Name: Zerebrovaskuläre Casting der erwachsenen Maus für 3D-Imaging und morphologische Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Lernen Sie die zerebrovaskuläre Casting-Methode zur 3D-Visualisierung des Gefäßbaums im erwachsenen Mäusegehirn. Diese Technik ermöglicht die detaillierte morphologische Analyse mit verschiedenen Bildgebungsverfahren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken Voltaire Gungab für die Unterstützung bei Manuskripts. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus unterstützt: die National Institutes of Health (T32 GM008440 zu EJ Walker, R01 NS27713 zu WL Young, P01 NS44155 zu WL Jung und H. Su) und R21 NS070153 H. Su, und die amerikanische Heart Association (AHA 10GRNT3130004 H. Su).

1. Clearing Blut aus Gefäßsystem <ol><li> Anesthetize Maus durch intraperitoneale Injektion von 100 mg / kg Ketamin mit 10 mg / kg Xylazin in 0,25 ml Kochsalzlösung verdünnt. </li><li> Nach Betäubung durch keine Reaktion auf eine Pfote Prise bestätigt worden, mit einer Schere einen Schnitt quer über die Brust zu machen mit einer Schere knapp unter dem Schwertfortsatz, durch die Membran geschnitten, und zerschnitten zwischen dorsalen und ventralen Segment der Brustkorb zu Brusthöhle aussetzen. Expose Herzen durch Hochklappen Brustbeins und der angrenzenden Brustwand und sicher mit hemostat. Öffnen Sie den Herzbeutel mit einer Pinzette in das Herz freizulegen. </li><li> Schalten Sie Perfusionspumpe (100 mmHg Druck), verbunden mit PBS plus Heparin (5 Einheiten / ml)-Lösung in heißen Wasserbad bei 37 ° C und Schläuche mit einem stumpfen 22-Gauge-Nadel auf den Abfluss. Warmer </li><li> Führen Sie die Nadel in die linke Herzkammer, in der Nähe der Herzspitze. Unmittelbar schnitt den rechten Vorhof zur systemischen Blut Abfluss zu ermöglichen und spülen, bis das Blut is aus dem Verkehr gezogen. </li></ol> 2. Perfusion von Casting-Agenten in das Gefäßsystem <ol><li> Bereiten Microfil (Flow Tech, Inc. Carver, MA) Gießlösung pro Protokoll des Herstellers: Mix 5 ml MV Verdünnungsmittel mit 4 ml des gefilterten MV-Verbindung. Fügen Sie 450μl (5%) des Katalysators (MV Härter). Lösung Arbeitszeit beträgt 20 Minuten, sondern mischen unmittelbar vor der Anwendung die richtige Viskosität gewährleisten. </li><li> Ziehen Casting-Agent-Lösung in eine 10ml Spritze, legen einen stumpfen 20-Gauge-Nadel auf die Spritze und füllen Nadel mit Lösung. </li><li> Setzen Sie die Nadel in die linke Herzkammer durch das gleiche Loch für die Spülung des Blutes eingesetzt. Sichere Nadel in Stelle mit hemostat Klemme am Herzen. </li><li> Inject Casting-Agent-Lösung langsam in den linken Ventrikel bei ca. 3 ml / min. Überdruck kann zu falschen Fluss der Casting-Agenten oder potentielle Schiff Bruch führen. </li><li> Achten Sie auf Anzeichen für eine erfolgreiche Perfusion, darunter: Visualisierung von castIng.-Agent in Darm und Leber Gefäßsystem, distalen Gliedmaßen Verfärbung und Nase und Zunge verfärbt. Nachstellen Nadel ggf. richtige Durchblutung zu erreichen. </li></ol> 3. Erhebung und Verarbeitung von Tissue <ol><li> Entfernen Gehirn und in 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Entwässern des Gehirns, indem sie aus Paraformaldehyd direkt in zunehmendem Maße konzentriert EtOH bei Raumtemperatur: 25% EtOH, 1 Tag, 50% EtOH, 1 Tag, 75% EtOH, 1 Tag, 95% EtOH, 2 Tage, und 100% EtOH, 2 Tage . </li><li> Klären Hirngewebe um die Blutgefäße durch Eintauchen der perfundierten Gehirn in Methylsalicylat für 2 Tage bei Raumtemperatur. </li><li> Gefäßsystem des gesamten ungeschnittenen geklärt Gehirn mit Gehirn in Methylsalicylat unter einem Binokular (Abb. 1) (Leica MZFL III Mikroskop Leica Microsystems, Bannockburn, IL) oder