Morphologische und funktionelle Bewertung von Bandsynapsen an bestimmten Frequenzregionen der Maus cochlea

Der primäre Bericht ist wirklich betonen Wichtig, die spezifische Frequenzregion der Basilarmembran in den meisten Modellen genau zu lokalisieren, wo Synapsenzahlen verändert und Funktion analysiert werden kann. Die Cochlea-Lokalisierung der spezifischen Frequenzbereiche erfolgt zuverlässig mit Frequenzkarten in Verbindung mit Cochleogramm-Daten. Das Mikroskop gibt Einblick in mehrere Forschungsstudien.

Es unterstützt die Vorstellung, dass die Cochlea-Neuropathie die primären Anfangsereignisse ist, die speziell vor Hörverlust, Tinnitus und Hyperacusis stehen. Nach der Bestätigung einer mangelnden Reaktion auf Zehenkneifen in einem anästhesierten acht Wochen alten Erwachsenen C57 schwarz 6J männliche Maus. Platzieren Sie die Maus auf einem 37 Grad Celsius-Heizkissen in einem elektrisch und akustisch abgeschirmten Raum.

Als nächstes legen Sie eine subdermale 20 Millimeter 28 Gauge Nadel AufnahmeElektrode, mit der Tiefe von drei Millimetern unter der Haut an der Scheitelpunkt des Schädels. Eine Referenzelektrode im ipsilateralen Ohrspeicheldrüsenbereich, unterhalb der Pinna des gemessenen Ohrs und einer Bodenelektrode im kontralateralen Ohrspeicheldrüsenbereich. Legen Sie einen geschlossenen Feldlautsprecher mit einem zwei Zentimeter großen Kunststoffrohr mit einer kegelförmigen Spitze neben die Maus und passen Sie die Spitze in den äußeren Gehörgang.

Für eine auditive Brainstem-Reaktion, oder ABR-Aufnahme, erzeugen Tonpips bei abnehmenden Schalldruckpegeln von 90 bis 10 Dezibel, in fünf bis 10 Dezibel Schalldruckpegelschritten. Während dieses Schritts werden die Antworten verstärkt, gefiltert und gemittelt. Bestimmen Sie bei jeder Frequenz den ABR-Schwellenwert, d. h. den minimalen Schalldruckpegel, der zu einer zuverlässigen ABR-Aufnahme mit einer oder mehreren unterscheidbaren Wellen führt, die durch visuelle Inspektion eindeutig identifiziert werden können.

Nach der ABR-Aufnahme die Bulla von der ventralen Seite aussetzen und die Bulla mit einer scharfen Schere öffnen, um Zugang zur Cochlea zu erhalten. Entfernen Sie mit feinen Zangen die zeitlichen Knochen und trennen Sie die Schlagschlagsader. Entfernen Sie dann die Bänder aus dem ovalen Fenster und brechen Sie die runde Fenstermembran.

Drehen Sie die Spitze einer 13-Millimeter-27-Messnadel vorsichtig, um ein kleines Loch an der Spitze der Cochlea zu bilden, bevor Sie mit einer fein gekippten Pipette 4% Paraformaldehyd sanft durch das Fenster in die perilymphatischen Räume spülen. Als nächstes spülen Sie die Knochen dreimal für fünf Minuten pro Wäsche mit kalt frischen 0,1 Molaren PBS pro Wäsche. Gefolgt von der Entkalkung der Knochen mit 10%EDTA für vier Stunden bei Raumtemperatur und 20 Umdrehungen pro Minute auf einem horizontalen Shaker.

Übertragen Sie am Ende der Inkubation einen entkalkten Temporalknochen unter einem Sezierendes Mikroskop in frische0,1 Mol-PBS. Verwenden Sie 3 und 5 Dumont Zangen und eine 27 Gauge Nadel, um die apikalen, mittleren und basalen Cochlea-Regionen nacheinander zu sezieren. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um eine kleine Reihe von Schnitten entlang des Spiralbandes zu machen und die tektoriale Membran und Reissners Membran zu entfernen.

Das verbleibende auditive Epithel, einschließlich des spiralförmigen Limbus, wird weiter in einzelne Cochlea-Drehungen für ganze Mount-Präparate zerlegt. Verwenden Sie dann das 40-fache Ölobjektiv eines Lichtmikroskops, um die Basilarmembranlänge mit einer Skala von 250 Mikrometern im Augenstück zu messen. Es kann entlang der Stereocilia der inneren Haarzellen eingestellt werden.

Nach der Zerlegung jede Cochlea-Drehung in einzelne 2,5 Milliliter Zentrifugenröhren geben. Blockieren Sie jede unspezifische Bindung mit 10%Ziegenserum in PBS in 0.1%Triton X-100 für eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Rotator. Verwenden Sie am Ende der Inkubation 200 Mikroliter Pipettenspitze, um die Lösung unter einem Seziermikroskop zu entfernen.

Inkubieren Sie die Proben mit den primären Antikörpern von Interesse in 5%Ziegenserum und PBS in 0.1%Triton X-100 über Nacht bei 4 Grad Celsius auf einem Rotator verdünnt. Spülen Sie die Gewebeproben am nächsten Morgen dreimal für fünf Minuten mit kalten 0,1 Molaren PBS pro Wäsche, um alle verbleibenden primärantikörper zu entfernen. Dann beschriften Sie die Proben mit den entsprechenden Sekundärantikörpern, die in 5%Ziegenserum in PBS in 0,1%Triton X-100 verdünnt sind, für zwei bis drei Stunden bei Raumtemperatur am Rotator, geschützt vor Licht.

