Name: Ausweiden der Maus Glaskörper und Netzhaut für Proteomik-Analysen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: Erfahren Sie die Methode zur Isolierung von Glaskörper, Netzhaut und Linse aus dem Mäuseauge für Proteomik-Analysen. Diese Technik ermöglicht präzise Gewebetrennung durch Zentrifugation.

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Die Finanzierung wurde von Fight for Sight und Forschung zur Erblindung zu verhindern.

1. Anterior Segment Dissektion. <ol><li> Skleralgewebe hinter dem Limbus ist mit einem 0,22 ForceP und der ganzen Welt (Augapfel) stabilisiert wird erfasst. </li><li> Eine mikrochirurgische Klinge wird verwendet, um eine lineare Schnitt in der Hornhaut von Limbus zu Limbus zu machen. </li><li> Einer 0,12 Colibri ForceP wird dann verwendet, um die Hornhaut an den Einschnitt zu begreifen. </li><li> Die Vorderkammer Flüssigkeit wird dann mit einer Weck-Cel chirurgischen Speer absorbiert. </li></ol> 2. Objektiv Ausnehmen. <ol><li> Einer 0,12 Colibri ForceP Greifen der Hornhaut wird verwendet, um den Globus zu stabilisieren. </li><li> Eine feine gebogene Nadel-Halter (oder gebogenen Kornzange) ist hinter der Linse in Richtung der hinteren Seite des Globus eingesetzt. Der Nadelhalter ist teilweise geschlossen, und nach vorne gezogen. Druck ausgeübt wird, mit der Pinzette auf der äußeren Oberfläche der Sklera, der die Linse schiebt nach vorne durch die Hornhaut-Schnitt, während die Augen Wand intakt. Der Glaskörper wird als durchscheinende Gel und ist teilweise Anhänger der Linse. </li><li> Das Objektiv-Glaskörpergewebe wird dann in einer gefilterten Zentrifugenröhrchen mit 20 Mikroliter Protease Inhibitor Cocktail (Roche) in PBS gelöst platziert. </li></ol> 3. Retina Ausnehmen. <ol><li> Weiter um den Globus mit 0,12 Colibri Pinzette greifen die Hornhautschnitt stabilisieren. </li><li> Eine feine gebogene Nadel-Halter (oder gebogenen Kornzange) ist so weit hinter den Globus wie möglich platziert, in der Nähe des Sehnervs. Der Nadelhalter ist teilweise geschlossen, und nach vorne gezogen. Druck ausgeübt wird, mit der Pinzette auf der äußeren Oberfläche der Lederhaut, die die Netzhaut drängt nach vorne durch die Hornhaut-Schnitt. Der Glaskörper wird als durchscheinende Gel Anhänger der Netzhaut. Die Netzhaut wird visualisiert in Form eines gelben, vaskularisierten Gewebe. Jeder Streifen von pigmentierten Gewebe entfernt mit einer Pinzette abgezogen werden. </li><li> Die Netzhaut-Glaskörper Gewebe wird dann in den gefilterten Zentrifugenröhrchen mit dem Objektiv-Glaskörpergewebe platziert. </li></ol> 4. Gefilterte Zentrifugation. <ol><li> Die gefilterte Zentrifugenglas wird in einer Tischzentrifuge gestellt. Spin bei 14.000 x G für 12 Minuten. </li><li> Saugen Sie das Eluens aus der unteren Kammer, die den Glaskörper. Die Netzhaut bleibt in der oberen Kammer. Diese Proben können für Protein-Untersuchungen genutzt werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Vitreous Proben wurden durch SDS-PAGE (Abbildung 2) analysiert. Die Proben wurden auch für eine enzymatische Aktivität Assay (Abbildung 3). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Maus Augendiagramm. Querschnitts-Schema des humanen und Maus-Auge zeigt die relative kleinere Glaskörper Volumen in der Maus Auge aufgrund seiner größeren Objektiv. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Eindimensionale SDS-PAGE von Maus Glaskörper und Netzhaut. Protein-Profile von Maus Glaskörper, 13,6 mg / mL (Bahn 1), und der Netzhaut, 11,35 mg / mL (Spur 2). Gel-Elektrophorese wurde bei 150 kV für 45 Minuten durchgeführt, gefärbt mit Flamingo fluoreszierende Gel färben und visualisiert mit Hilfe eines VersaDoc Imaging Systems (BioRad, Hercules, CA). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Superoxiddismutase (SOD) Enzymaktivität in der Maus und Mensch Glaskörper. Messung von insgesamt SOD-Aktivität (SOD Aktivität kolorimetrischen aasay Kit, # AB65354, Abcam, Inc, Cambridge, MA) wurde am Glaskörper und Netzhaut durch das Ausnehmen von DBA und Albino-Mäusen gesammelt wurden. Dies wurde SOD-Aktivität in menschlichen Glaskörper Kern und menschliche Netzhaut aus post-mortem menschlichen Spender Augen gesammelt, um die relative Aktivität zu bestimmen. Das unverwässerte Glaskörper Kernproben wurden manuell abgesaugt mit einer 23-Gauge-Nadel, 11 und Netzhaut war von blühenden das Auge und Schneiden des Gewebes entfernt von der RPE / Aderhaut-Komplex gesammelt. Obwohl der Test nicht zwischen SOD-Isoformen unterscheiden, wird der Glaskörper SOD-Aktivität wahrscheinlich SOD3 reflektieren, da sie die einzige extrazelluläre Isoform ist 12 Die Netzhaut SOD-Aktivität wird wahrscheinlich alle drei SOD-Isoformen spiegeln:. Intrazellulären SOD1, mitochondriale SOD2 und extrazellulären SOD3. 12 Für hochsensible enzymatischen Assays, einschließlich dieser SOD-Assay wird die Möglichkeit einer Kreuzkontamination von Proteinen möglich und bedarf weiterer Untersuchung. Fehlerbalken stellen SEM.

