Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

Wir beschreiben ein Protokoll für Echtzeit videoimaging neuronaler Migration im Vorderhirn Maus. Die Migration von viral etikettiert oder aufgepfropft wurde neuronalen Vorläuferzellen in akuten Live Scheiben unter Verwendung Weitfeld-Fluoreszenz-Bildgebung mit einer relativ schnellen Erfassungsintervall, um die unterschiedlichen Phasen der Zellmigration, einschließlich der Dauer der stationären und Migration Phasen und der Geschwindigkeit aufgezeichnet studieren Migration.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Migration von Neuroblasten in akuten Schnitten des vierten Gehirns der adulten Maus zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die neuronalen Vorläufer in der adulten subventrikulären Zone fünf bis acht Tage nach der Neuroblastenmarkierung markiert und akute Schnitte der Maus für das Gehirn vorbereitet werden. Als nächstes wird die Zeitrafferbildgebung der Neuroblastenmigration durchgeführt.

Letztendlich wird die Weitfeld-Echtzeitmikroskopie verwendet, um die Dynamik der Neuroblastenmigration in akuten Schnitten zu zeigen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der neuronalen Entwicklung zu beantworten, indem sie die Rolle verschiedener molekularer Signale und zellulärer Mechanismen untersucht, die an der Zellmigration beteiligt sind. Nun kann diese Methode Einblicke in physiologische Prozesse geben, die die neuronale Migration bei Erwachsenen für das Gehirn regulieren, aber sie kann auch in anderen Systemen angewendet werden, z. B. bei der Untersuchung der neuronalen Migration im ischämischen Gehirn und während der Embryonalentwicklung.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit auf Saccharosebasis zum Schneiden der Scheiben und einen 32 Grad Celsius warmen A-Liquor auf Natriumchloridbasis zur Aufbewahrung der Scheiben bis zur Bildgebung vorbereiten und dann die Lösungen mit Sauerstoff versorgen, indem Sie sie kontinuierlich mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid sprudeln. Als nächstes betäuben Sie die Maus mit dem fluoreszenzmarkierten Neuroblasten unter Verwendung von Ketamin-Xylazin interal. Bereiten Sie dann schnell die eiskalte Schneidlösung mit einem geleeartigen Aussehen mit flüssigem Stickstoff vor.

Nehmen Sie danach 15 bis 20 Milliliter eiskalte Schneidlösung mit einer 20-ml-Spritze auf und perfundieren Sie die Maus intra Cardi. Wenn die Blutgefäße markiert werden müssen, anstatt sie mit der Schneidlösung zu durchbluten, injizieren Sie 200 Mikroliter Dextran Texas Red in einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter, trans Cardi in den linken Ventrikel des Herzens und warten Sie zwei bis drei Minuten, bevor Sie die Maus nach der transkardialen Perfusion enthaupten, enthaupten Sie die Maus schnell, tauchen Sie den Kopf in die eiskalte Schneidlösung und bewegen Sie ihn zum Vibrato. Schneiden Sie den Schädel mit einer Schere entlang der sagittalen Naht vom Kleinhirn bis zum Riechkolben ein.

Sie anschließend vorsichtig die Schädellappen mit einer Pinzette. Entfernen Sie anschließend den verwöhnten Teil des Gehirns mit einem Skalpell. Machen Sie dann zwei sagittale Schnitte am lateralsten Teil jeder Hemisphäre und schneiden Sie das Gehirn entlang der intrahemisphärischen Fissur. Entfernen Sie dann vorsichtig mit einem Spatel das Gehirn und legen Sie es in eiskalte Schneidlösung.

Platzieren Sie die beiden Hemisphären getrennt voneinander auf einem 4%-Agar-Block, wobei die dorsale Seite den Agar berührt. Als nächstes kleben Sie den Block mit der seitlich geschnittenen Seite der beiden Halbkugeln mit der medialen Seite nach oben auf die Plattform eines Vibrams. Platzieren Sie danach die Plattform in der Vibram-Kammer.

Füllen Sie es mit der Schneidlösung. Halten Sie die Lösung dann während der gesamten Scheibenzubereitung sauerstoffreich, indem Sie sie mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid sprudeln. Bereiten Sie nun die Abschnitte mit einer Dicke von 250 Mikrometern mit dem Vibrator vor.

Eine niedrige Schnittgeschwindigkeit und hochfrequente Klingenvibrationen sollten verwendet werden, um qualitativ hochwertige Abschnitte zu erhalten. Sobald sich eine Scheibe von der Klinge löst, nehmen Sie sie vorsichtig aus der Schneidlösung und legen Sie sie in eine Inkubationskammer, die mit sauerstoffhaltigem A-Liquor gefüllt ist, das bei 32 Grad Celsius in einem Wasserbad gehalten wird. Legen Sie bei diesem Verfahren die Scheibe vorsichtig in die Bildgebungskammer des Mikroskops, um ein Abdriften der Scheibe während der Bildgebung zu vermeiden.

