Isolierung von Fidelity Varianten von RNA-Viren und Charakterisierung von Virus-Mutation Frequency

RNA-Viren nutzen virale RNA-Polymerasen, um ihre Genome zu replizieren. Diese Polymerasen weisen eine intrinsisch höhere Fehlerrate auf, was es dem Virus ermöglicht, sich schnell anzupassen und zu evolvieren. Dieses Video stellt eine optimierte Methode vor, um Viren mit Mutationen in ihrer RNA-Polymerase zu screenen und zu identifizieren, die die Fehlerrate oder die Replikationsgenauigkeit beeinflussen.

Zunächst werden Mutagene auf virale Wirtszellen angewendet, um die maximale Menge an Mutagen zu bestimmen, die verwendet werden kann, ohne die Zellen abzutöten oder das Virus zu hemmen. Sobald die optimalen Bedingungen ermittelt wurden, wird das Virus unter dem selektiven Druck von RNA-Mutagenen weitergegeben. Die mutagenresistente Population wird anschließend sequenziert, um die verantwortliche Mutation zu identifizieren.

Anschließend wird der gegen Mutagene resistente Mutant isoliert. Die Replikationskinetik wird überwacht, und die Ergebnisse zeigen Zunahmen oder Abnahmen der Polymerase-Fidelität. Gleichzeitig treten eine breite Resistenz gegenüber RNA-Mutagenen und Veränderungen in der Mutationsfrequenz der Viruspopulation auf.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der biochemischen Treuebestimmung von Säuren unter Verwendung gereinigter Polymerasen besteht darin, dass diese Techniken für jeden RNA-Virus gültig sind, der in Zellkultur kultiviert werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Virologie zu beantworten, beispielsweise welche Rolle die Polymeraseaktivität bei der Virusadaption und -evolution spielt. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die von ihnen verwendeten selektiven Drücke entweder zu stark oder zu schwach sind und die Größe der Sequenzprobe sowie die Anzahl der analysierten Klone nicht hinsichtlich der statistischen Aussagekraft optimiert wurden.

Beginnen Sie dieses Experiment mit der Bestimmung des Bereichs an Mutagenkonzentrationen, die in den folgenden Experimenten verwendet werden können, ohne dass Zelltod eintritt. Aspirieren Sie das Medium aus sechs Vertiefungen mit subkonfluenten Monolagen von Hilarzellen. Geben Sie dann zwei Milliliter mutagenhaltiges Medium hinzu, wobei die Mutagene Ribovirin, 5-Fluoruracil, 5-Azacytidin, Magnesiumchlorid und Manganchlorid verwendet werden.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Überprüfen Sie dann alle 24 Stunden für die nächsten zwei bis sieben Tage die Vitalität einer Zellplatte mittels Trypanblau-Ausschluss. Berechnen Sie mithilfe eines Hämozytometers den Prozentsatz an vitalen Zellen für jede Konzentration des Mutagens, einschließlich der unbehandelten Kontrollbedingungen, die bis zum Infektionsende zu weniger als 50 % Zelltod führen.

Wenn die maximalen Titer erreicht sind, besteht der nächste Schritt des Verfahrens darin, die Konzentration des Mutagens zu bestimmen, die einen optimalen Selektionsdruck ausübt, ohne die Population in den geeigneten Konzentrationen übermäßig zu mutagen. Jedes Genom wird an mindestens einer oder zwei Positionen mutiert. Das Mutagen erzeugt somit die Resistenzmutation, die anschließend über den Passagierprozess ausgewählt wird.

Wenn zu viele Mutationen eingeführt werden, sind die Mutanten, die die Resistenzmutation tragen, selbst letal. Mutagene behindern ihre Isolierung in Sechs-Well-Platten, die mit he. Unsere Zellen in zwei Milliliter mutagenem ergänzten Medium unter Verwendung desselben Konzentrationsbereichs wie zuvor, wobei Konzentrationen ausgeschlossen werden, die zu einem Zellsterben von über 50 % führen.