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</ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Association for Research and Vision in Ophthalmology Anweisung für den Einsatz von Tieren in Ophthalmic und Vision Research durchgeführt.

Transgene Mäuse sind ein wichtiges Modell für die Untersuchung der Netzhaut und Glaskörper Krankheit. 6-10 Die Maus Glaskörper, umfasst jedoch einen deutlich kleineren Anteil des Auges im Vergleich zu den menschlichen Glaskörper aufgrund der großen Linse in der Maus Auge. 5 Diese macht es schwierig zu isolieren und zu reinigen der Maus Glaskörper. Das Verständnis der Protein-Veränderungen mit den Glaskörper bei Krankheiten wie proliferative diabetische Retinopathie, altersbedingte Makula-Degeneration, Uveitis und Netzhautablösung assoziiert wird Einblick in die Mechanismen geben, durch die sie Fortschritte. Diese visualisiert experimentelle Protokoll bietet die Möglichkeit zu erhalten und zu reinigen der Maus Glaskörper, bei gleichzeitiger Maximierung der Ausbeute an Protein für die enzymatische und Proteom-Analysen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Catalog Number </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> 15 °, BD Beaver Mikrochirurgische Klinge </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 374881 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 Fine-Castroviejo Naht Zange </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1805 </td><td></td></tr><tr><td> 0,12 Colibri Zange </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 2 / 132 </td><td></td></tr><tr><td> Microcon Zentrifugalfilter Ultracel YM-100 oder YM-50 </td><td> Millipore </td><td> 42412, 42415 </td><td></td></tr><tr><td> SOD Aktivität kolorimetrischen Assay Kit </td><td> Abcam </td><td> Ab65354 </td><td></td></tr><tr><td> Weck-Cel chirurgischen Speere </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td><td></td></tr><tr><td> Protease-Inhibitor-Cocktail </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td></td></tr><tr><td> Flamingo fluoreszierende Gel Fleck </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-04910 </td><td></td></tr></tbody></table>

ausweiden der maus glaskörper und netzhaut für proteomik-analysen

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

Während sich die Maus Netzhaut als ein wichtiges genetisches Modell für erbliche Netzhauterkrankung entstanden ist, bleibt die Maus Glaskörper, erkundet zu werden. Der Glaskörper ist eine sehr wässrige extrazellulären Matrix, die über der Netzhaut, wo intraokularen sowie extraokulären Proteine ​​akkumulieren während der Erkrankung. 1-3 Abnormal Interaktionen zwischen Glaskörper und Netzhaut zu Grunde liegen mehrere Krankheiten wie Netzhautablösung, proliferative diabetische Retinopathie, Uveitis und proliferative Vitreoretinopathie. 1 , 4 Die relative Maus Glaskörper Volumen ist deutlich kleiner als die menschliche Glaskörper (Abbildung 1), da die Maus Linse nimmt fast 75% seines Auges. 5 Diese hat biochemische Untersuchungen der Maus Glaskörper gemacht herausfordernd. In diesem Video-Artikel präsentieren wir eine Technik zu sezieren und zu isolieren, die Maus Glaskörpers von der Netzhaut, die ermöglichen die Verwendung von transgenen Mausmodellen, klarer zu definieren, welche Rolle dieser extrazellulären Matrix bei der Entwicklung von vitreoretinale Krankheiten werden.