Hellfeld-Mikroskop (Abb. 2) (Leica DM / eingetaucht abgebildet werden LS, Leica Microsystems). </li><li> Reclarificationkann getan werden, wenn Gewebe ist nicht vollständig geklärt werden. Von Methylsalicylat, Transfer Gehirn zu 95% EtOH für 2 Tage, 100% EtOH für 2 Tage, und Methylsalicylat für 2 Tage. </li></ol> 4. Micro-CT-Bildgebung oder histologische Application-Tissue Vorbereitung <ol><li> Das Gehirn kann abgebildet mit Mikro-CT unmittelbar nach Klärung oder nach Rehydrierung (Abb. 4). </li><li> Zur Vorbereitung Hirngewebe für die histologische Analyse, rehydrieren das Gehirn durch serielle Verdünnung EtOH: 100% EtOH, 1 Tag, 95% EtOH, 1 Tag, 75% EtOH, 1 Tag, 50% EtOH, 2 Tage, 25% EtOH, 2 Tage , und speichern in PBS. Das Gehirn kann dann in Paraffin mit einem Standard-Verfahren eingebettet werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Nach Kreislauf-Casting, können die cerebrovasculature makroskopisch an der Hirnoberfläche (Abb. 1a) zu sehen. Die Gefäßbaumes im Parenchym visualisiert folgende Klarstellung werden (Abb. 1B). Die detaillierten Gefäßstrukturkönnen abgebildet und analysiert werden unter einem Mikroskop Hellfeld (Abb. 2), Binokular (Abb. 3), und mit Mikro-CT-Scan (Abb. 4). Mit Hellfeldmikroskopie, können die Gefäße in verschiedenen Fokusebenen ohne Schneiden des Gehirns (Abb. 2A) sowie individuelle Mikrogefäßen bei höherer Vergrößerung (Abb. 2B) eingesehen werden. Unter einem Binokular, kann man das gesamte vaskuläre Struktur in einer Brennebene zu sehen, die eine bessere Visualisierung der dreidimensionalen Struktur des cerebrovasculature (Abb. 3). Bilder unter einem Binokular genommen werden zeigen großes Schiff Morphologie und ganze Gehirn Gefäßsystem, aber nicht über die Details in Bildern mit Hellfeld-Mikroskopie (Abb. 2B) übernommen gezeigt. Diese Technik hat uns erlaubt, unregelmäßige Schiffe in unserer experimentellen BAVM erwachsenen Maus-Modell 2 zu erfassen. Abbildung 5 zeigt ein Beispiel aus dem gleichen unregelmäßige Gefäße durch Mikro-CT-Scan (Abb. 5A) und Hellfeld (Abb. 5B) erkannt. Gemeinsam, zeigt diese Daten, können wir t analysierener dieselbe Probe mit mehreren bildgebenden Verfahren nach vaskulären Gießen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig1.jpg"> Abbildung 1. Whole Gehirn der Maus nach einer Gefäßverletzung Gießen. Vor (A) und nach (B) Klärung durch Methylsalicylat Lösungsmittel. Schiffe werden übersichtlich visualisiert auf der Hirnoberfläche (A) und in Parenchym folgende Klarstellung Verfahren (B). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig2.jpg"> Abbildung 2. Hellfeld-Mikroskop Bilder von geklärt vaskulären gegossen Gehirn. Gehirn kann auf verschiedenen Ebenen und in verschiedenen Vergrößerungen abgebildet werden. Maßstabsbalken 200 um (A) und 50 um (B). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig3.jpg"> Abbildung 3. Präpariermikroskop Bild mit 1x zeigen gesamten erwachsenen Gehirn der Maus cerebrovasculature aus einer Dorsalansicht. &lt;img alt = "Bild 4" src = "/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg" /&gt; Abbildung 4. Micro-CT-Scan-Bild der gleichen gesamten erwachsenen Gehirn der Maus in Abbildung 3 aus einer dorsalen Ansicht dargestellt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig5.jpg"> Abbildung 5. Einsatz von vaskulären Gießverfahren ein Gehirn arteriovenöse Missbildung zu erkennen. A) Micro-CT-Scan der vaskulären gegossen Gehirn zeigt Region vergrößert, unregelmäßig AVM-wie Schiffe in der rechten Hemisphäre von einer Ventralansicht. Größeres Bild der Region (white box) ist auf der rechten Seite angezeigt. B) Gleiche unregelmäßige Gefäße sichtbar unter Hellfeld-Mikroskop bei 50facher Vergrößerung. Maßstabsleiste 50 um.