Die Mutagenaufnahme nach der Inkubation durch zweistündiges Inkubieren ermöglichen. Das Medium abziehen und mit Virus bei niedriger Multiplizität der Infektion in 200 µL infizieren, 15 bis 60 Minuten inkubieren, um eine Virusinfektion der Zellen zu ermöglichen, dabei die Platte in regelmäßigen Abständen schwenken, um sicherzustellen, dass das Inokulum die Zellen bedeckt. Das inokulierte Virus abziehen und zweimal mit je zwei Milliliter PBS waschen, um möglichst viel des Inokulums zu entfernen.

Anschießend Medium mit Mutagen zu jeder Vertiefung hinzufügen und die Zellen für die Dauer von drei bis sechs Replikationszyklen, in der Regel zwei bis sieben Tage, inkubieren. Virus aus jeder Vertiefung gewinnen und einen standardmäßigen Plaque-Assay oder eine Grenzverdünnung durchführen, um den antiviralen Effekt auf die Virus-Titer anhand der berechneten Titer zu bestimmen. Die Konzentration des Mutagens identifizieren, die die Virus-Titer im Vergleich zur unbehandelten Kontrollinfektion um 0,5 bis zwei dekadische Einheiten reduziert und gleichzeitig für die Zellen nicht stark toxisch ist.

Im Idealfall mit weniger als 50 % Toxizität, um mutagenresistente Varianten zu isolieren, beginnt man damit, das Virus in HeLa-Zellen bei optimaler Konzentration jedes einzelnen Mutagens zu passagieren. Das Virus muss möglicherweise bis zu 30 Mal passagiert werden; bei jeder Passage wird das Virus titriert, und die Infektion sowie Inkubation mit dem Mutagen wird wie hier gezeigt wiederholt. Die Virustiter der mit Mutagen behandelten Proben sollten zu Beginn der Passagen im Vergleich zum ursprünglichen Virustiter und den unbehandelten Kontrolltiter abnehmen. Sobald die Virustiter einer bestimmten Serie die gleiche Größenordnung wie die unbehandelten Kontrolltiter erreichen, deutet dies auf Resistenz hin.

Extrahieren Sie die virale RNA zur Sequenzierung unter Verwendung von Primern, die die Polymerase- oder Replikase-Gene des betreffenden Virus amplifizieren. Erzeugen Sie cDNA des viralen Genoms mittels RT-PCR und sequenzieren Sie anschließend die DNA. Sobald die Sequenzinformationen vorliegen.

Verwenden Sie Alignmentssoftware, um die resultierenden Sequenzen mit dem Referenzkonsens auszurichten und neue Punktmutationen zu identifizieren. Überprüfen Sie außerdem die Chromatogramme auf Minoritätsspitzen, die von der Alignmentssoftware möglicherweise übersehen wurden. Ein Mutant, der 20 bis 30 % der Gesamtpopulation ausmacht, zeigt sich immer noch als Spitze, jedoch zu klein, um mittels Standardsequenzanalyse als gemischtes Nukleotid identifiziert zu werden. Um die gewünschte Mutation zu finden, suchen Sie nach Einzelnukleotid-Polymorphismen, die ausschließlich in der mutagenbehandelten Population im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle derselben Passage vorkommen, wie hier gezeigt. Sobald eine Mutation identifiziert ist, muss die resistente Variante aus infektiöser cDNA regeneriert oder in Zellkultur isoliert werden, und das Resistenzphänotyp muss bestätigt werden.

Hier isolieren wir die identifizierten Mutanten mittels Plaque-Assay. Bereiten Sie eine serielle Verdünnung der stickstoffresistenten Probe vor und geben Sie diese auf Zellmonolagen in Sechs-Loch-Platten für einen Plaque-Assay, nach einer Inkubation von einer Stunde bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid. Geben Sie zwei bis fünf Tage nach der Infektion eine Agarose-Abdeckung auf.

Die Plaques sollten deutlich sichtbar sein. Idealweise weist eine der Platten zwischen 10 und 50 gut getrennte Plaques auf. Markieren Sie die Position der Plaques auf der Platte mit einem Punkt, indem Sie einen Stift verwenden, und achten Sie darauf, die Lage der Überlagerung nicht zu verändern. Stechen Sie vorsichtig eine P-200-Filterpipettenspitze durch die Agarose-Überlagerung.

