Experimentelle Modelle zur Untersuchung der Neuroprotektion der sauren Nachkonditionierung gegen zerebrale Ischämie

Das übergeordnete Ziel der Azidose-Behandlung in einem kortiko-striatalen Schnittmodell in einem Modell mit Verschluss der mittleren Hirnarterie besteht darin, die neuroprotektive Wirkung einer sauren Postkonditionierung gegen zerebrale Ischämie zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zu beantworten, wie eine Azidose nach der Konditionierung ischämische Hirnverletzungen schützen kann, und eine neue Strategie für die Schlaganfalltherapie zu entwickeln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass weit verbreitete Experimentmodelle verwendet werden können, um die Neuroprotektion der Azidose nach der Konditionierung zu untersuchen.

Verfahren wird von Yarong Zheng, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie damit, das Gehirn mit einem dünnen Spatel aus dem Schädel einer geköpften Maus zu entfernen und es vorsichtig in ein Becherglas fallen zu lassen, das eiskaltes normales ACSF enthält, das mit fünf Prozent Kohlendioxid und 95 % Sauerstoff ausgeglichen ist. Tragen Sie Kryopräzipitatkleber in zwei Streifen auf die Vibratonplatte auf.

Legen Sie ein Stück dreiprozentige Agarose auf den Klebestreifen, der am weitesten von der Klinge entfernt ist, um das Gehirn zu stützen. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um das Gehirn auf Filterpapier zu übertragen. Schneide mit einer Klinge den Frontpol und das Kleinhirn ab.

Lege das Hirngewebe senkrecht auf den freien Leimstreifen, wobei das Gehirn gegen die Agarose lehnt. Geben Sie eiskaltes ACSF in das Schneidreservoir, um das Gehirn zu untertauchen und Eis in den Eishalterbereich zu geben. Halten Sie den ACSF im Reservoir mit fünf Prozent Kohlendioxid und 95 % Sauerstoff gefüllt.

Nachdem Sie das Vibraton so eingestellt haben, dass es 400-Mikrometer-Abschnitte schneidet, und das Gehirn richtig relativ zur Schneidklinge positioniert haben, drücken Sie die Start-Stopp-Taste, um den automatischen Schnitt zu starten. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette mit einer abgeschnittenen Spitze, um fünf Gehirnschnitte nacheinander zu übertragen und legen Sie sie in den Taschentuchhalter in eiskaltem, normalem ACSF, das mit fünf Prozent Kohlendioxid und 95 % Sauerstoff gefüllt ist. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur legen Sie die Gehirnscheiben für zehn Minuten in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius, um die synaptische Funktion wiederherzustellen.

Geben Sie glukosefreies ACSF und saures ACSF in das 37 Grad Celsius heiße Wasserbad und sprudeln Sie die Lösungen 30 Minuten lang mit fünf Prozent Kohlendioxid und 95 % Stickstoff bzw. 20 Prozent Kohlendioxid und 80 % Sauerstoff. Übertragen Sie vier der fünf Gehirnscheiben vorsichtig in ein vorgeheiztes, glukosefreies ACSF mit 37 Grad Celsius und inkubieren Sie es 15 Minuten lang. Um das Zeitfenster für die saure Präkonditionierung zu untersuchen, übertragen Sie eine Scheibe direkt von glukosefreiem ACSF auf saures ACSF und übertragen Sie die anderen drei Scheiben zur Reperfusion auf reguläres ACSF.

Nach drei Minuten die Scheibe in saurem ACSF auf normales ACSF übertragen. Übertragen Sie dann nach fünf Minuten bei normaler ACSF für drei Minuten eine der Scheiben von der regulären ACSF auf den Gewebehalter bei saurer ACSF. Übertragen Sie eine weitere Scheibe auf die gleiche Weise 15 Minuten nach der Reperfusion.

Die verbleibende Scheibe, die in glukosefreies, aber nicht saures ACSF gelegt wurde, wird als Sauerstoff-Glukose-Deprivationsgruppe festgelegt. Übertragen Sie die Scheiben aus dem ACSF in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit TTC-Lösung. Strecken Sie die Scheibe in der Lösung aus.

Und dann bei 37 Grad Celsius in einem flachen Wasserbad für 30 Minuten inkubieren. Übertragen Sie anschließend die Scheiben in saubere, gewogene 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, die mit Folie bedeckt sind, und messen Sie das Trockengewicht der Scheiben. Nach dem Wiegen wird Formazan extrahiert, indem eine Eins-zu-Eins-Lösung aus Ethanol und Dimethylsulfoxid in einem Volumen-Gewichts-Verhältnis von 10 zu eins in die Röhrchen gegeben wird.

24 Stunden lang lichtgeschützt inkubieren. Am nächsten Tag wird die Ethanol-Dimethylsulfoxid-Lösung aus den Röhrchen auf eine 96-Well-Platte übertragen und die Absorption bei 490 Nanometern mit einem Plattenlesegerät gemessen. Bestätigen Sie zunächst die richtige Anästhesie, indem Sie einen Zehenkneifreflex fehlen.