<ol><li>Bolland, B. J., Kanczler, J. M., Dunlop, D. G., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+in+vivo+muCT+evaluation+of+neovascularisation+in+tissue+engineered+bone+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Development of in vivo muCT evaluation of neovascularisation in tissue engineered bone constructs.</a> Bone. 43, 195-202 (2008).</li>
<li>Walker, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arteriovenous+malformation+in+the+adult+mouse+brain+resembling+the+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Arteriovenous malformation in the adult mouse brain resembling the human disease.</a> Ann. Neurol. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Iqbal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+novel+mono-+and+multivalent+VHH-fragments+and+their+application+for+molecular+imaging+of+brain+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of novel mono- and multivalent VHH-fragments and their application for molecular imaging of brain tumours.</a> Br. J. Pharmacol. 160, 1016-1028 (2010).</li>
<li>Fukunaga, A., Kawase, T., Uchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+recovery+after+simultaneous+transplantation+with+neuro-epithelial+stem+cells+and+adjacent+mesenchymal+tissues+into+infarcted+rat%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Functional recovery after simultaneous transplantation with neuro-epithelial stem cells and adjacent mesenchymal tissues into infarcted rat.</a> 145, 473-480 (2003).</li>
<li>Chugh, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cerebral+blood+volume+in+mouse+brain+regions+using+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Measurement of cerebral blood volume in mouse brain regions using micro-computed tomography.</a> Neuroimage. 47, 1312-1318 (2009).</li>
<li>Marxen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+scanner+performance+and+considerations+for+vascular+specimen+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging.</a> Med. Phys. 31, 305-313 (2004).</li>
<li>Barger, A. C., Beeuwkes, R., 3rd, L. ainey, L, L., Silverman, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis%3A+vasa+vasorum+and+neovascularization+of+human+coronary+arteries.+A+possible+role+in+the+pathophysiology+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis.</a> N. Engl. J. Med. 310, 175-177 (1984).</li>
<li>Fossett, D. T., Caputy, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFossett%2C+DT+%22Operative+Neurosurgical+Anatomy%22">Operative Neurosurgical Anatomy</a>. , Thieme Medical Publishers. New York. (2002).</li>
<li>Reynolds, D. G., Brim, J., Sheehy, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+architecture+of+the+small+intestinal+mucosa+of+the+monkey+%28Macaca+mulatta%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">The vascular architecture of the small intestinal mucosa of the monkey (Macaca mulatta).</a> Anat. Rec. 159, 211-218 (1967).</li>
<li>Bernard, S., Luchtel, D. L., Polissar, N., Hlastala, M. P., Lakshminarayan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+size+of+bronchopulmonary+anastomoses+in+sheep+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+A.+Discov.+Mol.+Cell.+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and size of bronchopulmonary anastomoses in sheep lung.</a> Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 286, 804-813 (2005).</li>
<li>Brady, J. M., Cutright, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+of+measuring+blood+vessel+volume+in+bone+applied+to+the+mandible+and+humerus+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">A new technique of measuring blood vessel volume in bone applied to the mandible and humerus of the rat.</a> Anat. Rec. 170, 143-146 (1971).</li>
<li>Evan, A. P., Dail, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efferent+arterioles+in+the+cortex+of+the+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Efferent arterioles in the cortex of the rat kidney.</a> Anat. Rec. 187, 135-145 (1977).</li>
<li>Murphy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Notch4+signaling+induces+hallmarks+of+brain+arteriovenous+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).</li>
</ol>

Experimentelle Verfahren für den Einsatz im Labor Tiere wurden durch das Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der University of California, San Francisco (UCSF) zugelassen.