Um die Plaque zu erreichen, heben Sie die Spitze vorsichtig aus der Überlagerung und übertragen den Aros-Stopfen in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 250 Mikroliter Medium enthält. Eine ausreichende Menge Virus wird übertragen, unabhängig davon, ob der Aros-Stopfen von der Spitze gelöst wird; wirbeln Sie das Röhrchen um und nehmen Sie bis zu zehn Mal pro Minute Behandlung auf. Bewahren Sie einen Teil der Probe auf, um später das lebende Virus zu amplifizieren.

Extrahieren Sie anschließend die RNA aus dem verbleibenden Teil der Probe und führen Sie eine RT-PCR durch, um die Plaque-Probe zu identifizieren, die die gewünschte Mutation enthält. Sequenzieren Sie die cDNA und stellen Sie sicher, dass keine zusätzlichen Mutationen vorhanden sind.

Danach stellen Sie einen größeren Vorrat dieses Virus für alle nachfolgenden Studien her. Bestätigen Sie anschließend die durch die identifizierte Mutation verursachte Resistenz. Wiederholen Sie den Mutagenese-Test unter Verwendung mehrerer mutagener Bedingungen.

Wenn die Variante gegen mehrere Mutagene resistent ist, weist sie wahrscheinlich eine erhöhte Fidelity auf. Da Mutationen, die die Fidelity verändern, im Polymerase-Gen lokalisiert sind, ist es wichtig zu bestätigen, dass die Replikationskinetik nicht signifikant verändert ist. Bevor die Mutationsfrequenzen bestimmt werden, sollte die Replikation mittels mindestens zweier komplementärer Ansätze untersucht werden.

Beispielsweise kann eine Methode zur Untersuchung der Virusproduktion, wie der Plaque-Assay oder die TCID50-Bestimmung, zusätzlich zu einer Methode zur Untersuchung der RNA-Synthese, wie der quantitativen RT-PCR oder der Northern Blot-Analyse, durchgeführt werden. Anschließend wird überprüft, ob die identifizierte Polymeraseveränderung, die Resistenz gegen das Mutagen vermittelt, die Replikation beeinflusst, indem die Mutationsfrequenzen bezüglich der Replikationsgenauigkeit gemessen werden. Dies kann entweder an infektiöser oder an der gesamten Viruspopulation durchgeführt werden.

Um die Mutationsfrequenzen der gesamten Viruspopulation, die lebensfähige und nicht lebensfähige Varianten umfasst, zu bestimmen, extrahieren Sie die RNA und amplifizieren mittels RT-PCR einen 800 bis 1.200 Nukleotide umfassenden Bereich aus einer kodierenden Sequenz, von der bekannt ist, dass sie genetische Varianten aufweist, beispielsweise die für ein strukturelles Protein kodiert. Klonieren Sie anschließend das gereinigte Produkt jeder zu untersuchenden Viruspopulation mittels Topo-TA-Klonierung. Wählen Sie 96 Kolonien aus, die durch Blau-Weiß-Screening auf Xga-beschichteten Platten als positiv für das Vorhandensein eines Inserts identifiziert wurden.

Führen Sie eine Einzelkolonie-PCR durch, um die Gültigkeit der Blau-Weiß-Screening-Methode zu bestätigen. Unter Verwendung der oben genannten Fragmentgröße und Bedingungen sollten etwa 90 % der Kolonien positiv sein. Übertragen Sie für jede positive weiße Kolonie mithilfe eines Zahnstochers jeweils eine Kolonie in ein Milliliter LB-Medium in 96.

Nun, bakterielle Kulturplatten werden über Nacht bei 37 Grad Celsius mit kontinuierlichem Schütteln inkubiert. Am nächsten Tag wird die DNA isoliert, indem Mini-Präparationen im 96-Loch-Format vorbereitet und jede Platte mit ausreichend Primern sequenziert werden, um eine maximale Abdeckung des geklonten Segments zu erzielen.

