Name: Isolierung von Fidelity Varianten von RNA-Viren und Charakterisierung von Virus-Mutation Frequency (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 10 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Fidelity-Varianten von RNA-Viren und die Charakterisierung der Mutationsfrequenz. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von Polymerase-Mutationen, die die Fehlerrate während der viralen Replikation beeinflussen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Medizin-und Gesundheitsforschung Zuschuss von der Stadt Paris, die Französisch Nationalen gewähren ANR-09-JCJC-0118-1, und der ERC Starting Grant RNAvirusPopDivNVax Projekt nicht unterstützt. 242719.

<ol><li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+%28in%29fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li>
<li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+site+control+of+an+active+site+fidelity+checkpoint+in+a+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase.</a> J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).</li>
<li>Korneeva, V. S., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+of+the+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase%3A+fidelity%2C+replication+speed%2C+and+initiation+mechanism+determined+by+a+residue+in+the+ribose-binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket.</a> J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).</li>
<li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li>
<li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li>
<li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quasispecies+diversity+determines+pathogenesis+through+cooperative+interactions+in+a+viral+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.</a> Nature. 439, 344-348 (2006).</li>
<li>Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+attenuated+virus+vaccines+by+controlling+replication+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.</a> Nat Med. 14, 154-161 (2008).</li>
<li>Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribavirin%27s+antiviral+mechanism+of+action%3A+lethal+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis.</a> J Mol Med. 80, 86-95 (2002).</li>
<li>Coffey, L. L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li>
<li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li>
<li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ribavirin+antiviral+efficacy+via+nucleoside+transporter-mediated+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance.</a> J Virol. 83, 4538-4547 (2009).</li>
<li>Levi, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fidelity+variants+of+RNA+dependent+RNA+polymerases+uncover+an+indirect%2C+mutagenic+activity+of+amiloride+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds.</a> PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).</li>
<li>Sierra, S., Dávila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis%3A+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li>
<li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lethal+mutagenesis+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus+%28LCMV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).</a> Virology. 308, 37-47 (2003).</li>
<li>Sierra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+decreased+sensitivity+to+ribavirin%3A+implications+for+error+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe.</a> J Virol. 81, 2012-2024 (2007).</li>
</ol>