Wir berichten hier ein Verfahren zum Gießen von erwachsenen Maus cerebrovasculature, die mit verschiedenen Modalitäten abgebildet werden können. Die Anwendung dieser Methode, um die Krankheit Modell BAVM ermöglicht 3D-Analyse von unregelmäßigen Gefäßen. Mögliche zukünftige Studien umfassen die Quantifizierung der Mikro-CT-Aufnahmen, histologische Analyse der Gewebe und Diagnose von Gefäßerkrankungen Progression. Häufigsten auftretenden Probleme und Anregungen Komplette Durchblutung des Gehirns Gefäßsystem ist nicht immer erreicht. Nachdem genügend Druck auf die distalen Blutgefäße, ohne aufzureißen den linken Vorhof oder Aorta zu erreichen ist eine Herausforderung. Um dies zu überwinden, um für einheitliche Druck von ungefähr 100 mmHg. Stellen Sie auch Nadelposition geeignete Abfluss von Casting-Agenten in die Aorta zu gewährleisten. Es ist wichtig, dass die Halsschlagadern sind nicht beschränkt, so dass die Casting-Agenten der Hirngefäße erreichen können. Kritische Verfahren, die mit verbesserter kleinen Schiff und korrelierenFusion sind: (1) ordnungsgemäße Abwicklung von Blut aus dem Gefäßsystem, (2) Filtration der Casting-Agent, und (3) Nadel Platzierung bei Casting-Agenten Injektion. Es ist darauf zu Injektion von Casting-Agenten in den linken Vorhof und der Lunge zu vermeiden. Andere Forscher haben erfolgreich Maus 3 und 4 Ratten cerebrovasculature ohne den Einsatz zusätzlicher Verfahren perfundiert. Manuelle Analyse Microfil perfundierten Gefäße gegengefärbt mit Hämatoxilin zeigten 93% Gefäßlumen Perfusion 5. Immer verwerfen oder völlig sauber jedes Werkzeug, das in Kontakt mit dem Casting-Agenten kommt es schnell wird polymerisieren und Werkzeuge können nicht für mehrere Personen verwendet werden. Die Klärung der umgebenden Gehirngewebe der Maus kann eine Herausforderung sein. Nach dem Eintauchen in Methylsalicylat, kann das Gewebe noch undurchsichtig erscheinen, so dass Schiff Bildgebung schwierig. Sicherstellung der ordnungsgemäßen Entwässerung und Klarstellung sollte dieses Problem lösen. Platzieren Hirngewebe auf einer Wippe in Alkohol und Methyl-salicylate Behandlung verbessern kann Gewebe Klärung. Nachteile dieser Technik Die Grenzen dieser Technik sind: (1) ist es notwendig, die Casting-Agent-Lösung unmittelbar nach dem Mischen, wie es schnell wird dicker, nachdem der Katalysator zugegeben injizieren, (2) die Casting-Agenten füllt große Leitfähigkeit Schiffe leicht, aber es funktioniert nicht zuverlässig füllen kleinere Schiffe, wie Arteriolen (Widerstandsgefäße) und Kapillaren (nutritive Gefäße) und (3) es ist nicht die beste Röntgenkontrastmittel für die Mikro-CT-Bildgebung, obwohl einige Gruppen Microfil lieber für die Mikro-CT-Bildgebung 1,6. Im Anschluss an die Vorschläge oben vorgeschlagen, darunter richtige Nadel Platzierung, Position des Schiffs und Perfusionsdruck, Ergänzen Gießen von kleineren Schiffen erreicht werden. Die Anpassungsfähigkeit an unterschiedliche Analyse-Tools macht dieses Anbieters zu einem wertvollen Werkzeug für die Analyse von zerebrovaskulären Struktur, einschließlich arteriellen und venösen Kreislauf, mit verschiedenenPerspektiven. Anwendungen dieser Technik Der Vorteil dieses Verfahrens liegt in seiner breiten Anwendungspotenzial. Die Besetzung füllt alle Schiffe, einschließlich Arterien, Venen und Kapillaren aller Gewebe im Körper, so vaskulären Strukturen in mehreren Organen verschiedener Spezies analysiert werden kann. Zuvor haben andere Gruppen dieser Perfusion für große 7 und kleine 8 Schiffe in Mensch, Affe 9, Schafe 10, Ratte 4,11,12 und Maus 3,13 verwendet. Wir zeigen nun, Beweise für die Verwendung dieser Technik in die Analyse der Struktur von Mikrogefäßen im Gehirn der Maus, sowohl in gesunden und kranken Zustand 2. Darüber hinaus gibt es Microfil Lösungen mit verschiedenen Viskositäten erhältlich, um Schiffe in verschiedenen Größen und verschiedenen Farben perfuse, um die Visualisierung der Gefäße in verschiedenen Organen zu verbessern. Zum Beispiel kann rot werden einfach visualisiert in den blassen Hirnparenchym und Gelb kontrastiert gut mitdunkelrote Myokard. Außerdem ist, wie das Material radiopaque, können Gefäße mit Mikro-CT-Scannen zu einem 3D-Bild zu erhalten drehbare abgebildet werden. Das Gewebe kann auch für Paraffinschnitte und histologische Analyse, nachdem er abgebildet werden. Abschluss Wir zeigen hier ein Protokoll zu einem Gefäßpräparat der Blutgefäße der erwachsenen Gehirn der Maus, die angepasst mit einer Vielzahl von Analyse-Techniken, um die morphologische Struktur der cerebrovasculature Studie kann zu machen. Wir haben auch Beweise für die Anwendung dieser Methode auf ein Modell der BAVM Krankheitszustand vorgesehen, vertreten durch vergrößert, unregelmäßig geformte Gefäße, Shunt-Blut von arteriellen und venösen Kreisläufe. Es gibt eine Vielzahl von vaskulären Gießverfahren zur Verfügung. Das einfache Protokoll bieten wir hier für eine Gefäßpräparat kann als Werkzeug genutzt werden, um das Gefäßsystem des erwachsenen Gehirn der Maus mit verschiedenen bildgebenden Verfahren zu untersuchen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Hinweise </td></tr><tr><td> Microfil </td><td> Flowtech, Inc. </td><td> MV130 </td><td> 4 Monate haltbar </td></tr><tr><td> Methylsalicylat </td><td> Fisher Scientific </td><td> O3695-500 </td><td> um Gewebe zu klären </td></tr></tbody></table>