Zwei Primer mit einer Abdeckung von 600 Basen sollten ausreichen. Führen Sie die Sequenzanalyse unter Verwendung einer Referenz- oder Konsenssequenz für jede Population sowie einer geeigneten Alignments-Software durch, die hier einzelne Nukleotid-Polymorphismen leicht identifizieren kann. Verwenden Sie die Software von DNA star laser.

Das Gen wird zuerst verwendet, um Sequenzen schlechter Qualität wie solche mit fehlerhaften Basenaufrufen an vielen Enden oder solche, die zu kurz sind, zu verwerfen. Die verbleibenden Sequenzen werden ausgerichtet. Identifizieren Sie den Nukleotidbereich, der von allen Sequenzen in der Analyse abgedeckt wird.

Verwerfen Sie Klone, die in diesem Bereich nicht vollständig abgedeckt sind. Aus Vergleichsgründen ist es entscheidend, dass derselbe Bereich vollständig abgedeckt ist. Identifizieren und zählen Sie die Einzelnukleotid-Polymorphismen, die sich von der Referenzstammsequenz unterscheiden.

Berechnen Sie die Mutationsfrequenz, indem Sie die Anzahl der insgesamt vorliegenden Einzelnukleotid-Polymorphismen durch die Gesamtanzahl der sequenzierten Nukleotide teilen. Geben Sie diese Zahl als durchschnittliche Anzahl von Mutationen pro 10.000 sequenzierte Nukleotide an. Falls derselbe Einzelnukleotid-Polymorphismus in einer großen Anzahl von Klonen auftritt, geben Sie zwei Werte an, die diese wiederholten Mutationen entweder einschließen oder ausschließen.

Bestimmen Sie die Mutationsverteilung. Erstellen Sie eine Rangliste der Anzahl von Klonen in jeder Population, die 0, 1, 2, 3 usw. Mutationen aufweisen. Mutationen in der sequenzierten Region sind optional.

Verwenden Sie die bearbeiteten Sequenzen, um alle möglichen paarweisen Vergleiche innerhalb einer Probe zu berechnen und so Mittelwerte der Populationsvielfalt zu erhalten. Hier stehen mehrere Alignmentsprogramme zur Verfügung. Das Programm zur molekularen evolutionären Genetikanalyse, auch als MEGA bezeichnet, wird verwendet, um die optimalen Bedingungen zur Selektion von RNA-Mutagenresistenz zu bestimmen.

Unsere Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen von Ribovirin behandelt und mit dem Wildtyp-Cox-AKI-B-Virus bei einer Multiplizität der Infektion von 0,01 48 Stunden nach der Infektion infiziert. Das Nachkommenvirus wurde gewonnen, und die Titer wurden mittels TCID50 bestimmt. Diese Abbildung zeigt den Prozentsatz der Zellen, die die Behandlung überlebt haben, unterhalb der x-Achse, ermittelt durch Trypanblaufärbung 48 Stunden nach der Infektion.

Die Ergebnisse zeigen, dass Konzentrationen von 100 und 200 µM die Virus-Titers um ein bis zwei Log-Stufen senken, ohne die Zellviabilität zu beeinträchtigen. Um mutagenresistente Populationen auszuwählen, wurde CHI-Ganga-Virus in Hilar-Zellen in Anwesenheit (graue Balken) oder Abwesenheit (schwarze Balken) von 50 µM Ribavirin vermehrt. Nach jeder Passage wurde das Virusnachkommen mittels klassischem Plaque-Assay auf BHK-Zellen quantifiziert, wie hier dargestellt. Der mutagene Effekt zeigt sich bereits in den ersten Passagen, bei denen der Titer des behandelten Virus um zwei Log-Stufen abnahm.

Allmählich kehrte Titus zu den normalen unbehandelten Werten zurück. Bei fünf mit Mutagen behandelten Populationen wurden im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle keine signifikanten Unterschiede beobachtet, was darauf hindeutet, dass resistente Varianten ausgewählt wurden. Tatsächlich identifizierte die Sequenzierung einzigartige Mutationen in der Viruspopulation, die Ribavirin-Behandlung durchlief, um die breite Resistenz gegenüber RNA-Mutagenen unterschiedlicher Struktur zu bestätigen. Die Hoch-Fidelitäts-Variante A372V des COA-Virus B3, die ursprünglich im Screen isoliert wurde, wurde auf verminderte Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Konzentrationen der RNA-Mutagene Ribavirin, 5-Fluoruracil und 5-Azacytidin getestet.

