </td><td> Keimbläschen </td></tr><tr><td> hCG </td><td> Humanes Choriongonadotropin </td></tr><tr><td> ITS </td><td> Insulin Transferrin Selen ergänzen </td></tr><tr><td> IVF Gericht </td><td> Zentrum und 60 mm in-vitro-Fertilisation Gericht </td></tr><tr><td> MM </td><td> Wartung Medien </td></tr><tr><td> MII Bühne Eizelle </td><td> Metaphase II Stadium Eizelle </td></tr><tr><td> rFSH </td><td> Rekombinante Follicular Hormon </td></tr><tr><td> TBS </td><td> Tris-gepufferter Kochsalzlösung </td></tr><tr><td> TIU </td><td> Trypsin hemmenden Einheiten </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Abkürzungen

<ol><li>Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+maturation%2C+fertilization+and+embryo+development+of+immature+oocytes+from+early+preantral+follicles+from+prepuberal+mice+in+a+simplified+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system.</a> Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).</li>
<li>Smitz, J., Cortvrindt, R., Hu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+combined+with+recombinant+human+chorionic+gonadotrophin+improves+meiotic+progression+in+mouse+follicle-enclosed+oocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor combined with recombinant human chorionic gonadotrophin improves meiotic progression in mouse follicle-enclosed oocyte culture.</a> Human Reproduction. 13, 664-669 (1998).</li>
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Die vorgestellten Ovarialfollikel Verkapselungsmethode in einem FA-IPN ermöglicht Follikel Kultur in einer 3D-Umgebung in vitro. Ein FA-IPN ist ein dynamisches, Zell-responsive Matrix, in der die ersten mechanischen Eigenschaften durch die Kombination der beiden Fibrin und Alginat bestimmt werden. Während der Kultur, aktiviert die gekapselte Follikel Proteasen, die nur eine Komponente des IPN, das Fibrin, das in einer allmählich abnehmenden Gel Steifigkeit, die ausschließlich durch die restlichen Alginat am End...

<table><tbody><tr><td>Fetuin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Roche Group</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>039-00475</td><td>40 mM</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>rFSH</td><td>National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CG-5</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1603</td><td></td></tr><tr><td>ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884-1VL</td><td></td></tr><tr><td>L-15</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM+Gluta MAX</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>32561</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28379</td><td></td></tr><tr><td>Tisseel-Fibrin-Kit</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>921030</td><td></td></tr><tr><td>Natrium-Alginat</td><td>FMC BioPolymers</td><td>LF200DL</td><td>Mw 418kDa</td></tr></tbody></table>

eine methode zur ovarialfollikel encapsulation und kultur in einem proteolytisch degradable 3 dimensional-system

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

Die Ovarialfollikel ist die funktionelle Einheit des Eierstocks, dass Sexualhormone absondert und unterstützt Eizellreifung. In-vitro-Follikel-Techniken bieten ein Werkzeug zur Modellierung Follikelentwicklung, um Grundlagen der Biologie zu untersuchen, und werden weiter als eine Technik, um die Fruchtbarkeit in der Erhaltung entwickelt Klinik 1-4. Unsere in vitro-Kultur-System nutzt Hydrogele, um die einheimischen Eierstock-Umgebung durch die Beibehaltung des 3D-follikuläre Architektur, Zell-Zell-Interaktionen und parakrine signalisiert, dass direkte Follikel Entwicklung 5 zu imitieren. Bisher wurden Follikel erfolgreich in Alginat, einem inerten Algen gewonnene Polysaccharid, dass die Gelbildung unterzogen mit Calciumionen 6-8 kultiviert. Alginat-Hydrogele in einer Konzentration von 0,25% w / v gebildet waren die permissive für Follikel Kultur, und behielt die höchste Entwicklungskompetenz 9. Alginat-Hydrogele sind nicht abbaubar und somit eine Erhöhung der Follikel Durchmesser ergibt sich eine Druckkraft auf die Follikel, Follikel Wachstum 10 auswirken können. Wir Folge entwickelte eine Kultur, das auf einem Fibrin-Alginat durchdringendes Netzwerk (FA-IPN), in dem eine Mischung aus Fibrin und Alginat gleichzeitig gelierte basiert. Diese Kombination bietet eine dynamische mechanische Umwelt, weil beide Komponenten Matrix Steifigkeit beitragen zunächst, allerdings verschlechtern Proteasen, die durch den wachsenden Follikel sezerniert Fibrin in der Matrix so dass nur Alginat zu unterstützen. Mit dem IPN, kann das Alginat-Gehalt unter 0,25%, was nicht mit Alginat allein 5 möglich reduziert werden. So, wie die Follikel erweitert, wird sie erleben eine reduzierte Druckkraft aufgrund der geringeren Feststoffgehalt. Hier beschreiben wir eine Kapselung Verfahren und eine in-vitro-Kultur-System für Eibläschen in einem FA-IPN. Die dynamisch-mechanischen Umfeld ahmt die natürliche Eierstock-Umfeld, in dem kleine Follikel in eine starre Kortex befinden und bewegen, um eine permissive Medulla als sie erhöhen in Größe 11. Die abbaubaren Komponente kann als besonders kritisch für die klinische Übersetzung, um die größer als 10 6-fachen Anstieg des Volumens, dass die menschliche Follikel in der Regel durchlaufen in vivo zu unterstützen.