Die Dissektionstechnik zeigt Ausnehmen des Glaskörpers, der Netzhaut und Linse aus dem Auge der Maus, die Trennung durch Zentrifugation und Charakterisierung mit Protein-Assays.

Ausweiden der Maus Glaskörper und Netzhaut für Proteomik-Analysen

Während sich die Netzhaut der Maus als wichtiges genetisches Modell für hereditäre Netzhauterkrankungen erwiesen hat, ist der Glaskörper der Maus noch weitgehend unerforscht. Der Glaskörper ist ...

Das menschliche Auge ist mit einer flüssigen extrazellulären Matrix gefüllt, die als Glaskörper bezeichnet wird, im Mausauge. Dieser Raum ist größtenteils von der Linse eingenommen. Um den Glaskörper und die Netzhaut zu isolieren, müssen wir zuerst das vordere Segment präparieren, das Auge mit einer Pinzette stabilisieren und mit einer äußerst scharfen Klinge einen einzelnen Schnitt durch die Hornhaut führen.Eine stumpfe Klinge kann die Hornhaut einreißen und erfordert mehrere Schnitte. Ein WEX-Zellschwamm wird verwendet, um Flüssigkeit in der vorderen Augenkammer aufzusaugen. Die Pfeile zeigen an, wo wir mit der Pinzette die Linse und den Glaskörper herausdrücken, die Pinzette teilweise schließen und nach vorne ziehen.Die Linse sieht aus wie eine klare Kugel, und dahinter befindet sich das Glaskörpergel. In diesem Beispiel bleibt der Glaskörper an der Rückseite der Linse haften; um die Netzhaut zu isolieren, werden die Netzhautzangen weiter hinten in der Nähe des Sehnervs angesetzt, vorsichtig zusammengedrückt und nach vorne gezogen. Die Netzhaut erscheint als gelartiges, gelbes Material.In einigen F&auml;llen treten Netzhaut, Glask&ouml;rper und Linse als ein einziges Gewebe aus. Der n&auml;chste Schritt besteht darin, diese drei Gewebe mithilfe einer Filterzentrifugationsvorrichtung zu isolieren und zu trennen. Das Filterst&uuml;ck wird in die Oberseite eines Einor-Gef&auml;&szlig;es gegeben, und wir f&uuml;gen etwas phosphatgepufferte Kochsalzl&ouml;sung hinzu.Während die einzelnen Gewebe isoliert werden, werden sie in das obere obere Gefäß mit dem Filter gegeben. Die Linsen befinden sich in der linken oberen Ecke und das Netzhaut-Vitreus-Gewebe an der rechten unteren Stelle. Die Röhrchen werden in eine Mikrozentrifuge gegeben und 12 Minuten lang mit 14.000 Gs zentrifugiert.Das Glask&ouml;rpermaterial sammelt sich am Boden des Einhorntubenlinsenrohrs, w&auml;hrend die Netzhaut in der oberen Phase verbleibt. Mit einer Pinzette trennen wir die Linse von der Netzhaut und isolieren anschlie&szlig;end die Netzhaut aus der oberen Kammer. All diese Gewebe k&ouml;nnen in Einhorntuben gegeben und anschlie&szlig;end f&uuml;r Proteomik-Analysen aufgearbeitet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt eine effektive Technik zur Differenzierung und seziert die verschiedenen semi-transparente Strukturen des menschlichen Glaskörper in post mortem Augen.

Dissection of Human Glaskörper Elemente für Proteomanalyse

Trypsin Digest ist eines der am häufigsten verwendeten Methoden, um retinale Gefäßsystem zu analysieren. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren im Detail, einschließlich der wichtigsten Änderungen, die Technik zu optimieren und entfernen Sie die nicht-vaskulären Gewebe und gleichzeitig die gesamte Architektur der Schiffe.

