Name: Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Lernen Sie Zeitraffer-Imaging von Neuroblastenmigration in akuten Schnitten des adulten Mäusevorderhirns. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Migrationsdynamik und zellulären Mechanismen in Echtzeit.

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Diese Arbeit wurde von einem kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) Zuschuss zu ASJK wurde teilweise durch einen Université Laval Gemeinschaft unterstützt werden. AS ist der Empfänger einer Canada Research Chair in postnatale Neurogenese.

<ol><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Kaneko, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+clear+the+path+of+astrocytic+processes+for+their+rapid+migration+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain.</a> Neuron. 67, 213-223 (2010).</li>
<li>Lois, C., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+neuronal+migration+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain.</a> Science. 264, 1145-1148 (1994).</li>
<li>Snapyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
<li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+migratory+scaffold+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li>
<li>Lledo, P. M., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+new+neurons+into+the+adult+olfactory+bulb%3A+joining+the+network%2C+life-death+decisions%2C+and+the+effects+of+sensory+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience.</a> Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).</li>
<li>Bolteus, A. J., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+release+and+uptake+regulate+neuronal+precursor+migration+in+the+postnatal+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA release and uptake regulate neuronal precursor migration in the postnatal subventricular zone.</a> J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).</li>
<li>Martini, F. J., Valdeolmillos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+contraction+at+the+cell+rear+drives+nuclear+translocation+in+migrating+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons.</a> J. Neurosci. 30, 8660-8670 (2010).</li>
<li>Murase, S., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleted+in+colorectal+carcinoma+and+differentially+expressed+integrins+mediate+the+directional+migration+of+neural+precursors+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream.</a> J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).</li>
<li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+orientation+distinguishes+stem+cell+and+terminal+modes+of+neuron+production+in+the+early+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord.</a> Development. 134, 1943-1954 (2007).</li>
<li>Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+in+inferior+colliculus+of+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%3A+electrophysiological+and+morphological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties.</a> Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).</li>
<li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Control+the+Development+of+the+Migration-Promoting+Vasculature+Scaffold+in+the+Postnatal+Brain+via+VEGF+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling.</a> J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).</li>
<li>Bovetti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+scaffold+for+neuroblast+migration+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).</li>
<li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li>
<li>Nam, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility%3A+a+two-photon+time-lapse+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li>
<li>Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+subventricular+zone+stem+and+progenitor+cells+are+sessile+and+epidermal+growth+factor+receptor+negatively+regulates+neuroblast+migration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration.</a> PLoS One. 4, e8122(2009).</li>
<li>Bortone, D., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCC2+expression+promotes+the+termination+of+cortical+interneuron+migration+in+a+voltage-sensitive+calcium-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner.</a> Neuron. 62, 53-71 (2009).</li>