Wahl der Zell-Linie. Die Wirksamkeit von Basis-Analoga als RNA Mutagene korreliert mit ihrer relativen Aufnahme durch verschiedene Zelltypen 11. Wenn der Zelllinie, die normalerweise für Viruspassage dient erweist sich als refraktär Aufnahme oder zu empfindlich (hohe Zelltoxizität) mutagen, kann es notwendig sein, um eine andere Zelllinie, die diese Anforderungen erfüllt und ist immer noch permissive die virale Replikation verwenden. Sobald die mutagen Widerstand Variante isoliert ist, kann der Rest der Charakterisierung in der ursprünglichen, bevorzugte Zelllinie durchgeführt werden. In unserer Erfahrung, HeLa Zellen leicht nehmen mutagen; BHK-Zellen benötigen bis zu 10-fach höhere Konzentrationen und Vero-Zellen sind refraktär gegenüber mutagen Aufnahme. Wahl des mutagen. Bei dem Versuch, Treue-Varianten durch Mutagenbehandlung, die Wahrscheinlichkeit eines Erfolgs zu isolieren wird erhöht, wenn mehr als eine Art von Mutagen verwendet wird. Basis analoger Mutagene unterschiedlicher Struktur, die fälschlicherweise in Genome während der Replikation eingebaut wird überwiegend induzieren Ergebnis in eine bestimmte Untergruppe von Mutationen in den nachfolgenden Replikationszyklen: Ribavirin behandelt Gefälligkeiten GtoA und CtoU Übergang Mutationen 12; 5-Azacytidin hat eine ähnliche Tendenz, mit der Neben der CtoG und GtoC Transversionen 13; 5-Fluorouracil bevorzugt induziert Atog und UTOC Übergänge 14. Alternativ höhere Konzentrationen von Mg 2 + oder Mn 2 + können dem Medium ergänzt werden, um die gesamte Mutationsfrequenz von RNA-Viren, ohne die Vorspannung über 12 beschrieben zu erhöhen. Je nach Virus &quot;Codon-Sequenzen und die Codon-Änderungen erforderlich, um eine Treue-Variante zu erzeugen, einige von diesen Bedingungen wird die Entstehung dieser Variante gegenüber anderen zu bevorzugen. Für die höheren Treue Poliovirus G64S und Coxsackie Virus A372V, Ribavirin Behandlung am ehesten für die Varianten ausgewählt, weil die erforderliche Atog Übergang an die Codon-Website entsprach der Mutationen hauptsächlich durch dieses Ribavirin generiert. MOI vs Populationsgröße. In der Virologie, Pay-Protokolle für Gewebekultur Infektion besonderes Augenmerk auf die Multiplizität der Infektion (MOI), um die Ansammlung von defekten störende Partikel (low MOI) zu vermeiden oder Rekombination zwischen Viren zu fördern (hohes MOI), für Beispiel. So wählen Sie für die Entstehung Veranstaltungen über serielle Passage ist es auch wichtig, Viruspopulation Größe zu betrachten. Da die resistente Mutante existiert zunächst bei einer niedrigen Frequenz ist es am besten, einen möglichst großen Bevölkerungszahl wie möglich von einem Kanal übertragen auf die nächste (10 5 -10 6 Viren, z. B.) nicht zu verlieren diese neuen Varianten bei jeder Passage. Intensivierung der Größe von gut oder Kolben (Anzahl der Zellen infiziert) kann dazu beitragen, den Anstieg der MOI zu minimieren, wenn dies von Belang ist. Auf der anderen Seite, für Experimente, in denen die Empfindlichkeit eines Virus mutagen getestet wird, ist gering MOI Infektion durchgeführt, um die Anzahl der Replikationszyklen vorkommende in das Experiment zu erhöhen und die Rettung von mutagenisierten Genomen zu vermeiden durch eine höhere Fitness Genome durch Komplementation bei co-infizierten Zellen. Dies ist wichtig, da die Mutationen für die Nachkommenschaft Genome in der ersten Runde der Replikation generiert wird nicht sofort erkannt werden. Die meisten dieser mutagenisierten RNAs noch in Virion verpackt werden. Es ist in die nächste Runde der Infektion, die letalen Mutationen in diesen Genomen wird in einer abgebrochenen Replikationszyklus führen, und Reduzierung der Virustiter. Es kann notwendig sein, um für mehrere Runden der Akkumulation von Mutationen erlauben, bevor eine signifikante Wirkung von tödlichen Mutagenese zu beobachten ist. Schließlich, wenn mehr als die Passage-Serie in der Gegenwart von mutagen, die Virustiter bis Aussterben weiter abfällt, dann sollte der Forscher versuchen Passagierung Virus in allmählich steigenden Mengen von mutagen (ausgehend von einem sehr niedrigen Konzentrationen). Isolation und Generierung der RNA mutagen resistenten Klon aus der RNA mutagen-resistenten Population. RNA Mutagene einführen mehrere zufällige Mutationen zu jedem Genom, sondern Selektion auf Resistenz wird nur bereichern (und zu beheben, um Consensus-Sequenz) die Resistenz-Mutation. Zur Identifizierung dieser Mutation, wir Abfolge der Mutagen resistente Population (Konsens der Bevölkerung) und nicht die einzelnen Viren. Daher sind die einzigen, zufällige Mutationen durch die mutagen erstellt wurden, nicht in der Reihenfolge erkannt, nur die Mutationen, die im Konsens Veränderungen nach Auswahl, zu finden sind. In unserer Erfahrung sind wir nur zu identifizieren ein oder zwei solcher Konsensus-Sequenz ändert. Sobald die mutagen resistenten Population erhalten wird und die Resistenz-Mutation identifiziert ist, ist es notwendig, eine reine Bestandsaufnahme dieser Variante zu erzeugen. Oben beschrieben, haben wir eine Gedenktafel Reinigungsverfahren. Alternativ, wenn das Virus von Interesse führt nicht zu leicht identifizierbaren Plaques, können die gewünschte Variante purif werdenIED durch limitierende Verdünnung. Dieser Ansatz ist im Wesentlichen ein TCID 50 in 96-Well-Format, in denen das Virus Lager so verdünnt, dass weniger als 50% der Brunnen infiziert sind. Mit dieser Verdünnung wird der gleiche Ansatz wie oben genommen, bei der Isolierung bis zu 10 individuelle Varianten und bestätigt ihre Sequenzen. Wie bereits erwähnt, in den besten Fällen ist eine infektiöse cDNA Klon des Virus-Stamm zur Verfügung. Isolation der Variante wäre also nicht notwendig sein. Nach unserer Erfahrung sind Treue Varianten das Ergebnis der einzelnen Aminosäure-Substitutionen und kann somit unter Verwendung einfacher, kommerzialisiert Mutagenese-Kits wie Quikchange (Agilent) werden. Eine zweite Möglichkeit ist, einen cDNA-Klon von einem eng verwandten Stamm verwenden. Allerdings, wenn ein verwandter Stamm verwendet wird, empfiehlt sich die Verwendung sowohl diesen Ansatz und die Virusisolierung (zB Plaque-Reinigung), weil wir festgestellt, dass die gleiche Treue