zerebrovaskuläre casting der erwachsenen maus für 3d-imaging und morphologische analyse

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Vascular Imaging ist von entscheidender Bedeutung in der klinischen Diagnose und Behandlung von zerebrovaskuläre Erkrankungen, wie z. B. Gehirn arteriovenöse Malformationen (BAVMs). Tiermodelle sind notwendig für das Studium der Krankheitsverlauf und mögliche Therapien für zerebrovaskuläre Erkrankungen. Imaging das Gefäßsystem in großen Tiere ist relativ einfach. Allerdings ist die Entwicklung Schiff bildgebenden Verfahren der murine Gehirnerkrankung Modelle wünschenswert, aufgrund der Kosten und der Verfügbarkeit von genetisch veränderten Mauslinien. Imaging der Maus zerebrale vaskuläre Baum ist eine Herausforderung. Bei Menschen und größere Tiere, der Goldstandard für die Beurteilung der Angioarchitektur am makrovaskuläre (Leitwert) Ebene ist x-ray Katheter Kontrastmittel-basierte Angiographie, eine Methode nicht für kleine Nager geeignet. In diesem Artikel präsentieren wir eine Methode für zerebrovaskuläre Casting, dass eine dauerhafte Skelett des gesamten Gefäßbett produziert, einschließlich Arterien, Venen und Kapillaren, die analysiert werden kann mit vielen dUNTERSCHIEDLICHE Modalitäten. Komplette Besetzung der Mikrogefäßen der Maus cerebrovasculature kann schwierig sein, aber diese Herausforderungen sind in diesem Schritt-für-Schritt-Protokoll ansprechbar. Durch intrakardiale Perfusion des Gefäßsystems Gießmasse, sind alle Gefäße des Körpers gegossen. Das Gehirn kann dann entfernt und geklärt werden mit dem organischen Lösungsmittel Methylsalicylat. Dreidimensionale Bildgebung des Gehirns Blutgefäße können einfach und kostengünstig visualisiert werden mit jedem herkömmlichen Hellfeld-Mikroskop oder Binokular. Die gegossenen cerebrovasculature können auch abgebildet und quantifiziert werden mit Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) 1. Darüber hinaus, nachdem er abgebildet, kann das Gehirn in Paraffin gegossen für die histologische Analyse eingebettet werden. Der Vorteil dieser vaskulären Gießverfahren als mit anderen Techniken verglichen wird seine breite Anpassung an verschiedene Analyse-Tools, einschließlich Hellfeld mikroskopische Analyse-, Scan-CT aufgrund der röntgendichten Zeichenteristic des Materials, sowie histologische und immunhistochemische Analyse. Diese effiziente Nutzung von Gewebe zu speichern Tier-Nutzung und die Kosten zu senken. Wir haben vor kurzem Anwendung dieser Methode auf die unregelmäßigen Blutgefäße in einem Mausmodell der erwachsenen BAVM auf einer mikroskopischen Ebene 2 sichtbar zu machen, und liefern zusätzliche Bilder des fehlerhaften Schiffe, die von Mikro-CT-Scan abgebildet demonstriert. Obwohl diese Methode hat Nachteile und ist möglicherweise nicht ideal für alle Arten von Analysen, ist es eine einfache, praktische Technik, die leicht erlernt werden können und weit zu vaskulären Gießen von Blutgefäßen im ganzen Körper aufgetragen.

In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen eine einfache, praktische Technik für zerebrovaskuläre Casting, das einfach durchzuführen ist und kann zur Abbildung des Gefäßbaumes der erwachsenen Gehirn der Maus eingesetzt werden.

Zerebrovaskuläre Casting der erwachsenen Maus für 3D-Imaging und morphologische Analyse

Die Gefäßbildgebung ist entscheidend für die klinische Diagnose und das Management von zerebrovaskulären Erkrankungen, wie beispielsweise zerebralen arteriovenösen Malformationen (BAVMs).

