Zerebrovaskuläre Casting der erwachsenen Maus für 3D-Imaging und morphologische Analyse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das zerebrale Gefäßsystem der erwachsenen Maus in 3D zu visualisieren. Dies wird erreicht, indem zuerst die Brusthöhle geöffnet und das gesamte Blut aus dem Gefäßsystem durch intraorale Perfusion von PBS entfernt wird. Mit Heparin nach der Perfusion wird das Gießmittel in den linken Ventrikel injiziert, um das gesamte Kreislaufsystem zu perfundieren. Das perfundierte Gehirn wird dann entfernt und in Paraform-Aldehyd fixiert.

Der letzte Schritt des Eingriffs besteht darin, das Hirngewebe mit Ethanol und Methylsalicylat zu dehydrieren und zu klären. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die ein transparentes Mausgehirn zeigen, dessen Gefäßbaum unter einem Hellfeld- oder Präpariermikroskop und per Mikro-CT abgebildet werden kann. Hallo, mein Name ist Spen Walker von der University of California San Francisco.

Heute machen wir einen Gefäßabdruck des erwachsenen Mäusegehirns. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Angiographie bestehen darin, dass sie bei kleinen Tieren wie der Maus angewendet werden kann. Es wird kein radioaktives Material benötigt, und es ist ein relativ einfach durchzuführendes Verfahren.

Es hat die Anpassung an verschiedene Analysewerkzeuge ermöglicht, darunter Hellfeldanalyse, mikroskopische Analyse, CT-Scanning, aufgrund der röntgendichten Eigenschaften des Materials sowie histologische und immunhistochemische Analyse. Okay, fangen wir an. Betäuben Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion von Ketamin und Xylazin, verdünnt in Kochsalzlösung und bestätigter Vollnarkose durch Pfotenkneifen.

Sobald die Anästhesie bestätigt wurde, machen Sie mit einer Schere einen Schnitt über die Brust direkt unter dem Xiphoid-Prozess. Schneiden Sie dann durch das Zwerchfell und dann zwischen dem dorsalen und ventralen Segment des Brustkorbs. Um die Brusthöhle freizulegen, klappen Sie das Brustbein und die angrenzende Brustwand hoch und sichern Sie sie mit einem Hämostaten, um den Perikardsack freizulegen.

Öffnen Sie dann bei Bedarf den Perikardsack mit einer Pinzette, um das Herz freizulegen. Beginnen Sie mit der Perfusionspumpe, die auf 100 Millimeter Quecksilbersäule eingestellt ist, mit der Perfusion von PBS plus fünf Einheiten pro Milliliter Heparin, das auf 37 Grad Celsius erwärmt wird. Führen Sie die stumpfe 22-Gauge-Nadel, die mit dem Pumpenausfluss verbunden ist, in den linken Ventrikel in der Nähe der Herzspitze ein. Sofort schneiden.

Öffnen Sie den rechten Vorhof, um den systemischen Blutabfluss zu ermöglichen, und spülen Sie weiter, bis das Blut aus dem Blutkreislauf entfernt wird. Stellen Sie zunächst eine Gießmittellösung her, indem Sie fünf Milliliter des Verdünnungsmittels mit vier Millilitern der gefilterten Verbindung mischen. Fügen Sie anschließend 450 Mikroliter des Härters hinzu und achten Sie darauf, die Gießmittellösung innerhalb von 20 Minuten zu verwenden.

Mischen Sie die Gießmittellösung direkt vor Gebrauch. Um die richtige Viskosität zu gewährleisten, ziehen Sie die Gießmittellösung in eine 10-Milliliter-Spritze auf. Befestigen Sie eine stumpfe 20-Gauge-Nadel an der Spritze und füllen Sie die Nadel mit der Lösung.

Führen Sie die Nadel durch dasselbe Loch, das zum Spülen des Blutes verwendet wird, in den linken Ventrikel ein und befestigen Sie dann die Nadel an Ort und Stelle. Injizieren Sie mit einer Hämostatklemme die Gießmittellösung langsam manuell mit etwa drei Millilitern pro Minute in den linken Ventrikel, da ein Überdruck während der Injektion zu einem falschen Fluss oder einem möglichen Gefäßriss führen kann. Achten Sie auf Anzeichen einer erfolgreichen Perfusion, einschließlich der Visualisierung des Gießmittels in Darm- und Lebergefäßen, distalen Verfärbungen der Gliedmaßen sowie Verfärbungen von Nase und Zunge. Stellen Sie die Nadel bei Bedarf neu ein, um eine gute Durchblutung zu erreichen.

Entfernen Sie das Gehirn und geben Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius in 4%Paraformaldehyd. Als nächstes dehydrieren Sie das Gehirn über einen Zeitraum von sieben Tagen, indem Sie das Gehirn direkt in zunehmend konzentriertes Ethanol bei Raumtemperatur legen, beginnend am ersten Tag bei 25 % Ethanol. Sobald das Gehirn dehydriert ist, klären Sie das Hirngewebe um die Blutgefäße herum, indem Sie das perfundierte Gehirn zwei Tage lang bei Raumtemperatur in Methylsalicylat eintauchen. Nach zwei Tagen kann das Gefäßsystem des gesamten geklärten Gehirns durch Eintauchen in Methylsalicylat unter einem Hellfeldmikroskop sowie durch ein Präpariermikroskop oder einen Mikro-CT-Scan ungeschnitten sichtbar gemacht werden. Das Gefäßsystem kann in verschiedenen Fokusebenen betrachtet werden, ohne das Gehirn zu schneiden, sowie einzelne Mikrogefäße bei höherer Vergrößerung.

Hier im unteren Bereich abgebildet. Unter einem Präparierfernrohr kann man die gesamte zerebrale Gefäßstruktur in einer Brennebene sehen, was eine bessere Visualisierung ihrer dreidimensionalen Struktur ermöglicht. Dieses Bild zeigt die Morphologie der großen Gefäße und das gesamte Hirngefäßsystem, aber es fehlen die Details, die auf den mit der Hellfeldmikroskopie aufgenommenen Bildern zu sehen sind.

Micro-CT-Scans ermöglichen die 3D-Visualisierung des Gefäßsystems und die Erstellung von drehbaren 3D-Modellen. Zur Visualisierung des hier gezeigten Gefäßsystems ist eine abnormale zerebrale Gefäßstruktur zu sehen, die mittels Mikro-CT nachgewiesen wurde und mit einem Hellfeldmikroskopbild derselben Gefäßfehlbildung korreliert. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass dieselbe Probe nach dem Gefäßabdruck mit mehreren bildgebenden Verfahren analysiert werden kann.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Blutgefäße der Verstauchung der erwachsenen Maus mit Mikrofill-Lösung gießt. Dieses Verfahren umfasst die Entfernung des Blutes aus dem Gefäßsystem, die intraventrikuläre Injektion des Mikrofons, die Lösungsentnahme und -aufbereitung des adulten Mausgehirns und die Bildgebung des Zerebrogefäßsystems mittels Hellfeldmikroskopie. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Gefäßsystem des erwachsenen Mausgehirns in drei Dimensionen zu betrachten.