zu verändern Mutation auf beiden eng verwandten Viren werden nicht unbedingt die gleiche Wirkung haben. Fidelity und Replikation. Selektion von RNA mutagen resistente Varianten haben in der Isolation sowohl höhere als auch niedrigere Treue Varianten mit Wachstum, die ähnliche Merkmale auf ihre Wildtyp-Gegenstücke 4,12,15 sind geführt. Derzeit ist das Bindeglied zwischen Polymerase Erwerbsquoten und Treue nicht vollständig verstanden. In-vitro-biochemische Untersuchungen unter Verwendung von gereinigten RNA-Polymerase haben gezeigt, dass eine höhere Klangtreue Varianten langsamer Verarbeitungsgeschwindigkeit haben, während niedrigere Treue Varianten schnellere Verarbeitung 1-3,12 neigen. In Gewebekulturen, sind diese Unterschiede in der Regel nicht erkennbar, was darauf hindeutet, dass die Verfügbarkeit von Ressourcen, anstatt intrinsische Polymerase-Aktivität Kinetik ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt. Wenn die Treue Variante repliziert mit Kinetik, die sich nicht signifikant von Wildtyp-, dann einen Vergleich ihrer Mutation Frequenzen können direkt vorgenommen werden. Wenn eine sehr signifikante Veränderung bei der Replikation Kinetik vorhanden ist, dann sollten die Daten normalisiert, um zur kinetischen Unterschiede, zum Beispiel durch den Vergleich Viren, die die gleiche Anzahl von Replikationszyklen unterzogen haben Konto. In unserer Erfahrung, auch wenn keine signifikanten Unterschiede in einem Schritt Wachstumskinetik zwischen Wildtyp und High-Fidelity-Varianten beobachtet wurden, beobachteten wir, dass eine höhere Klangtreue Varianten durchweg höhere Titer (innerhalb von 1 log) im Vergleich zum Wildtyp, aber sie machen etwas weniger RNA (innerhalb der gleichen Größenordnung), weiter darauf hindeutet, dass die Genome sie produzieren weniger Mutationen enthalten und somit mehr infektiös. Die Probenaufbereitung und Sequenzierung. Für alle Schritte in dieser Protokolle ist es unerlässlich, dass High-Fidelity-, Korrektur-Enzymen für die PCR und RT-PCR dienen zur Begrenzung der Einführung zusätzlicher Mutationen, da sie nicht von biologisch relevanten Mutationen unterschieden werden. Es ist wichtig, dass das Virus Populationen verglichen werden unter den gleichen Bedingungen (Passage Geschichte, Gewebekulturmedium, Temperatur, RNA-Extraktions-Verfahren, RT-PCR-Protokolle, etc.) erstellt worden Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass genügend Ausgangsmaterial wurde erhalten aus der RNA-Extraktion, so dass eine starke Bande von RT-PCR generiert. A 1 / 100 Verdünnung der RNA-Probe sollte auch eine nachweisbare RT-PCR-Bande, was darauf hinweist, dass die Probe eine ausreichende Zahl von RNA-Molekülen auf Vertretung Bias zu vermeiden (Verstärkung der gleiche Genom mehrfach) enthält. Da Mutationsfrequenz ist eine Distribution, würde man erwarten, dass ähnliche Werte unabhängig von der Populationsgröße wird erreicht werden, sofern die genannten Bias nicht auftritt. Wie Abbildung 6 zeigt, gibt ein 10 5-fachen Verdünnung von einem Virus Lager eine Mutation Frequenz nicht wesentlich verschieden von den Elterntieren. Bis in die optimale Bedingungen für TopoTA Klonen gefunden werden, bestätigen das Vorhandensein von Einsätzen nach blau / weiß-Screening, durch Kolonie-PCR-Sequenzierung vor. Als Kontrolle für Mutationsanalysen Rauschen (Mutationen durch RT-PCR und Sequenzierung eingeführt), Klon eines PCR-Produkts aus einem Plasmid mit dem gleichen Virus-Sequenz und / oder geklont und sequenziert RT-PCR-Produkte von in vitro transkribierten RNA entsprechend Virusgenom (werden bewusst, dass verschiedene in-vitro-Transkription Enzyme haben unterschiedliche Fehlerraten und dürfen nicht geben wertvolle Informationen über die wahren Hintergründe Fehler in der Prozedur). Einige Viren-Sequenzen können giftig für Bakterien, so ist es wichtig, diese vor einer Entscheidung über die Region des viralen Genoms für Mutationsfrequenz sequenziert werden zu überprüfen. Bei der Analyse der Sequenzen durch TopoTA erhalten, beachten Sie, dass jeder Klon sollte nur ein insert / Sequenz enthalten. Wenn ein Doppel-Peak beobachtet, was auf eine gemischte Bevölkerung, ist es möglich, dass zwei benachbarte Bakterienkolonien ausgewählt wurden. Es ist auch möglich, obwohl sehr unwahrscheinlich, die niedrigen Frequenzen Mutation in bakteriellen Replikation gegeben, dass die Mutation während der Amplifikation von Plasmid wurde in der Bakterienkultur eingeführt. In Plaque purified Populationen kann eine Doppel-Spitze repräsentieren überlappende Plaques, oder ein Virus, dass der Erwerb einer neuen Mutation oder Zurücksetzen eine Mutation während der Plaque-Entwicklung. Seien Sie konsequent und entscheiden, ob zu zählen oder nicht zählen diese Mutationen. Schließlich, im Auge behalten, dass die Mutation verwendeten Frequenzen hier relative Werte. Sie gelten nur in den Vergleich Viruspopulationen unter den gleichen Bedingungen aufgewachsen, und sequenziert über den gleichen Bereich! Sie sollten nicht als absolute Werte der Mutationsrate, oder die Mutation Häufigkeit des Genoms als Ganzes betrachtet werden. Allerdings, wenn die Bedingungen geregelt sind, erlauben sie eine reproduzierbare, quantitative Vergleiche von Unterschieden in Mutation Verbreitung und Häufigkeit.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Ribavirin </td><td> Sigma </td><td> R9644-10MG </td><td></td></tr><tr><td> 5-Fluorouracil </td><td> Sigma </td><td> F6627-1G </td><td></td></tr><tr><td> 5-Azacytidin </td><td> Sigma </td><td> A2385-100MG </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1028-100ML </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td> Trypanblau </td><td> Sigma </td><td> T8154-20ML </td><td></td></tr><tr><td> TopoTA Cloning Kit </td><td> Invitrogen </td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> Quikchange Mutagenese-Kit </td><td> Agilent </td><td> 200516 </td><td> Wenn ein cDNA infektiösen Klon ist verfügbar </td></tr><tr><td> 96-Well-Miniprep Kit </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene, Sequencher </td><td> DNAstar, Gene Codes Corporation </td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td> Oder andere Ausrichtung Software </td></tr></tbody></table>