Stabilisieren Sie es, indem Sie vorsichtig ein Nylonnetz darauf legen. Stellen Sie sicher, dass die Scheibe kontinuierlich mit A CSF durchblutet ist. Verwenden Sie als Nächstes ein 10-fach-Ziel, um ein Interessengebiet zu finden.

Öffnen Sie die Metamorph-Software und stellen Sie sicher, dass das Nylonnetz das Bildgebungsfeld nicht behindert. Schalten Sie dann das 40-fach-Objektiv ein und stellen Sie den Fokus ein. Stellen Sie sicher, dass sich genügend Lösung zwischen dem Objektiv und der Scheibe befindet.

Mit der Metamorph-Software können Sie die Zeitraffer-Erfassungsparameter einstellen, z. B. die Dauer der Anregung, die Anzahl der Z-Ebenen, den Abstand zwischen den einzelnen Z-Abschnitten, das Zeitintervall und die Aufnahmedauer. Starten Sie dann die Zeitrafferaufnahme. Die Daten werden von Metamorph automatisch als TIFF-Datei gespeichert, wobei jede Datei einem Zeitpunkt des aufgenommenen Zeitraffervideos entspricht, um den Film in Mrs. zu öffnen.

Laden Sie die aufgenommenen Bilder einfach per Drag & Drop auf das erste Zeitpunktbild des Videos in das Programmsymbol. Sobald der Film geladen ist, passen Sie die Helligkeit und den Kontrast des Signals im Anzeigeeinstellungsfenster an. Legen Sie die Parameter des aufgenommenen Videos, wie z. B. die Voxelgröße und das Zeitintervall, in den Bildeigenschaften fest und legen Sie Zeitfenster mit äquidistanten Zeitpunkten fest.

Nach dem Festlegen der Voxelgröße ist es möglich, den Frame in 3D sowie die Zeit und den Maßstab des Videos zu sehen, um die aufgezeichneten Zellen automatisch zu verfolgen. Erstellen Sie einen Punkt für jede Zelle im Feld im Überblendungsfenster, indem Sie die Funktion Flecken auswählen und den Durchmesser der zu verfolgenden Zelle im Segmentfenster messen. Legen Sie die Parameter für die Nachverfolgung fest und fahren Sie fort.

Überprüfen Sie die Zuverlässigkeit der erkannten Objekte im Laufe der Zeit. Wenn nicht alle migrierenden Zellen automatisch erkannt werden, ändern Sie den Erkennungsschwellenwert und stellen Sie sicher, dass alle Zellen zu allen Zeitpunkten mit Punkten markiert wurden. Der maximale Abstand und die maximale Abstandsgröße zwischen zwei Punkten, die benachbarte Zeitpunkte derselben Strecke darstellen, müssen angegeben werden, damit das Programm die Zeitpunkte verbinden kann.

Sobald die Tracks erstellt sind, ist es möglich, sie zu filtern und die irrelevanten Tracks zu entfernen, indem Sie sie einfach löschen. Tracks können korrigiert werden, indem verschiedene Tracks und verschiedene Zeitpunkte desselben Tracks verbunden und getrennt werden, sobald alle Korrekturen vorgenommen wurden. Werfen Sie einen letzten Blick auf die Tracks und exportieren Sie die Daten, einschließlich der Zellenverschiebung pro Zeitpunkt, der Tracklänge, der Verschiebungslänge und der Trackdauer, in eine Excel-Datei.

Dieses Video zeigt die Zeitraffer-Bildgebung der grünen Neuroblastenmigration entlang der Dextran, Texas rot markierten Blutgefäße. Es ist zu beachten, dass die migrierenden Neuroblasten ein saltatorisches Verhalten zeigen, wenn die Migrationsphasen durch stationäre Perioden unterbrochen werden. Und dieses Video zeigt die Verfolgung der Neuroblastenmigration durch die imas-Software.

Die Kugeln und Linien zeigen die Zellkörper bzw. die Migrationsspuren für die einzelnen Zellen an. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass qualitativ hochwertige akute Lebensabschnitte des Vorderhirns adulter Mäuse entnommen werden sollten. Darüber hinaus sollten die Schichten in der Bildgebungskammer gut stabilisiert werden, indem ein Nylonnetz vorsichtig platziert wird, um ein Abdriften der Scheibe während der Bildgebung zu vermeiden.

Änderungen der A-Liquor-Perfusionsrate, unregelmäßige Perfusion oder drastische Temperaturschwankungen können während der Bildgebung zu Drift und Veränderungen der Fokusebene führen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Migration von Neuroblasten in den akuten adulten Schnitten aufzeichnet und analysiert. Wir empfehlen, ein kurzes Arztintervall in der Größenordnung von 15 bis 30 Sekunden zu verwenden, um den Beginn und das Ende der migratorischen und stationären Phase zuverlässig zu identifizieren.