<li>Comte, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die korrekte Ausrichtung der neuronalen Vorläuferzellen zu den entsprechenden Hirnregionen ist ein fundamentaler Prozess zugrunde liegende ordnungsgemäße Montage und Funktion neuronaler Schaltkreise. Die überwiegende Mehrheit der Zellen während der Embryonalentwicklung wandern und in der postnatalen Gehirn nur in wenigen Regionen, wie der OB, Gyrus dentatus und Kleinhirn, neuronale Verschiebung noch stattfindet. Die Mechanismen orchestrieren Zellwanderung in der postnatalen Gehirn verbleiben jedoch nur unzureichend vers...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma </td><td> S9378 </td></tr><tr><td> Glucose (ACSF) </td><td> EMD </td><td> DX0145-3 </td></tr><tr><td> NaCI </td><td> Sigma </td><td> S9625 </td></tr><tr><td> KCI </td><td> Sigma </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> MgCI 2 x6H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2670 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 xH 2 O </td><td> EMD </td><td> SX0710-1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 × 2H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3881 </td></tr><tr><td> Dextran TexasRed </td><td> Invitrogen </td><td> D1864 </td></tr><tr><td> Dextran CascaDEBlue </td><td> Invitrogen </td><td> D1976 </td></tr><tr><td> Glucose (40X-Lösung) </td><td> Sigma </td><td> G8769 </td></tr><tr><td> Sodium Pyruvat </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D-5025 </td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> Neurobasalmedium </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> EMD </td><td> 2930 </td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Life Technologies </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Ketamin / Xylazin </td><td> CDMV </td><td> 5230 </td></tr><tr><td> Pasteurpipette </td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td></tr><tr><td> 15 ml konischen Röhrchen </td><td&gt; Sarstedt </td><td> 62.553.205 </td></tr><tr><td> 50 ml konischen Röhrchen </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.205 </td></tr><tr><td> Glaskapillaren (stereotaktische Injektion) </td><td> WPI </td><td> 4878 </td></tr><tr><td> Petroleum </td><td> EMD </td><td> PX0045-3 </td></tr><tr><td> Proviodine </td><td> Rougier </td><td> 65655-1370 </td></tr><tr><td> Naht </td><td> Stoelting </td><td> 50487 </td></tr><tr><td> Anafen </td><td> CDMV </td><td> 11508 </td></tr><tr><td> 20 ml Spritze </td><td> VWR </td><td> SS-20L2 </td></tr><tr><td> Petrischale </td><td> VWR </td><td> 25384-094 </td></tr><tr><td> Agar </td><td> Laboratoire Mat </td><td> AP-0108 </td></tr><tr><td> Leim </td><td> Permabond </td><td> 910 </td></tr><tr><td> 95% O 2/5% CO 2 </td><td> Linde </td><td> 24068835 </td></tr><tr><td> Blade &lt;/ Td&gt; <td> WPI </td><td> 501901 </td></tr><tr><td> Nylon Mesh </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0198 </td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Eppendorf </td><td> 5702 000.019 </td></tr><tr><td> Pipette puller </td><td> Sutter Instrument </td><td> P-97 </td></tr><tr><td> Nanoliter Injektor </td><td> WPI </td><td> B203MC4 </td></tr><tr><td> Stereotaktische Injektion Vorrichtung </td><td> WPI </td><td> 502900 </td></tr><tr><td> Micro Bohrsystem </td><td> WPI </td><td> 501819 </td></tr><tr><td> Vibratom </td><td> Thermo Scientific </td><td> 920110 </td></tr><tr><td> Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop </td><td> Olymp </td><td> BX61WIF </td></tr><tr><td> CCD-Kamera </td><td> Photometrics </td><td> CS-HQ2-D </td></tr><tr><td> Flüsterleiser Bildgebung Kammer </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 64-1487 </td></tr><tr><td> PH-1Series 20 Heizplattform </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 64-0284 </td></tr><tr><td> Heizanlage </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td></tr><tr><td> 40X Wasser Immersionsobjektiv </td><td> Olymp </td><td> 1-UM587 </td></tr><tr><td> 10X Wasser Immersionsobjektiv </td><td> Olymp </td><td> 1-UM583 </td></tr><tr><td> Lambda DG-4 </td><td> Sutter Instruments </td><td> DG-4/OF </td></tr><tr><td> MetaMorph Software </td><td> Molecular Devices </td><td> 40000 </td></tr><tr><td> Imaris Software </td><td> Bitplane </td><td> BPI-IM70-F1 </td></tr></tbody></table>