isolierung von fidelity varianten von rna-viren und charakterisierung von virus-mutation frequency

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA-Viren verwenden RNA abhängigen RNA-Polymerasen auf ihre Genome zu replizieren. Die eigensicheren hohen Fehlerquote dieser Enzyme ist ein großer Faktor für die Generation der extremen Vielfalt der Population, die auf Viren Anpassung und Entwicklung erleichtert. Zunehmende Anzeichen zeigt, dass die intrinsische Fehlerrate und die daraus resultierenden Mutation Frequenzen von RNA-Viren können moduliert werden durch subtile Aminosäure Änderungen an der viralen Polymerase. Obwohl biochemische Assays für einige virale RNA-Polymerasen, die quantitative Messung der Inkorporation Treue erlauben existieren, hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Messung der Mutation Frequenzen von RNA-Viren, die sich als so genau wie biochemische Ansätze bei der Identifizierung Treue zu verändern Mutationen hat. Der Ansatz nutzt konventionellen virologischen und Sequenzierung Techniken, die in den meisten biologischen Laboren durchgeführt werden können. Basierend auf unseren Erfahrungen mit einer Reihe von verschiedenen Viren, haben wir die wichtigsten Schritte, die optimiert, um die Wahrscheinlichkeit zu isolieren Treue Varianten und die Erzeugung der Daten der statistischen Signifikanz erhöhen müssen identifiziert werden. Die Isolierung und Charakterisierung der Treue zu verändern Mutationen können neue Einblicke in die Polymerase-Struktur und Funktion 3.1 bieten. Darüber hinaus können diese Treue Varianten nützliche Werkzeuge werden bei der Charakterisierung von Mechanismen der Virus-Anpassung und Weiterentwicklung 4-7.

Der vorliegende Artikel beschreibt die notwendigen Schritte zu isolieren und zu charakterisieren RNA-Polymerase Treue Varianten von RNA-Viren und wie man Mutationsfrequenz Daten verwenden, um Treue Veränderungen in der Gewebekultur zu bestätigen.

Isolierung von Fidelity Varianten von RNA-Viren und Charakterisierung von Virus-Mutation Frequency

RNA-Viren verwenden RNA-abhängige RNA-Polymerasen, um ihre Genome zu replizieren. Die intrinsisch hohe Fehlerrate dieser Enzyme trägt maßgeblich zu der ...