Legen Sie dann die anästhesierte Maus mit der LDF-Sonde, die an ihrem Schädel befestigt ist, in Rückenlage und fixieren Sie sie mit sterilen Baumwollfäden. Desinfizieren Sie die rasierte Haut des Halses mit 75%igem Ethylalkohol. Nach einem peri-medianen Hautschnitt im Hals stumpf präparieren Sie die Weichteile mit einer Pinzette, um die Blutgefäße freizulegen.

Geben Sie einen Tropfen Kochsalzlösung in das freiliegende Gewebe, um es mit Feuchtigkeit zu versorgen. Als nächstes verwenden Sie eine Augenzange, um die Arteria carotis communis aus dem umgebenden Gewebe und dem Vagusnerv zu präparieren. Achten Sie darauf, den Vagusnerv nicht zu beschädigen.

Platzieren Sie eine Mikrogefäßklemme am distalen Ende der Arteria carotis communis. Und binden Sie einen toten Knoten mit 6-0 Seidennähten am proximalen Ende. Binden Sie dann einen losen Knoten proximal als provisorische Naht an die Klemme.

Als nächstes machen Sie mit einer Mikro-Ophthalmoschere einen kleinen Längsschnitt zwischen den beiden Knoten, so nah wie möglich am toten Knoten. Führen Sie nun ein 12 Millimeter langes, spitzenstumpfes Monofilament durch den Schnitt in das Arterienlumen ein und schieben Sie es einige Millimeter vor. Ziehe den losen Knoten um die Spitze des Monofilaments fest und entferne dann die Klemme.

Verwenden Sie dann eine Augenzange, um das Filament in die innere Halsschlagader zu schieben, bis die LDF-Software einen starken Rückgang des Blutflusses anzeigt. Notieren Sie die Startzeit der Okklusion. Schneiden Sie dann die LDF-Sonde ab und legen Sie die Maus für die einstündige Dauer der Okklusion in einen 30 Grad Celsius heißen Inkubator.

55 Minuten nach Beginn der Okklusion das Tier mit Isofluran reanästhesieren und das Tier wie zuvor lagern. Öffnen Sie dann den Halsschnitt und legen Sie die Arteria carotis communis wieder frei. Ziehen Sie das Filament nach der Okklusionsphase mit einer Augenzange vorsichtig heraus, um eine Reperfusion zu erreichen.

Verwandeln Sie dann die provisorische Naht in eine dauerhafte, indem Sie den Knoten festziehen. Für die Behandlung von Azidose wird das durch den Nasenkegel eingeatmete Gas fünf Minuten lang auf 20 % Kohlendioxid, 20 % Sauerstoff und 60 % Stickstoff umgestellt. Nachdem Sie den Schnitt mit einer unterbrochenen chirurgischen Naht verschlossen haben, legen Sie die Maus in einen 30 Grad Celsius beheizten Käfig, bis die Maus wieder zu Bewusstsein kommt.

Dieses Histogramm zeigt die Ergebnisse des TTC-Assays, der an kortikalen Schnitten nach Sauerstoff-Glukose-Entzug und saurer Nachkonditionierung durchgeführt wurde, wie in diesem Video gezeigt. Eine dreiminütige Azidosebehandlung war neuroprotektiv, wenn die Behandlung sofort oder fünf Minuten nach dem Sauerstoffglukoseentzug eingeleitet wurde, aber nicht, wenn die Scheiben 15 Minuten lang reperfundiert wurden. Die Mäuse wurden 60 Minuten lang einem Verschluss der mittleren Hirnarterie unterzogen und behandelt, indem sie fünf, 50 oder 100 Minuten nach der Reperfusion fünf Minuten lang 20 % Kohlendioxid inhalierten.

Das Infarktvolumen wurde durch zwei, drei, fünf Triphenyltetrazoliumhydrochlorid-Färbungen 24 Stunden nach der Reperfusion quantifiziert, wie durch die schwarz gestrichelten Linien angezeigt. Dieses Histogramm zeigt das prozentuale Infarktvolumen für jede Erkrankung. Die Neuroprotektion durch saure Postkonditionierung war auch dann robust, wenn die Einsetzenszeit auf 50 Minuten nach der Reperfusion verzögert wurde.

Die Azidose-Behandlung, die nach 100 Minuten begann, blockierte die ischämische Verletzung jedoch nicht. Nachdem Sie sich das Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Neuroprotektion der Azidose nach der Konditionierung am OGD-Modell von Hirnschnitten und am MSO-Modell von Mäusen untersucht. Beim Versuch der Eingriffe ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Verlängerung und die Dauer der Azidose sehr wichtig sind, um die schützende Wirkung zu reproduzieren.