zeitraffer-imaging von neuroblast migration in acute scheiben von der adulten maus vorderhirnneuronen

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Es gibt eine beträchtliche Anzahl von Beweisen dafür, dass neue funktionelle Neuronen konstitutiv sind von einem endogenen Pool von neuralen Stammzellen in eingeschränkten Bereichen der erwachsenen Gehirn von Säugetieren erzeugt. Newborn Neuroblasten aus der subventrikulären Zone (SVZ) wandern entlang des rostralen Migrationsstrom (RMS) an ihren endgültigen Bestimmungsort im Riechkolben (OB) 1. In der RMS, Neuroblasten tangential migrieren in Ketten von 2,3 Astrozytenfortsätze Verwendung Blutgefäße als strukturelle Unterstützung und eine Quelle für molekularen Faktoren für die Migration 4,5 erforderlich umhüllt. In der OB, Neuroblasten von den Ketten lösen sich und wandern radial in den verschiedenen bulbären Lagen, wo sie differenzieren sich in Interneuronen und Integration in das bestehende Netzwerk 1, 6. In diesem Manuskript beschreiben wir das Verfahren für die Überwachung der Zellwanderung in akuten Schnitten des Nagergehirn. Die Verwendung von akuten Scheiben ermöglicht die assessment der Zellwanderung in der Mikroumgebung, dass sehr ähnlich in vivo Bedingungen und in Hirnregionen, die schwer zu in-vivo-Bildgebung zugänglich sind. Darüber hinaus vermeidet es lange Kultivierung Bedingung wie im Fall von organotypischen und Zellkulturen, die schließlich verändern kann die Migrations-Eigenschaften der Zellen. Neuronalen Vorläuferzellen in akuten Scheiben können visualisiert werden unter Verwendung von DIC Optik oder fluoreszierende Proteine. Virale Etikettierung von neuronalen Vorläufern in dem SVZ, Pfropfung Neuroblasten aus Reporter-Mäuse in der SVZ von Wildtyp-Mäusen, und unter Verwendung von transgenen Mäusen, die fluoreszierende Protein exprimieren in Neuroblasten sind alle geeignete Methoden zur Visualisierung Neuroblasten und nach ihrer Migration. Die spätere Verfahren ist jedoch nicht möglich einzelne Zellen über lange Zeiträume aufgrund der hohen Dichte von markierter Zellen verfolgt werden. Wir verwendeten eine Weitfeld-fluoreszierenden aufrechtes Mikroskop mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist, um eine relativ schnelle Erfassungsintervall (eine ima erreichenge alle 15 oder 30 Sek.), um sicher zu identifizieren die stationäre und wandernde Phasen. Eine genaue Identifizierung der Dauer der stationären und wandernden Phasen ist entscheidend für die eindeutige Interpretation der Ergebnisse. Wir führten auch mehrere z-Schritt Akquisitionen Neuroblasten Migration in 3D zu überwachen. Weitfeld-Fluoreszenz-Bildgebung wurde ausgiebig zu visualisieren neuronalen Migration 7-10 verwendet. Hier beschreiben wir detailliertes Protokoll zur Beschriftung Neuroblasten, Durchführung Echtzeit-Video-Bildgebung Neuroblast Migration in akuten Schnitten des adulten Maus Vorderhirn und Analyse Zellmigration. Während die beschriebene Protokoll die Migration von Neuroblasten im adulten RMS veranschaulicht, kann es auch verwendet werden, um die Zellmigration in embryonalen und frühen postnatalen Gehirn folgen.

Wir beschreiben ein Protokoll für Echtzeit videoimaging neuronaler Migration im Vorderhirn Maus. Die Migration von viral etikettiert oder aufgepfropft wurde neuronalen Vorläuferzellen in akuten Live Scheiben unter Verwendung Weitfeld-Fluoreszenz-Bildgebung mit einer relativ schnellen Erfassungsintervall, um die unterschiedlichen Phasen der Zellmigration, einschließlich der Dauer der stationären und Migration Phasen und der Geschwindigkeit aufgezeichnet studieren Migration.