RNA-Viren nutzen virale RNA-Polymerasen, um ihre Genome zu replizieren. Diese Polymerasen weisen eine intrinsisch höhere Fehlerrate auf, was es dem Virus ermöglicht, sich schnell anzupassen und zu evolvieren. Dieses Video stellt eine optimierte Methode vor, um Viren mit Mutationen in ihrer RNA-Polymerase zu screenen und zu identifizieren, die die Fehlerrate oder die Replikationsgenauigkeit beeinflussen.Zunächst werden Mutagene auf virale Wirtszellen angewendet, um die maximale Menge an Mutagen zu bestimmen, die verwendet werden kann, ohne die Zellen abzutöten oder das Virus zu hemmen. Sobald die optimalen Bedingungen ermittelt wurden, wird das Virus unter dem selektiven Druck von RNA-Mutagenen weitergegeben. Die mutagenresistente Population wird anschließend sequenziert, um die verantwortliche Mutation zu identifizieren.Anschließend wird der gegen Mutagene resistente Mutant isoliert. Die Replikationskinetik wird überwacht, und die Ergebnisse zeigen Zunahmen oder Abnahmen der Polymerase-Fidelität. Gleichzeitig treten eine breite Resistenz gegenüber RNA-Mutagenen und Veränderungen in der Mutationsfrequenz der Viruspopulation auf.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der biochemischen Treuebestimmung von Säuren unter Verwendung gereinigter Polymerasen besteht darin, dass diese Techniken für jeden RNA-Virus gültig sind, der in Zellkultur kultiviert werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Virologie zu beantworten, beispielsweise welche Rolle die Polymeraseaktivität bei der Virusadaption und -evolution spielt. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die von ihnen verwendeten selektiven Drücke entweder zu stark oder zu schwach sind und die Größe der Sequenzprobe sowie die Anzahl der analysierten Klone nicht hinsichtlich der statistischen Aussagekraft optimiert wurden.Beginnen Sie dieses Experiment mit der Bestimmung des Bereichs an Mutagenkonzentrationen, die in den folgenden Experimenten verwendet werden können, ohne dass Zelltod eintritt. Aspirieren Sie das Medium aus sechs Vertiefungen mit subkonfluenten Monolagen von Hilarzellen. Geben Sie dann zwei Milliliter mutagenhaltiges Medium hinzu, wobei die Mutagene Ribovirin, 5-Fluoruracil, 5-Azacytidin, Magnesiumchlorid und Manganchlorid verwendet werden.Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Überprüfen Sie dann alle 24 Stunden für die nächsten zwei bis sieben Tage die Vitalität einer Zellplatte mittels Trypanblau-Ausschluss. Berechnen Sie mithilfe eines Hämozytometers den Prozentsatz an vitalen Zellen für jede Konzentration des Mutagens, einschließlich der unbehandelten Kontrollbedingungen, die bis zum Infektionsende zu weniger als 50 % Zelltod führen.Wenn die maximalen Titer erreicht sind, besteht der nächste Schritt des Verfahrens darin, die Konzentration des Mutagens zu bestimmen, die einen optimalen Selektionsdruck ausübt, ohne die Population in den geeigneten Konzentrationen übermäßig zu mutagen. Jedes Genom wird an mindestens einer oder zwei Positionen mutiert. Das Mutagen erzeugt somit die Resistenzmutation, die anschließend über den Passagierprozess ausgewählt wird.Wenn zu viele Mutationen eingeführt werden, sind die Mutanten, die die Resistenzmutation tragen, selbst letal. Mutagene behindern ihre Isolierung in Sechs-Well-Platten, die mit he. Unsere Zellen in zwei Milliliter mutagenem ergänzten Medium unter Verwendung desselben Konzentrationsbereichs wie zuvor, wobei Konzentrationen ausgeschlossen werden, die zu einem Zellsterben von über 50 % führen.Die Mutagenaufnahme nach der Inkubation durch zweistündiges Inkubieren ermöglichen. Das Medium abziehen und mit Virus bei niedriger Multiplizität der Infektion in 200 µL infizieren, 15 bis 60 Minuten inkubieren, um eine Virusinfektion der Zellen zu ermöglichen, dabei die Platte in regelmäßigen Abständen schwenken, um sicherzustellen, dass das Inokulum die Zellen bedeckt. Das inokulierte Virus abziehen und zweimal mit je zwei Milliliter PBS waschen, um möglichst viel des Inokulums zu entfernen.Anschießend Medium mit Mutagen zu jeder Vertiefung hinzufügen und die Zellen für die Dauer von drei bis sechs Replikationszyklen, in der Regel zwei bis sieben Tage, inkubieren. Virus aus jeder Vertiefung gewinnen und einen standardmäßigen Plaque-Assay oder eine Grenzverdünnung durchführen, um den antiviralen Effekt auf die Virus-Titer anhand der berechneten Titer zu bestimmen. Die Konzentration des Mutagens identifizieren, die die Virus-Titer im Vergleich zur unbehandelten Kontrollinfektion um 0,5 bis zwei dekadische Einheiten reduziert und gleichzeitig für die Zellen nicht stark toxisch ist.Im Idealfall mit weniger als 50 % Toxizität, um mutagenresistente Varianten zu isolieren, beginnt man damit, das Virus in HeLa-Zellen bei optimaler Konzentration jedes einzelnen Mutagens zu passagieren. Das Virus muss möglicherweise bis zu 30 Mal passagiert werden; bei jeder Passage wird das Virus titriert, und die Infektion sowie Inkubation mit dem Mutagen wird wie hier gezeigt wiederholt. Die Virustiter der mit Mutagen behandelten Proben sollten zu Beginn der Passagen im Vergleich zum ursprünglichen Virustiter und den unbehandelten Kontrolltiter abnehmen. Sobald die Virustiter einer bestimmten Serie die gleiche Größenordnung wie die unbehandelten Kontrolltiter erreichen, deutet dies auf Resistenz hin.Extrahieren Sie die virale RNA zur Sequenzierung unter Verwendung von Primern, die die Polymerase- oder Replikase-Gene des betreffenden Virus amplifizieren. Erzeugen Sie cDNA des viralen Genoms mittels RT-PCR und sequenzieren Sie anschließend die DNA. Sobald die Sequenzinformationen vorliegen.Verwenden Sie Alignmentssoftware, um die resultierenden Sequenzen mit dem Referenzkonsens auszurichten und neue Punktmutationen zu identifizieren. Überprüfen Sie außerdem die Chromatogramme auf Minoritätsspitzen, die von der Alignmentssoftware möglicherweise übersehen wurden. Ein Mutant, der 20 bis 30 % der Gesamtpopulation ausmacht, zeigt sich immer noch als Spitze, jedoch