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die zerebrale Gefäßversorgung der erwachsenen Maus in 3D darzustellen. Dazu wird zunächst die Brusthöhle eröffnet und das gesamte Blut aus dem Gefäßsystem durch eine orale Perfusion mit PBS mit Heparin entfernt. Anschließend wird ein Gießmittel in den linken Ventrikel injiziert, um das gesamte Kreislaufsystem zu perfundieren. Das perfundierte Gehirn wird dann entnommen und in Paraformaldehyd fixiert.Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Gehirngewebe mit Ethanol und Methylsalicylat zu dehydrieren und zu klären. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die ein transparentes Mausgehirn zeigen, dessen Gefäßbaum unter einem Hellfeld- oder Stereomikroskop sowie mittels Mikro-CT-Scan abgebildet werden kann. Hallo, mein Name ist Spen Walker von der University of California San Francisco.Heute werden wir einen vaskulären Abguss des erwachsenen Maushirns anfertigen. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Angiographie bestehen darin, dass sie auf kleine Tiere wie die Maus angewendet werden kann. Es besteht keine Notwendigkeit für radioaktives Material, und das Verfahren ist vergleichsweise einfach durchzuführen.Es ermöglicht die Anwendung mit verschiedenen analytischen Methoden, einschließlich Hellfeld-, mikroskopischer Analyse, CT-Scans aufgrund der radiopaken Eigenschaft des Materials sowie histologischer und immunhistochemischer Analysen. Gut, beginnen wir. Das Maus wird durch intraperitoneale Injektion von in Kochsalzlösung verdünntem Ketamin und Xylazin anästhesiert, wobei die vollständige Anästhesie durch Zupressen der Pfote überprüft wird.Nach Bestätigung der Anästhesie verwenden Sie eine Schere, um einen Schnitt über die Brust knapp unterhalb des Xiphoidprozesses zu führen. Schneiden Sie anschließend durch das Zwerchfell und dann aufwärts zwischen dem dorsalen und ventralen Abschnitt des Brustkorbs. Um die Brusthöhle freizulegen, klappen Sie das Brustbein und die angrenzende Brustwand nach oben um und fixieren Sie sie mit einer Hämoclip, um den Perikardbeutel freizulegen.Öffnen Sie dann gegebenenfalls mit einer Pinzette den Perikardbeutel, um das Herz freizulegen. Beginnen Sie mit der Perfusion von PBS, das mit fünf Einheiten pro Milliliter Heparin auf 37 Grad Celsius erwärmt wurde, bei einer Einstellung der Perfusionspumpe auf 100 Millimeter Quecksilbersäule. Führen Sie die stumpfe Kanüle mit 22 Gauge, die mit dem Auslass der Pumpe verbunden ist, in das linke Ventrikel nahe der Herzspitze ein. Schneiden Sie sofort.Öffnen Sie das rechte Vorhof, um den systemischen Blutabfluss zu ermöglichen, und setzen Sie das Spülen fort, bis das Blut aus dem Kreislauf entfernt ist. Stellen Sie zunächst eine Gießmittel-Lösung her, indem Sie fünf Milliliter Verdünnungsmittel mit vier Millilitern der filtrierten Verbindung mischen. Fügen Sie danach 450 Mikroliter des Härtemittels hinzu und stellen Sie sicher, dass die Gießmittel-Lösung innerhalb von 20 Minuten verwendet wird.Mischen Sie die Gießmittel-Lösung unmittelbar vor der Verwendung. Um eine geeignete Viskosität sicherzustellen, ziehen Sie die Gießmittel-Lösung in eine 10-Milliliter-Spritze auf. Befestigen Sie eine stumpfe 20-Gauge-Nadel an der Spritze und füllen Sie die Nadel mit der Lösung. Führen Sie die Nadel durch dieselbe Öffnung, die für die Ausspülung des Blutes verwendet wurde, in den linken Ventrikel ein und fixieren Sie die Nadel mit einer Hämoklammer. Injizieren Sie die Gießmittel-Lösung manuell langsam in den linken Ventrikel mit einer Geschwindigkeit von etwa drei Milliliter pro Minute, da ein übermäßiger Druck zu einer fehlerhaften Strömung oder einem möglichen Gefäßriss während der Injektion führen kann. Achten Sie auf Anzeichen einer erfolgreichen Perfusion, wie die Sichtbarmachung des Gießmittels in der Darm- und Lebergefäßerstreckung, eine Verfärbung der distalen Gliedmaßen sowie eine Verfärbung von Nase und Zunge. Korrigieren Sie die Nadelposition gegebenenfalls, um eine korrekte Perfusion zu erreichen.Entfernen Sie das Gehirn und stellen Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius in 4% Paraformaldehyd. Anschließend dehydrieren Sie das Gehirn innerhalb von sieben Tagen, indem Sie das Gehirn direkt in immer konzentrierteres Ethanol bei Raumtemperatur geben, beginnend am ersten Tag mit 25% Ethanol. Sobald das Gehirn dehydriert ist, klären Sie das Gehirngewebe um die Blutgefäße herum, indem Sie das perfundierte Gehirn zwei Tage lang bei Raumtemperatur in Methylsalicylat eintauchen. Nach zwei Tagen kann die Gefäßversorgung des gesamten geklärten Gehirns ungeachtet einer Schnittführung durch Eintauchen in Methylsalicylat unter einem Hellfeldmikroskop sowie einem Stereomikroskop oder einer Mikro-CT-Aufnahme sichtbar gemacht werden. Mithilfe der Hellfeldmikroskopie können die Blutgefäße in verschiedenen Fokusebenen ohne Schnitt des Gehirns betrachtet werden, ebenso wie einzelne Mikrogefäße bei höherer Vergrößerung.Im unteren Bildfeld dargestellt. Unter einem Stereomikroskop kann man die gesamte zerebrale Gefäßstruktur in einer Fokusebene sehen, was eine bessere Visualisierung ihrer dreidimensionalen Struktur ermöglicht. Diese Aufnahme zeigt die Morphologie großer Gefäße und die gesamte Hirngefäßversorgung, enthält jedoch nicht die Details, die in Aufnahmen mit Hellfeldmikroskopie sichtbar sind.Mittels Mikro-CT-Scans ist eine 3D-Visualisierung der Gefäße möglich, und es können rotierbare 3D-Modelle erstellt werden. Zur Visualisierung der Gefäße zeigt hier eine abnormale zerebrale Gefäßstruktur, die mittels Mikro-CT detektiert wurde, korreliert mit einem Helligkeitsmikroskopie-Bild derselben Gefäßfehlbildung. Zusammen zeigen diese Daten, dass dieselbe Probe nach einer Gefäßabformung mit mehreren Bildgebungsverfahren analysiert werden kann.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Blutgefäße des erwachsenen Mäusehirns mithilfe einer Microfill-Lösung abgibt. Dieses Verfahren umfasst das Entfernen von Blut aus dem Gefäßsystem, die intraventrikuläre Injektion der Microfill-Lösung, die Sammlung und Aufbereitung des Gehirns erwachsener Mäuse sowie die Abbildung der zerebralen Gefäße mittels Hellfeldmikroskopie. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die zerebrale Gefäßstruktur des Gehirns erwachsener Mäuse dreidimensional darzustellen.