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

Es gibt eine beträchtliche Menge an Belegen, die darauf hindeuten, dass kontinuierlich neue funktionelle Neuronen aus einem endogenen Pool von neuralen Stammzellen generiert werden ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Migration von Neuroblasten in akuten Schnitten des erwachsenen Mausgehirns zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die neuronalen Vorläuferzellen in der subventrikulären Zone des erwachsenen Tieres markiert werden. Fünf bis acht Tage nach der Markierung der Neuroblasten werden akute Schnitte des Mausgehirns hergestellt. Anschließend erfolgt die Zeitrafferaufnahme zur Beobachtung der Neuroblastenmigration.Schließlich wird die Echtzeit-Weitfeldmikroskopie verwendet, um die Dynamik der Neuroblastenwanderung in akuten Schnitten darzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der neuronalen Entwicklung zu beantworten, indem sie die Rolle verschiedener molekularer Signale und zellulärer Mechanismen, die an der Zellwanderung beteiligt sind, untersucht. Diese Methode ermöglicht nun Einblicke in die physiologischen Prozesse, die die neuronale Migration im erwachsenen Gehirn regulieren, kann aber auch in anderen Systemen angewendet werden, beispielsweise zur Untersuchung der neuronalen Migration im ischämischen Gehirn oder während der embryonalen Entwicklung.Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Herstellung einer auf Saccharose basierenden künstlichen zerebralen Spinalflüssigkeit zum Schneiden der Schnitte und einer natriumchloridbasierten ACSF bei 32 Grad Celsius zur Aufrechterhaltung der Schnitte bis zur Bildgebung. Sauerstoffen Sie die Lösungen anschließend durch kontinuierliches Durchblubbeln mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid. Betäuben Sie danach die Maus mit fluoreszenzmarkierten Neuroblasten mittels einer intraperitonealen Injektion von Ketamin und Xylazin. Bereiten Sie dann schnell die eiskalte Schneidelösung mit einem geleeartigen Aussehen unter Verwendung von flüssigem Stickstoff vor.Danach 15 bis 20 Milliliter eiskalte Schrittlösung mit einer 20-cc-Spritze aufziehen und die Maus intra Cardi perfundieren. Falls die Blutgefäße markiert werden sollen, anstatt mit der Schrittlösung zu perfundieren, 200 Mikroliter Dextran Texas Red mit einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter trans Cardi in den linken Ventrikel des Herzens injizieren und zwei bis drei Minuten warten, bevor die Maus nach der transcardialen Perfusion schnell decapitiert wird. Den Kopf unmittelbar in die eiskalte Schrittlösung eintauchen und zum Vibratom überführen. Den Schädel mit einer Schere entlang der sagittalen Naht vom Kleinhirn bis zum Riechkolben aufschneiden.Anschließend vorsichtig die Schädeldeckel mit einer Pinzette entfernen. Danach den Kaudalteil des Gehirns mit einem Skalpell herausschneiden. Daraufhin zwei sagittale Schnitte am seitlichsten Teil jeder Hemisphäre anlegen und das Gehirn entlang der intrahemisphärischen Spalte durchtrennen. Dann das Gehirn vorsichtig mit einem Spatel herausheben und in kalte Schneidelösung auf Eis legen.Platzieren Sie die beiden Hemisphären einzeln auf einem 4 %igen Agarblock, wobei die dorsale Seite die Agaroberfläche berührt. Danach kleben Sie den Block mit der seitlich geschnittenen Seite der beiden Hemisphären auf die Plattform eines Vibroms, wobei die mediale Seite nach oben zeigt. Anschließend stellen Sie die Plattform in die Vibrom-Kammer.Füllen Sie es mit der Schneidlösung. Anschließend belassen Sie die Lösung während der Schnittpräparation durch Einleiten von 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid ständig mit Sauerstoff angereichert. Bereiten Sie nun die Schnitte mit einer Dicke von 250 Mikrometern mit dem Vibratom vor.Es sollte eine niedrige Schnittgeschwindigkeit und eine hohe Frequenz der Klingenschwingung verwendet werden, um hochwertige Schnitte zu erhalten. Sobald ein Schnitt von der Klinge gelöst wurde, entfernen Sie ihn vorsichtig aus der Schneidlösung und legen Sie ihn in eine Inkubationskammer, die mit mit Sauerstoff angereichertem aCSF gefüllt ist und in einem Wasserbad bei 32 Grad Celsius gehalten wird. Befestigen Sie den Schnitt in diesem Verfahren vorsichtig in der Messkammer des Mikroskops, um ein Verschieben des Schnitts während der Bildaufnahme zu vermeiden.Stabilisieren Sie es, indem Sie vorsichtig ein Nylon-Netz darauf platzieren. Stellen Sie sicher, dass der Schnitt kontinuierlich mit A-CSF perfundiert wird. Verwenden Sie anschließend ein 10x-Objektiv, um ein interessierendes Blickfeld zu finden.