zu klein, um mittels Standardsequenzanalyse als gemischtes Nukleotid identifiziert zu werden. Um die gewünschte Mutation zu finden, suchen Sie nach Einzelnukleotid-Polymorphismen, die ausschließlich in der mutagenbehandelten Population im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle derselben Passage vorkommen, wie hier gezeigt. Sobald eine Mutation identifiziert ist, muss die resistente Variante aus infektiöser cDNA regeneriert oder in Zellkultur isoliert werden, und das Resistenzphänotyp muss bestätigt werden.Hier isolieren wir die identifizierten Mutanten mittels Plaque-Assay. Bereiten Sie eine serielle Verdünnung der stickstoffresistenten Probe vor und geben Sie diese auf Zellmonolagen in Sechs-Loch-Platten für einen Plaque-Assay, nach einer Inkubation von einer Stunde bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid. Geben Sie zwei bis fünf Tage nach der Infektion eine Agarose-Abdeckung auf.Die Plaques sollten deutlich sichtbar sein. Idealweise weist eine der Platten zwischen 10 und 50 gut getrennte Plaques auf. Markieren Sie die Position der Plaques auf der Platte mit einem Punkt, indem Sie einen Stift verwenden, und achten Sie darauf, die Lage der Überlagerung nicht zu verändern. Stechen Sie vorsichtig eine P-200-Filterpipettenspitze durch die Agarose-Überlagerung.Um die Plaque zu erreichen, heben Sie die Spitze vorsichtig aus der Überlagerung und übertragen den Aros-Stopfen in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 250 Mikroliter Medium enthält. Eine ausreichende Menge Virus wird übertragen, unabhängig davon, ob der Aros-Stopfen von der Spitze gelöst wird; wirbeln Sie das Röhrchen um und nehmen Sie bis zu zehn Mal pro Minute Behandlung auf. Bewahren Sie einen Teil der Probe auf, um später das lebende Virus zu amplifizieren.Extrahieren Sie anschließend die RNA aus dem verbleibenden Teil der Probe und führen Sie eine RT-PCR durch, um die Plaque-Probe zu identifizieren, die die gewünschte Mutation enthält. Sequenzieren Sie die cDNA und stellen Sie sicher, dass keine zusätzlichen Mutationen vorhanden sind.Danach stellen Sie einen größeren Vorrat dieses Virus für alle nachfolgenden Studien her. Bestätigen Sie anschließend die durch die identifizierte Mutation verursachte Resistenz. Wiederholen Sie den Mutagenese-Test unter Verwendung mehrerer mutagener Bedingungen.Wenn die Variante gegen mehrere Mutagene resistent ist, weist sie wahrscheinlich eine erhöhte Fidelity auf. Da Mutationen, die die Fidelity verändern, im Polymerase-Gen lokalisiert sind, ist es wichtig zu bestätigen, dass die Replikationskinetik nicht signifikant verändert ist. Bevor die Mutationsfrequenzen bestimmt werden, sollte die Replikation mittels mindestens zweier komplementärer Ansätze untersucht werden.Beispielsweise kann eine Methode zur Untersuchung der Virusproduktion, wie der Plaque-Assay oder die TCID50-Bestimmung, zusätzlich zu einer Methode zur Untersuchung der RNA-Synthese, wie der quantitativen RT-PCR oder der Northern Blot-Analyse, durchgeführt werden. Anschließend wird überprüft, ob die identifizierte Polymeraseveränderung, die Resistenz gegen das Mutagen vermittelt, die Replikation beeinflusst, indem die Mutationsfrequenzen bezüglich der Replikationsgenauigkeit gemessen werden. Dies kann entweder an infektiöser oder an der gesamten Viruspopulation durchgeführt werden.Um die Mutationsfrequenzen der gesamten Viruspopulation, die lebensfähige und nicht lebensfähige Varianten umfasst, zu bestimmen, extrahieren Sie die RNA und amplifizieren mittels RT-PCR einen 800 bis 1.200 Nukleotide umfassenden Bereich aus einer kodierenden Sequenz, von der bekannt ist, dass sie genetische Varianten aufweist, beispielsweise die für ein strukturelles Protein kodiert. Klonieren Sie anschließend das gereinigte Produkt jeder zu untersuchenden Viruspopulation mittels Topo-TA-Klonierung. Wählen Sie 96 Kolonien aus, die durch Blau-Weiß-Screening auf Xga-beschichteten Platten als positiv für das Vorhandensein eines Inserts identifiziert wurden.Führen Sie eine Einzelkolonie-PCR durch, um die Gültigkeit der Blau-Weiß-Screening-Methode zu bestätigen. Unter Verwendung der oben genannten Fragmentgröße und Bedingungen sollten etwa 90 % der Kolonien positiv sein. Übertragen Sie für jede positive weiße Kolonie mithilfe eines Zahnstochers jeweils eine Kolonie in ein Milliliter LB-Medium in 96.Nun, bakterielle Kulturplatten werden über Nacht bei 37 Grad Celsius mit kontinuierlichem Schütteln inkubiert. Am nächsten Tag wird die DNA isoliert, indem Mini-Präparationen im 96-Loch-Format vorbereitet und jede Platte mit ausreichend Primern sequenziert werden, um eine maximale Abdeckung des geklonten Segments zu erzielen.Zwei Primer mit einer Abdeckung von 600 Basen sollten ausreichen. Führen Sie die Sequenzanalyse unter Verwendung einer Referenz- oder Konsenssequenz für jede Population sowie einer geeigneten Alignments-Software durch, die hier einzelne Nukleotid-Polymorphismen leicht identifizieren kann. Verwenden Sie die Software von DNA star laser.Das Gen wird zuerst verwendet, um Sequenzen schlechter Qualität wie solche mit fehlerhaften Basenaufrufen an vielen Enden oder solche, die zu kurz sind, zu verwerfen. Die verbleibenden Sequenzen werden ausgerichtet. Identifizieren Sie den Nukleotidbereich, der von allen Sequenzen in der Analyse abgedeckt wird.Verwerfen Sie Klone, die in diesem Bereich nicht vollständig abgedeckt sind. Aus Vergleichsgründen ist es entscheidend, dass derselbe Bereich vollständig abgedeckt ist. Identifizieren und zählen Sie die Einzelnukleotid-Polymorphismen, die sich von der Referenzstammsequenz unterscheiden.Berechnen Sie die Mutationsfrequenz, indem Sie die Anzahl der insgesamt vorliegenden Einzelnukleotid-Polymorphismen durch die Gesamtanzahl der sequenzierten Nukleotide teilen. Geben Sie diese Zahl als durchschnittliche Anzahl von Mutationen pro 10.000 sequenzierte Nukleotide an. Falls derselbe Einzelnukleotid-Polymorphismus in einer großen Anzahl von Klonen auftritt, geben Sie zwei