cerebrovascular-casting-adult-mouse-for-3d-imaging-morphological

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir stellen eine Methode, um ein bildgebendes Fenster in der Maus, die Schädel Millimeter überspannt und ist seit Monaten ohne Entzündung des Gehirns stabil zu bilden. Diese Methode wird auch für longitudinale Studien des Blutflusses, Zelluläre Dynamik und Zell / vaskuläre Struktur mit zwei-Photonen-Mikroskopie geeignet.

Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

Dieses Video zeigt ein chirurgisches Verfahren zur Implantation eines Schädelfensters in einem Mausmodell, um einen stabilen optischen Zugang zu verschiedenen Regionen des Gehirns zu ermöglichen.

Implantation eines kranialen Bildgebungsfensters im Mausmodell: Ein chirurgisches Verfahren zur Implantation eines glasbasierten Deckglases für einen stabilen optischen Zugang zu Regionen des Mausgehirns

Quelle: Choi, J. P. et al.et al. Induktion und Mikro-CT-Bildgebung von zerebralen kavernösen Fehlbildungen im Mausmodell. J. vis. exp. ( 2017)Dieses Video zeigt die Verwendung von Mikro-CT-Bildgebung zur Visualisierung von zerebralen kavernösen Malformationen (CCM) im Gehirn einer Maus. Es beschreibt die Schritte für die Probenvorbereitung, die Bildgebung und die 3D-Bildrekonstruktion, um die Dichte und Lokalisation von CCM-Läsionen im Hirngewebe zu bewerten.

Kontrastmittelverstärkte Mikro-CT-Bildgebung von zerebralen kavernösen Malformationsläsionen in einem Mausgehirn

Mit Hilfe von MRT-Scans (Mensch), 3D-Bildgebungssoftware und immunhistologischer Analyse dokumentieren wir Veränderungen an den Seitenventrikeln des Gehirns. Die longitudinale 3D-Kartierung von Volumenänderungen des lateralen Ventrikels und die Charakterisierung periventrikulärer zellulärer Veränderungen, die im menschlichen Gehirn aufgrund von Alterung oder Krankheit auftreten, werden dann an Mäusen modelliert.