Eine neue Methode zur Ovarialfollikel Kapselung in einer 3D-Fibrin-Alginat durchdringendes Netzwerk beschrieben. Dieses System kombiniert strukturelle Unterstützung mit proteolytischen Abbau der Entwicklung von unreifen Follikeln Unterstützung, um zu reifen Eizellen zu produzieren. Diese Methode kann zur Kultur Zellaggregate angewendet werden, um Zell-Zell-Kontakte ohne Beschränkungen für die Ausweitung aufrecht zu erhalten.

Eine Methode zur Ovarialfollikel Encapsulation und Kultur in einem Proteolytisch Degradable 3 Dimensional-System

Der Ovarialfollikel ist die funktionelle Einheit des Eierstocks, die Sexualhormone sekretiert und die Reifung der Oozyte unterstützt. In-vitro-Follikeltechniken bieten ...

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Einschließungsmethode von Eierstockfollikeln in einem fibrin-alginathaltigen, miteinander verflochtenen Netzwerk für die Kultur in vitro. Sekundäre Follikel bestehen aus einem zentral gelegenen Oozyt, der von mehreren Schichten somatischer Zellen umgeben ist, die die Oozytentwicklung unterstützen. Die Einschließung und Kultur der Follikel in einer dreidimensionalen Umgebung ermöglicht die Ausdehnung der Follikel, unterstützt gleichzeitig die Kommunikation zwischen mehreren zellulären Kompartimenten und erhält die kugelförmige Struktur des Follikels aufrecht. Im ersten Schritt dieses Protokolls werden sekundäre Follikel aus Eierstöcken 16 Tage alter Mäuse für die Tropfenmethode isoliert.Spülen Sie die Follikel und überführen Sie sie in eine Verkapselungslösung. Aspirieren Sie jeden Follikel mit Fibrinogen-Alginat-Lösung und pipettieren Sie ihn in Thrombin-Calcium-Lösung, und lassen Sie die Kügelchen für die Paraform-Methode vernetzen. Überführen Sie einzelne Follikel in Tropfen der Fibrinogen-Alginat-Lösung auf einem mit Paraform beschichteten Objektträger und geben Sie Thrombin-Lösung hinzu, um die F-A-I-P-N-Vernetzung zu initiieren.Überfü

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Kultur von normalen Zellen in ihrer dreidimensionalen Kontext stellt eine alternative Methode zur frühen Ereignisse für die zelluläre Transformation und Tumorentstehung erforderlich studieren. Diese Methode wird verwendet, um normale Eierstock-und Eileiter Zellen wachsen zu frühen Ereignisse bei Eierstockkrebs Bildung zu studieren.

Alginat Hydrogele für Three-Dimensional Organ Culture der Eierstöcke und Eileitern

Dieses Video beschreibt die Protokolle zur Verkapselung von Schweine-Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) in Fibrin-Alginat-Kügelchen, um eine 3D-Kultur zu etablieren. Dieses In-vitro-Reifungssystem hält die normale Zell-zu-Zell-Kommunikation aufrecht, stellt die Eizellreifung sicher und behält die Lebensfähigkeit bei.