Werte an, die diese wiederholten Mutationen entweder einschließen oder ausschließen.Bestimmen Sie die Mutationsverteilung. Erstellen Sie eine Rangliste der Anzahl von Klonen in jeder Population, die 0, 1, 2, 3 usw. Mutationen aufweisen. Mutationen in der sequenzierten Region sind optional.Verwenden Sie die bearbeiteten Sequenzen, um alle möglichen paarweisen Vergleiche innerhalb einer Probe zu berechnen und so Mittelwerte der Populationsvielfalt zu erhalten. Hier stehen mehrere Alignmentsprogramme zur Verfügung. Das Programm zur molekularen evolutionären Genetikanalyse, auch als MEGA bezeichnet, wird verwendet, um die optimalen Bedingungen zur Selektion von RNA-Mutagenresistenz zu bestimmen.Unsere Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen von Ribovirin behandelt und mit dem Wildtyp-Cox-AKI-B-Virus bei einer Multiplizität der Infektion von 0,01 48 Stunden nach der Infektion infiziert. Das Nachkommenvirus wurde gewonnen, und die Titer wurden mittels TCID50 bestimmt. Diese Abbildung zeigt den Prozentsatz der Zellen, die die Behandlung überlebt haben, unterhalb der x-Achse, ermittelt durch Trypanblaufärbung 48 Stunden nach der Infektion.Die Ergebnisse zeigen, dass Konzentrationen von 100 und 200 µM die Virus-Titers um ein bis zwei Log-Stufen senken, ohne die Zellviabilität zu beeinträchtigen. Um mutagenresistente Populationen auszuwählen, wurde CHI-Ganga-Virus in Hilar-Zellen in Anwesenheit (graue Balken) oder Abwesenheit (schwarze Balken) von 50 µM Ribavirin vermehrt. Nach jeder Passage wurde das Virusnachkommen mittels klassischem Plaque-Assay auf BHK-Zellen quantifiziert, wie hier dargestellt. Der mutagene Effekt zeigt sich bereits in den ersten Passagen, bei denen der Titer des behandelten Virus um zwei Log-Stufen abnahm.Allmählich kehrte Titus zu den normalen unbehandelten Werten zurück. Bei fünf mit Mutagen behandelten Populationen wurden im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle keine signifikanten Unterschiede beobachtet, was darauf hindeutet, dass resistente Varianten ausgewählt wurden. Tatsächlich identifizierte die Sequenzierung einzigartige Mutationen in der Viruspopulation, die Ribavirin-Behandlung durchlief, um die breite Resistenz gegenüber RNA-Mutagenen unterschiedlicher Struktur zu bestätigen. Die Hoch-Fidelitäts-Variante A372V des COA-Virus B3, die ursprünglich im Screen isoliert wurde, wurde auf verminderte Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Konzentrationen der RNA-Mutagene Ribavirin, 5-Fluoruracil und 5-Azacytidin getestet.He, unsere Zellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen von Ribavirin behandelt und mit dem Wildtyp-Cox-AKI-Virus B infiziert, und zwar bei einer Multiplizität der Infektion von 0,01, 48 Stunden nach der Infektion. Das Nachkommenvirus wurde gewonnen, und die Titer wurden mittels TCID50 bestimmt. Dargestellt sind hier die Titer des Wildtyps und einer A372-Variante in Abhängigkeit von der Mutagenkonzentration. Die A372-Variante weist durchgängig höhere Titer als der Wildtyp auf.Unter allen getesteten Bedingungen zur Bestimmung der Ein-Schritt-Wachstumskinetik der Virusproduktion wurden unsere Zellen mit einer Multiplizität der Infektion von 10 entweder mit dem Wildtyp, der Hochtreue-Variante A372V oder der replikationsdefizienten Variante CX64 des Coxsackie-Virus-B3 infiziert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die Virusnachkommenschaft aus Zellen und Überständen durch Einfrieren und Auftauen gewonnen und mittels TCID50 titriert. Die erhöhte Treue der A372V-Variante geht nicht mit einem nachweisbaren Replikationsdefekt in Zellkultur einher. Die Variante CX64 weist eine signifikante Verzögerung in der Replikationskinetik auf und erreicht maximale Titer, die um den Faktor 1000 niedriger liegen als die des Wildtyp-Virus.Mithilfe des in diesem Video beschriebenen Ansatzes stammt jeder sequenzierte Klon von einem einzigartigen Genom innerhalb der gesamten Viruspopulation und weist somit einzigartige Mutationen auf. Diese Abbildung zeigt eine typische Ausrichtung nach der Bereinigung von Sequenzen geringer Qualität und der Visualisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen. Die Gesamtanzahl der Einzelnukleotid-Polymorphismen innerhalb einer Population wurde erfasst, und die Anzahl der Einzelnukleotid-Polymorphismen, die in jedem Klon auftreten, wurde notiert.Beispielsweise enthält der durch einen Balken unterstrichene Klon zwei einzigartige Mutationen, während acht andere Klone jeweils eine einzelne einzigartige Mutation aufweisen. Diese Daten werden verwendet, um eine Tabelle wie die hier gezeigte zu erstellen. Die Tabelle zeigt die Rangverteilung der sequenzierten Klone nach Anzahl der Mutationen an.Der statistische Vergleich von geordneten Werten kann bestimmen, ob sich eine Verteilung signifikant von einer anderen unterscheidet. Zur einfacheren Interpretation können die aus der Sequenz- und statistischen Analyse gewonnenen Zahlenwerte entweder als Diagramm oder als Histogramm dargestellt werden. Wie hier gezeigt, erzeugt das Virus A 3 72 V weniger Mutationen als der Wildtyp und weist eine signifikant niedrigere Mutationsfrequenz mit einem P-Wert von weniger als 0,01 auf.Dieselbe Hühner-Ganga-Virus-Population ergibt ähnliche Mutationsfrequenzen, unabhängig davon, ob der Virusstamm oder eine 105-fache Verdünnung zur RNA-Extraktion verwendet wird. Nach Durchführung dieses Verfahrens können Sie in vitro biochemische Assays oder Kristallisationsstudien durchführen, um die mechanistischen und strukturellen Grundlagen der Fidelity in dieser Polymerase-Variante besser zu verstehen.Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Biologie den Weg, um die Korrelation zwischen genetischer Diversität und der Virus-Fitness in vivo zu untersuchen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihre Chancen erhöhen können, Fidelity-Varianten von RNA-Viren zu isolieren, und wie Sie Mutationsfrequenzen nutzen können, um diese Unterschiede in der Fidelity zu identifizieren.