3D-Modellierung der Seitenventrikel und histologische Charakterisierung Periventrikuläre Tissue in Mensch und Maus

Verwenden von mehreren Winkeln Sie die Maus pup Gehirn zu schneiden, verbessern wir die auf einem zuvor beschriebenen akuten Hirnschnitt, die die Verbindungen zwischen den meisten der großen auditorischen Mittelhirn und Vorderhirnstrukturen erfasst.

Modifikation eines Colliculo-thalamokortikalen Maus Hirnschnitt, Einbindung der 3D-Druckkammerkomponenten und Multiskalen Optical Imaging

Mit Längs Zwei-Photonen - Mikroskopie Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren , um den Umbau des cerebrovasculature während Amyloid - Plaque - Akkumulation in vivo zu verfolgen. Ein ausgedünnten Schädel Vorbereitung ermöglicht die Visualisierung von Fluoreszenzfarbstoffen, das Fortschreiten von zerebrovaskulären Schädigung in einem Mausmodell der Alzheimer-Krankheit zu bewerten.

in Längsrichtung<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging des Cerebrovasculature: Bedeutung für ZNS-Erkrankungen

Dieses Protokoll zeigt die Induktion der zerebralen höhlenartigen Fehlbildung Krankheit in einem Mausmodell und Verwendungen Kontrast verstärkt Mikro-Computertomographie um Läsion Belastung zu messen. Diese Methode steigert den Wert der etablierten Mausmodelle, die molekularen Grundlagen und mögliche Therapien für zerebrale höhlenartigen Missbildungen und anderen zerebrovaskulären Krankheiten zu studieren.

Induktion und Mikro-CT-Bildgebung des zerebralen höhlenartigen Fehlbildungen im Mausmodell

Das Ziel dieser Technik ist die ex vivo Visualisierung von pulmonalen arteriellen Netzwerken von frühpostnatalen und erwachsenen Mäusen durch Lungeninflation und Injektion einer radio-opaque polymerbasierten Verbindung über die Lungenarterie. Mögliche Anwendungen für gegossenes Gewebe werden ebenfalls diskutiert.

Vaskuläres Gießen von Erwachsenen und frühpostnatalen Mauslungen für Micro-CT Imaging

Diese Studie beschreibt die Schritte zur Gewinnung hochauflösender Bilder von neugeborenen Mäusegehirnen durch die Kombination von Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) und einem Kontrastmittel in ex vivo-Proben . Wir beschreiben grundlegende morphometrische Analysen, um die Größe und Form des Gehirns in diesen Bildern zu quantifizieren.

Mikro-CT-Bildgebung und morphometrische Analyse von Neugeborenengehirnen von Mäusen

Die Nadelmethode der asymmetrischen bilateralen Stenose der Arteria carotis communis wird vorgeschlagen, um ein Mausmodell für vaskuläre kognitive Beeinträchtigungen und Demenz zu schaffen. Es führt zu längerfristigen Ergebnissen im Vergleich zu bisher etablierten Modellen und ist mit der Live-MRT kompatibel. Die visuelle Darstellung, die das Verfahren demonstriert, bietet eine Anleitung zur Beherrschung der Operation.

Ein Mausmodell für vaskuläre kognitive Beeinträchtigung und Demenz basierend auf einer nadelgesteuerten asymmetrischen bilateralen Stenose der Arteria carotis communis

Die Intravitalmikroskopie ermöglicht die Untersuchung dynamischer biologischer Prozesse wie Geweberegeneration und Tumorentwicklung. Das Schädeldachknochenmark, ein hochdynamisches Gewebe, bietet Einblicke in die Blutbildung und Gefäßfunktion. Die Verwendung eines biokompatiblen 3D-gedruckten Kopffixationsimplantats ermöglicht eine repetitive Längsbildgebung und verbessert so unser Verständnis der Gewebedynamik und der Mikroumgebung des Tumors.

Intravitale longitudinale Bildgebung der Gefäßdynamik im Schädeldachknochenmark

Lernen Sie die zerebrovaskuläre Casting-Methode zur 3D-Visualisierung des Gefäßbaums im erwachsenen Mäusegehirn. Diese Technik ermöglicht die detaillierte morphologische Analyse mit verschiedenen Bildgebungsverfahren.

Zerebrovaskuläre Casting der erwachsenen Maus für 3D-Imaging und morphologische Analyse

Weitere Videos entdecken