Trypsin Digest Protokoll zum Analysieren des retinalen Gefäßsystem eines Maus-Modell

Wir entwickelten eine horizontale Schnittpräparat der erwachsenen Säugetier-Netzhaut mit der Ebene parallel zu der Netzhautoberfläche sectioning. Dendritische Bereichen nonradially orientierte Netzhautneuronen wurden nicht abgeschnitten, so dass die Untersuchung der Signalverarbeitung mit Patch-Clamp-und Imaging-Techniken.

Vorbereitung von Horizontal Scheiben der erwachsenen Maus Retina für elektrophysiologische Untersuchungen

Dieses Protokoll stellt zwei Techniken vor, um die subzellulären Kompartimente von murinen Stäbchen-Photorezeptoren für die Proteinanalyse zu isolieren. Die erste Methode verwendet lebendes Netzhaut- und Zellulosefilterpapier, um die äußeren Segmente der Stäbchen zu trennen, während die zweite Methode lyophilisierte Netzhaut und Klebeband verwendet, um die inneren und äußeren Segmentschichten der Stäbchen abzuziehen.

Zwei Peeling-Methoden zur Isolierung von Photorezeptor-Zellkompartimenten in der Netzhaut der Maus zur Proteinanalyse

Diabetische Retinopathie ist eine der Hauptursachen für Blindheit. Histologie, Blut-Netzhaut-Schranken-Abbauassay und Fluoreszenzangiographie sind wertvolle Techniken, um die Pathophysiologie der Netzhaut zu verstehen, was das effiziente Arzneimittelscreening gegen diabetische Retinopathie weiter verbessern könnte.

Retinale pathophysiologische Bewertung in einem Rattenmodell

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von murinen postnatalen retinalen Endothelzellen, die für Zellertrag, Reinheit und Lebensfähigkeit optimiert sind. Diese Zellen eignen sich für Next-Generation-Sequenzierungsansätze.

Isolierung von retinen retinalen Endothelzellen für die Sequenzierung der nächsten Generation

Es wurde ein Schutzassay entwickelt, um die Widerstandsfähigkeit des retinalen Gefäßsystems gegen den Tod durch Diabetes/diabetische Retinopathie-bedingte Beleidigungen wie oxidativen Stress und Zytokine zu überwachen.

Ein Assay zum Nachweis des Schutzes des Netzhautgefäßsystems vor diabetesbedingtem Tod bei Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte zur Vorbereitung von Netzhautproben für die Volumenelektronenmikroskopie, wobei der Schwerpunkt auf den strukturellen Merkmalen retinaler Photorezeptorterminalien liegt.

Präparation von Netzhautproben für die Volumenelektronenmikroskopie

Die Perizyten in retinalen Gefäßen wurden durch Immunfluoreszenzfärbung mit Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptoren β nach retroorbitaler Injektion von fluoreszierendem Tomatenlektin untersucht. Die markierte Netzhaut wurde weiter mit der Gewebereinigungsmethode behandelt und als Ganzes montiert, um die dreidimensionalen Ansichten der Perizyten, die das retinale Gefäßsystem umgeben, unter einem konfokalen Mikroskop zu visualisieren.

3D-Visualisierung von retinalen vaskulären Perizyten bei Mäusen durch Immunfärbung 

Die Netzhaut weist eine komplexe räumliche Organisation über ihre laminare Struktur auf. Moderne räumliche Transkriptomik- und Sequenzierungstechniken erfordern Gewebeschnitte mit einer Dicke von &lt; 20 μm, was ihre Anwendbarkeit in der Netzhautforschung einschränkt. Diese frisch gefrorene Kryosektionsmethode erzeugt dünne Gesichtsabschnitte der Netzhaut von Mäusen unter Beibehaltung planarer räumlicher Beziehungen und ermöglicht so eine umfassende molekulare Kartierung über Laminae hinweg.

En face Kryosektion der Netzhaut der Maus für die hochdimensionale räumliche molekulare Analyse

Erfahren Sie die Methode zur Isolierung von Glaskörper, Netzhaut und Linse aus dem Mäuseauge für Proteomik-Analysen. Diese Technik ermöglicht präzise Gewebetrennung durch Zentrifugation.

Ausweiden der Maus Glaskörper und Netzhaut für Proteomik-Analysen

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