isolation-fidelity-variants-rna-viruses-characterization-virus

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Dieses Verfahren beschreibt die Verwendung von Klick-Chemie, um Änderungen in Wirtszelle Transkription nach der Infektion zu messen mit dem Rift Valley-Fieber-Virus (RVFV) Stamm MP-12. Die Ergebnisse können qualitativ visualisiert werden über Fluoreszenzmikroskopie oder erhalten quantitativ durch Durchflusszytometrie. Dieses Verfahren ist zur Verwendung mit anderen Viren.

Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen

Wachstumskonkurrenz zwischen nahezu isogenen Viren bietet ein sensitives Maß für die Bestimmung der relativen Replikationsfitness. Die hier beschriebenen Protokolle umfassen die Konstruktion rekombinanter HIV-1-Klone, die Virusvermehrung und Wachstumskonkurrenz sowie Analysemethoden, die optimiert sind, um empfindliche und konsistente Ergebnisse zu erzielen.

Paarweise Wachstum Wettbewerb Assay zur Bestimmung der Replication Fitness von Human Immunodeficiency Viruses

Hier wird ein Protokoll zur Erstellung eines infektiösen bakteriellen künstlichen Chromosoms vorgestellt, das eine cDNA in voller Länge der positivsträngigen genomischen RNA des Japanischen Enzephalitis-Virus enthält. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine funktionsfähige cDNA anderer positivsträngiger RNA-Viren zu konstruieren, was es zu einem leistungsstarken genomischen Werkzeug für die Untersuchung der Virusbiologie macht.

Bakterielle künstliche Chromosomen: A Functional Genomics-Werkzeug für das Studium der Positiv-Strang-RNA-Viren

Wir bieten eine neuartige Strategie zur Isolierung von viralen Replikationskompartimenten (RC) aus Adenoviren (Ad)-infizierten menschlichen Zellen an. Dieser Ansatz stellt ein zellfreies System dar, das dazu beitragen kann, die molekularen Mechanismen aufzuklären, die die Replikation und Expression des viralen Genoms sowie die Regulation der am RC etablierten Virus-Wirt-Interaktionen regulieren.

Isolierung der viralen Replikation Compartment angereicherte Teil nuklearen Fraktionen von Adenovirus-infizierten normalen menschlichen Zellen

Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle und breit anwendbare Methode zur unvoreingenommenen RNA-Sequenzierung von Virusproben aus menschlichen klinischen Isolaten.

Unvoreingenommene Tiefe Sequenzierung von RNA-Viren aus klinischen Proben

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Protokolle, einer für die Messung der spezifischen Wachstumsrate und die andere für die Zelle-Bindungsfähigkeit Rotavirus mit dem Plaque-Assay und RT-qPCR. Diese Protokolle sind für die Bestätigung der unterschiedlichen Phänotypen Rotavirus-Sorten zur Verfügung.

Assays für die spezifischen Wachstumsrate und Zelle-Bindungsfähigkeit Rotavirus

Doppelsträngige RNA produziert während der RNA-Virus-Replikation man Muster Anerkennung Rezeptoren erkennt an eine angeborene Immunantwort zu induzieren. Für negativ-Sense-RNA-Viren bleibt die Interaktion zwischen dem Low-Level-DsRNA und PRRs unklar. Wir haben eine Methode konfokalen Mikroskopie Arenavirus DsRNA und PRR in einzelnen Zellen visualisieren entwickelt.

Konfokale Abbildung von Double-Stranded RNA und Muster Anerkennung Rezeptoren im negativen Sinn-RNA-Virusinfektion

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung und Verstärkung genetisch modifiziert respiratory syncytial Viren (RSV) und eine optimierte Plaque-Assay für RSV. Wir veranschaulichen dieses Protokolls durch die Schaffung von zwei rekombinanter Viren, die Quantifizierung der RSV-Replikation ermöglichen bzw. live-Analyse des RSV Einschlusskörperchen und Einschlusskörperchen-assoziierten Granulat Dynamik.

Erzeugung, Verstärkung und Titration von rekombinanten Respiratory Syncytial Viren

Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Einführung einer kontrollierbaren genetischen Vielfalt in das Genom des Hepatitis-C-Virus durch die Kombination von mutierter RNA-Synthese in voller Länge mit fehleranfälliger PCR und umgekehrter Genetik. Die Methode stellt ein Modell für die Phänotypauswahl dar und kann für 10 kb lange RNA-Virusgenome verwendet werden.

Reverse Genetik zur Entwicklung von RNA-Virusvarianten mit positivem Sinn

Lernen Sie die Isolierung von Fidelity-Varianten von RNA-Viren und die Charakterisierung der Mutationsfrequenz. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von Polymerase-Mutationen, die die Fehlerrate während der viralen Replikation beeinflussen.

Isolierung von Fidelity Varianten von RNA-Viren und Charakterisierung von Virus-Mutation Frequency

Weitere Videos entdecken