3D-Kultur von Schweine-KOK: Ein Verfahren zur Verkapselung von Kumulus-Oozytenkomplexen in Fibrin-Alginat-Polymer-Hydrogel-Kügelchen

In diesem Video beschreiben wir ein Protokoll für die Verkapselung von Schweineeizellen in hydrophoben Mikrobioreaktoren.

Mikrobioreaktorsystem aus flüssigem Marmor: Ein 3D-Kulturprotokoll für die Verkapselung von Schweineeizellen

Dieses Protokoll beschreibt die Primärkultur / Co-Kultur von Maus-Eierstockgewebe, mit Eierstöcke von neugeborenen Mäusen und individuelle Eibläschen von präpubertären Mäusen. Die Kulturtechniken unterstützt Entwicklung in einer hoch physiologischer Weise ermöglicht Untersuchung der Wirkung von äußeren Mitteln an den Eierstöcken und der Wechselwirkungen zwischen Follikeln.

Kultur und Co-Kultur von Maus Eierstöcke und Eibläschen

Hier werden zwei Protokolle für die Verkapselung von Schweineeioozyten unter 3D-Kulturbedingungen vorgestellt. In der ersten werden Cumulus-Oozyten-Komplexe (COCs) in Fibrin-Alginat-Perlen eingekapselt. In der zweiten werden sie mit fluorierten Ethylenpropylenpulverpartikeln (Mikrobioreaktoren) umschlossen. Beide Systeme sorgen für optimale Bedingungen, um ihre 3D-Organisation aufrechtzuerhalten.

Proteolytisch abgebaute Alginat-Hydrogele und hydrophobe Mikrobioreaktoren zur Poren-Oozyten-Verkapselung

Dieses Protokoll beschreibt ein neuartiges dreidimensionales (3-D) Kulturmodell, bei dem ein Tyramin-gebundenes Hyaluronan-Hydrogel verwendet wird, um präantrale Follikel aus dem Eierstock der Maus zu verkapseln und zu kultivieren. Wir beschreiben auch zwei Ansätze zur Kryokonservierung von Eierstockfollikeln durch Vitrifikation.

Anwendung eines neuartigen Hyaluron-Hydrogels für die dreidimensionale Follikelkultur und Methodik für die Kryokonservierung von Ovarialfollikeln in der Maus

Wir beschreiben Methoden zur Kultivierung von Ovarialfollikeln in einer neuartigen gerüstfreien Agaroseform, die die in vitro Gametogenese ergänzen.

Herstellung und Verwendung von anpassbaren Agaroseformen für die gerüstfreie Ovarialfollikelkultur von Mäusen

Wir beschreiben Methoden zur Isolierung somatischer maus-ovarialer Zellen aus einem stroma-angereicherten Anteil des Eierstocks und zur Erzeugung maus-ovarialer somatischer Organoide mittels eines gerüstfreien Ansatzes.

Untersuchung des Ovarialmikroumfelds: Methoden zur Isolierung, 2D-Kultur und organoiden Kultur somatischer Maus-Ovarialzellen

Es wird ein Verfahren zur Herstellung einer 3-dimensionalen Matrix, bestehend aus Kollagen Typ I und primären humanen Fibroblasten beschrieben. Diese organotypischen Gel dient als nützliches Substrat invasive Zellmigration beurteilen, da es grundlegende Funktionen von Gewebestroma nachahmt und ist offen für viele Formen der Mikroskopie.

Organotypische Collagen I Assay: A Temperguss Platform to Cell Verhalten in 3-Dimensional Kontext beurteilen

Selbstorganisierte Monoschichten (SAMs) aus langkettigen Alkan Thiolen auf Gold gebildet ist gut definierten Substraten für die Bildung von Protein-Muster-und Zell-Entbindung. Mikrokontaktdruck von Hexadecanthiol mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempel durch Verfüllung mit folgten einem Glykol-terminierte Alkanthiol Monomer erzeugt ein Muster, bei dem Protein und Zellen adsorbieren nur den Stempel Hexadecanthiol Region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Erfahren Sie die Kapselung von Ovarialfollikeln in einem 3D-Fibrin-Alginate-Netzwerk zur In-vitro-Kultur. Diese Methode unterstützt das Wachstum unreifer Follikel zu reifen Eizellen.

Eine Methode zur Ovarialfollikel Encapsulation und Kultur in einem Proteolytisch Degradable 3 Dimensional-System

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