He, unsere Zellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen von Ribavirin behandelt und mit dem Wildtyp-Cox-AKI-Virus B infiziert, und zwar bei einer Multiplizität der Infektion von 0,01, 48 Stunden nach der Infektion. Das Nachkommenvirus wurde gewonnen, und die Titer wurden mittels TCID50 bestimmt. Dargestellt sind hier die Titer des Wildtyps und einer A372-Variante in Abhängigkeit von der Mutagenkonzentration. Die A372-Variante weist durchgängig höhere Titer als der Wildtyp auf.

Unter allen getesteten Bedingungen zur Bestimmung der Ein-Schritt-Wachstumskinetik der Virusproduktion wurden unsere Zellen mit einer Multiplizität der Infektion von 10 entweder mit dem Wildtyp, der Hochtreue-Variante A372V oder der replikationsdefizienten Variante CX64 des Coxsackie-Virus-B3 infiziert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die Virusnachkommenschaft aus Zellen und Überständen durch Einfrieren und Auftauen gewonnen und mittels TCID50 titriert. Die erhöhte Treue der A372V-Variante geht nicht mit einem nachweisbaren Replikationsdefekt in Zellkultur einher. Die Variante CX64 weist eine signifikante Verzögerung in der Replikationskinetik auf und erreicht maximale Titer, die um den Faktor 1000 niedriger liegen als die des Wildtyp-Virus.

Mithilfe des in diesem Video beschriebenen Ansatzes stammt jeder sequenzierte Klon von einem einzigartigen Genom innerhalb der gesamten Viruspopulation und weist somit einzigartige Mutationen auf. Diese Abbildung zeigt eine typische Ausrichtung nach der Bereinigung von Sequenzen geringer Qualität und der Visualisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen. Die Gesamtanzahl der Einzelnukleotid-Polymorphismen innerhalb einer Population wurde erfasst, und die Anzahl der Einzelnukleotid-Polymorphismen, die in jedem Klon auftreten, wurde notiert.

Beispielsweise enthält der durch einen Balken unterstrichene Klon zwei einzigartige Mutationen, während acht andere Klone jeweils eine einzelne einzigartige Mutation aufweisen. Diese Daten werden verwendet, um eine Tabelle wie die hier gezeigte zu erstellen. Die Tabelle zeigt die Rangverteilung der sequenzierten Klone nach Anzahl der Mutationen an.

Der statistische Vergleich von geordneten Werten kann bestimmen, ob sich eine Verteilung signifikant von einer anderen unterscheidet. Zur einfacheren Interpretation können die aus der Sequenz- und statistischen Analyse gewonnenen Zahlenwerte entweder als Diagramm oder als Histogramm dargestellt werden. Wie hier gezeigt, erzeugt das Virus A 3 72 V weniger Mutationen als der Wildtyp und weist eine signifikant niedrigere Mutationsfrequenz mit einem P-Wert von weniger als 0,01 auf.

Dieselbe Hühner-Ganga-Virus-Population ergibt ähnliche Mutationsfrequenzen, unabhängig davon, ob der Virusstamm oder eine 105-fache Verdünnung zur RNA-Extraktion verwendet wird. Nach Durchführung dieses Verfahrens können Sie in vitro biochemische Assays oder Kristallisationsstudien durchführen, um die mechanistischen und strukturellen Grundlagen der Fidelity in dieser Polymerase-Variante besser zu verstehen.

Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Biologie den Weg, um die Korrelation zwischen genetischer Diversität und der Virus-Fitness in vivo zu untersuchen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihre Chancen erhöhen können, Fidelity-Varianten von RNA-Viren zu isolieren, und wie Sie Mutationsfrequenzen nutzen können, um diese Unterschiede in der Fidelity zu identifizieren.