Öffnen Sie die Metamorph-Software und vergewissern Sie sich, dass das Nylonnetz das Bildfeld nicht verdeckt. Schalten Sie dann das 40x-Objektiv ein und justieren Sie den Fokus. Stellen Sie sicher, dass sich ausreichend Lösung zwischen Objektiv und Schnitt befindet.Stellen Sie mithilfe der Metamorph-Software die Parameter für die zeitraffergestützte Aufnahme ein, wie beispielsweise die Dauer der Anregung, die Anzahl der Z-Ebenen, den Abstand zwischen den einzelnen Z-Schichten, das Zeitintervall und die Aufnahmedauer. Starten Sie anschließend die zeitraffergestützte Aufnahme. Die Daten werden von Metamorph automatisch als TIFF-Datei gespeichert, wobei jede Datei einem Zeitpunkt des aufgenommenen Zeitraffer-Videos entspricht, um den Film in Mrs. zu öffnen.Laden Sie die aufgenommenen Bilder, indem Sie das Bild des ersten Zeitpunkts des Videos per Drag & Drop auf das Programm-Icon ziehen. Sobald der Film geladen ist, passen Sie Helligkeit und Kontrast des Signals im Anzeige-Anpassungsfenster an. Legen Sie die Parameter des aufgenommenen Videos fest, wie beispielsweise die Voxelgröße und das Zeitintervall in den Bildeigenschaften, und definieren Sie äquidistante Zeitfenster.Nach der Festlegung der Voxelgröße ist es möglich, den Rahmen in 3D sowie Zeit und Skalierung des Videos anzusehen, um die aufgezeichneten Zellen automatisch zu verfolgen. Erstellen Sie im Surpass-Fenster mithilfe der Spot-Funktion einen Spot für jede Zelle im Feld und messen Sie den Durchmesser der zu verfolgenden Zelle im Slice-Fenster. Stellen Sie die Parameter für die Verfolgung ein und fahren Sie fort.Überprüfen Sie die Zuverlässigkeit der erfassten Objekte über die Zeit. Falls nicht alle wandernden Zellen automatisch erfasst werden, ändern Sie den Erkennungsschwellenwert und stellen Sie sicher, dass alle Zellen zu jedem Zeitpunkt mit Punkten ausgewählt wurden. Die maximale Distanz und die maximale Lückengröße zwischen zwei Punkten, die benachbarte Zeitpunkte derselben Spur darstellen, müssen angegeben werden, damit das Programm die Zeitpunkte verbinden kann.Nachdem die Spuren erstellt wurden, können sie gefiltert und irrelevante Spuren durch einfaches Löschen entfernt werden. Spuren können korrigiert werden, indem verschiedene Spuren sowie verschiedene Zeitpunkte derselben Spur verbunden oder getrennt werden. Sobald alle Korrekturen vorgenommen wurden, werfen Sie einen letzten Blick auf die Spuren und exportieren Sie die Daten, einschließlich der Zellverschiebung pro Zeitpunkt, der Spurlänge, der Verschiebungslänge und der Spurdauer, in eine Excel-Datei.Dieses Video zeigt die Zeitrafferaufnahme der grünen Neuroblastenwanderung entlang der mit Dextran, Texas Red markierten Blutgefäße. Beachten Sie, dass die wandernden Neuroblasten ein saltatorisches Verhalten zeigen, bei dem die Migrationsphasen durch ruhende Phasen unterbrochen werden. Und dieses Video zeigt die Verfolgung der Neuroblastenwanderung mittels Imas-Software.Die Kugeln und Linien zeigen die Zellkörper bzw. Migrationsbahnen einzelner Zellen an. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass hochwertige akute Lebensschnitte des adulten Mausvorderhirns erhalten werden sollten. Darüber hinaus sollten die Schnitte im Abbildungskammer sorgfältig durch vorsichtiges Platzieren eines Nylonnetzes stabilisiert werden, um ein Verschieben des Schnitts während der Bildaufnahme zu vermeiden.Änderungen der Perfusionsrate einer CSF-Perfusion, unregelmäßige Perfusion oder starke Temperaturschwankungen können während der Bildgebung zu Drift und Veränderungen der Fokusebene führen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Neuroblastenmigration in akuten adulten Schnitten aufgezeichnet und analysiert werden kann. Wir empfehlen die Verwendung kurzer Arztintervalle in der Größenordnung von 15 bis 30 Sekunden, um zuverlässig den Beginn und das Ende der migratorischen und ruhenden Phasen identifizieren zu können.