Waschen Sie die Proben am Ende der Inkubation dreimal mit 0,1 Mol-PBS, wie gezeigt, und übertragen Sie die Proben in einzelne 35-Millimeter-Platten mit 0,1 Mol-PBS. Legen Sie einen Tropfen DAPI-Ergänzungsmontagemedium auf den Schlitten und übertragen Sie die Proben von PBS auf das Montagemedium. Legen Sie eine Kante eines Deckels auf jeden Schlitten und lösen Sie, damit die Abdeckungsrutschen sanft fallen.

Dann trocknen Sie die Rutschen in einer Rutschenbox bei vier Grad Celsius über Nacht. Um die Proben abzubilden, verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit den entsprechenden Lasern und 63X hochauflösende Öl-Tauchlinse, um acht Mikrometer konfokale Z-Stacks aus jeder Cochlea-Drehung zu erfassen. Für synaptische Punktzeichen, stellen Sie die Z-Stacks mit der 0,3 Mikrometer Schrittgröße, um die gesamte Länge der inneren Haarzellen zu überspannen, um zu versichern, dass alle synaptischen Puncta abgebildet werden können und die Punktzeichen mit Bildern in einem Z-Stack zusammenführen, um die Z-Zugriffsprojektion zu erhalten.

Importieren Sie die zusammengeführten Bilder in ein entsprechendes Bildverarbeitungssoftwareprogramm. Teilen Sie die synaptischen Gesamtanzahl in jedem Z-Stack in bestimmten Frequenzbereichen durch die Anzahl der DAPI-positiven inneren Haarzellen, um die Anzahl der synaptischen Punktzeichen für jede Zelle zu berechnen. In jedem bestimmten Frequenzbereich durchschnittlich alle synaptischen Puncta in drei Bildern von verschiedenen mikroskopischen Feldern, die neun bis elf innere Haarzellen enthalten.

Um die zytoskelettale Architektur und die synaptische Lokalisation besser zu visualisieren, verwenden Sie das Pinselwerkzeug, um die synaptische Struktur und Verteilung der einzelnen inneren Haarzellen visuell zu bewerten. Um die Gegenüberstellung von präsynaptischen Bändern und postsynaptischen Rezeptor-Patches zu inspizieren, verwenden Sie das rechteckige Festzeltwerkzeug, extrahieren Sie den Voxelraum um die Bänder und verwenden Sie das Bildschneiden, um die einzelnen Bänder zu isolieren. Klicken Sie dann auf Bild und Bildgröße, um ein Miniaturarray dieser Miniaturprojektionen zu erhalten, mit denen gekoppelte Synapsen im Vergleich zu verwaisten Multibändern identifiziert werden können.

Alle zehn Mäuse in diesem repräsentativen Experiment wiesen ABR-Schwellenwerte als Reaktion auf Tonausbrüche zwischen 25 und 70 Dezibel pro Schalldruckpegel in Abhängigkeit von der Frequenz des Stimulus auf. Die Hörschwelle für dieses Experiment war mit 16 Kilohertz am niedrigsten, was einem Abstand von etwa 43 % zum Cochlea-Spitzenwert entspricht, was darauf hindeutet, dass die akustische Empfindlichkeit in anderen Cochlea-Regionen signifikant reduziert wird. Ganze Halterungen des auditiven Epithels werden in drei Teile zerlegt und die Längen werden gemessen und in ihren prozentualen Abstand von der Cochlea-Spitze umgewandelt.

Die Frequenzposition auf der Basilarmembran jeder Cochlea-Drehung wird mit hilfe der logarithmischen Funktion berechnet. In normalen Ohren von erwachsenen Mäusen zeigt die Immunfärbung nebeneinander einander gegenübergestellte Paare von synaptischen Bändern und Glutamatrezeptor-Pflastern. Untersuchung der Oberfläche der basolateralen Membran der inneren Haarzellen mit acht bis 20 Paaren pro Zelle.

Obwohl die überwiegende Mehrheit der Punktzeichen als nebeneinander gestellte Paare in normalen Ohren erscheinen, werden verwaiste Bänder selten bei hohen Vergrößerungen beobachtet. Die Anzahl der inneren Haarzellbandsynapsen ist am höchsten in der 16-Kilohertz-Region und nimmt mit zunehmender Entfernung von dieser Position deutlich ab. Das Wichtigste, was man sich bei diesem Eingriff merken sollte, ist, dass man die Integrität der Cochlea-Basalmembran garantieren muss.

Wir müssen die Genauigkeit betonen, bis die technischen Fähigkeiten erreicht sind. Nach diesem Verfahren kann die Gentherapie durchgeführt werden, um zu beantworten, ob die Cochlea-Neuropathie durch diese Maßnahme repariert werden kann. Diese Maßnahme ist eine breitere Technik zur Erforschung der Cochlea-Neuropathie, die, wenn die primären Anfangsereignisse mit Hörverlust, Tinnitus und Hyperacusis in Verbindung gebracht werden.