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Forschung

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Neurowissenschaften

Dieses Protokoll beschreibt eine organotypischen Slice-Assay für die postnatale Gehirn und hochauflösenden Zeitraffer-Bildgebung von Neuroblasten Migration in der rostralen wandernde Stream optimiert.

Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

Quelle: Wiegreffe, C., et. al.,  Konfokale Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen in der organotypischen Schnittkultur des embryonalen Mausgehirns unter Verwendung von In utero{ Elektroporation. {{}}J. Vis. Exp.{{TAG_ 44}} (2017) Dieses Video zeigt die konfokale Zeitraffermikroskopie, um die radiale Migration kortikaler Neuronen von der subventrikulären Zone zur kortikalen Platte über radiale Gliagerüste in transduzierten embryonalen Hirnschnitten der Maus zu beobachten.

Zeitraffer-Bildgebung der radialen Migration kortikaler Neuronen in transduzierten embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Neuroblast Migration ist ein grundlegendes Ereignis in der postnatalen Neurogenese. Wir beschreiben ein Protokoll für die effiziente Markierung von Neuroblasten durch in vivo Elektroporation postnatalen und anschließende Visualisierung der Migration mit Zeitraffer-Bildgebung der akuten Hirnschnitten. Wir sind eine Beschreibung für die quantitative Analyse von Neuroblast Dynamik von Video-Tracking.

In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die direkte Beobachtung von radial migrierenden kortikalen Neuronen. In der utero- Elektroporation werden die organotypische Scheibenkultur und die konjunkturelle Bilddarstellung kombiniert, um die Effekte der Überexpression oder der Abregulation von Genen von Interesse bei der Migration von Neuronen direkt und dynamisch zu untersuchen und ihre Differenzierung während der Entwicklung zu analysieren.

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

Hier bieten wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode um elektroporiert Gehirn organotypischen Slice Kulturen von mäuseembryonen geeignet für konfokale Mikroskopie und Leben-bildgebende Verfahren zu generieren.

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Viele Gene sind an diesem Prozess beteiligt. Dieses Protokoll stellt die Technik für die Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen vor.

Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Magnetic Resonance Imaging (MRI) ist ein zunehmend beliebtes Werkzeug für die Prüfung der Phänotyp genetisch veränderten Mäusen. Dieser Artikel beschreibt die Methoden notwendig, um High-Throughput-Phänotypisierung von genetisch veränderten Mäusen mit Multiple-Maus MRT zu erreichen.

Multiple-Maus Neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

Die vorliegende Video zeigt eine Methode, die nutzt die Kombination von Elektroporation und konfokale Mikroskopie, um Live-Aufnahmen zu den einzelnen neuronalen Vorläuferzellen im sich entwickelnden Zebrafisch Vorderhirn führen.

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Eine Methode zur subventrikulären Zone (SVZ) Zellen mit Calcium-Indikator Farbstoffe für die Aufnahme Calciumaktivität laden beschrieben. Die postnatale SVZ enthält dicht gepackten Zellen, einschließlich neuralen Vorläuferzellen und Neuroblasten. Anstatt Badbelastung injizierten wir den Farbstoff durch Druck im Inneren des Gewebes eine bessere Farbstoffdiffusion.

Vorbereitung der akuten Subventrikulärzone Slices für Calcium Imaging

Die Herstellung von akuten Hirnschnitten aus isolierten hippocampi, sowie die gleichzeitige elektrophysiologischen Ableitungen von Astrozyten und Neuronen...

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Lernen Sie Zeitraffer-Imaging von Neuroblastenmigration in akuten Schnitten des adulten Mäusevorderhirns. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Migrationsdynamik und zellulären Mechanismen in Echtzeit.

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

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