Vorbereitung E18 Kortikale Rattenneuronen für Kompartimentierung in einer mikrofluidischen Vorrichtung

Hallo und willkommen im Labor von Dr.Newly John. In einem früheren Video haben wir gezeigt, wie wir das Neuronengerät herstellen, eine Plattform, die es dem Forscher ermöglicht, die Zellkörper der Neuronen von einer reinen axonalen Fraktion zu trennen. Die weiche Lithographie ist die Technik, die zur Herstellung der Geräte verwendet wird und aus dem Gießen und Aushärten von PDMS auf einem Siliziumwafer besteht, der das zuvor mittels Photolithographie hergestellte Gerätedesign enthält.

In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie Sie die kortikalen Neuronen E 18 von Sprodolly E 18 präparieren und wie die Neuronen in das Neuronengerät geladen werden. Ich möchte Ihnen Kiana Lee vorstellen. Sie wird heute an den Demonstrationen teilnehmen.

Bevor Sie beginnen, ist es wichtig, alle notwendigen Medien und Reagenzien im Wasserbad auf 37 Grad erwärmt zu haben. Sie können neuro-basale Medien 0,25 % Trypsin und DMEM mit 10 % FBS sehen. Es ist wichtig sicherzustellen, dass alles, was in die Haube gelegt wird, um für die Reparatur der Zellen verwendet zu werden, sterilisiert und mit 70% Ethanol abgewischt wird.

Zuerst wird die Gewebekulturhaube mit 70% Ethanol abgewischt. Als nächstes werden die Kunststoffgestelle, die zur Aufnahme der Röhrchen verwendet werden, mit Ethanol besprüht. Als nächstes wird der Gummiball, der im Tri-Streifen-Prozess verwendet wird, mit Ethanol gereinigt.

Es ist wichtig, dies frühzeitig zu tun, damit es genügend Zeit zum Trocknen hat. Anschließend werden die notwendigen Reagenzien mit Ethanol abgewischt und in die Haube gebracht. Zwei Stücke des fetalen Rattenkortex E 18, die ein zuvor präpariertes Gehirn repräsentieren, werden in ein 15-ml-Röhrchen gegeben, das einen ml, eiskalten, kalziumfreien, magnesiumfreien Dissektionspuffer enthält, wobei ein ml 0,25%tripsin EDTA in den Kortex im Dissektionspuffer gegeben wird, wodurch das endgültige Volumen auf zwei Mills und die endgültige Tryinkonzentration auf 0,125% gebracht wird. in einem 37 Grad heißen Wasserbad für acht Minuten, während die fetale Hirnrinde bei 37 Grad in Trypsin inkubiert.

Drei Pastenpipetten sind feuerpoliert. Die Spitze der Glaspipette wird gerade in Kontakt mit der Flamme in der Nähe des blauen Teils der Flamme platziert und langsam gedreht, bis nur noch die Öffnung orange wird. Als es orange wurde.

Es ist wichtig, die Glaspipette immer wieder zu drehen, damit sie nicht zusammenfällt. Beachten Sie, dass die Öffnungen der Glaspipetten sukzessive kleiner werden. Es ist auch wichtig zu beachten, dass Sie die Öffnungen nicht zu klein machen sollten, da dies zu einer Lyse der Zellen führen kann, nachdem die Rinde acht Minuten lang bei 37 Grad inkubiert wurde, wobei das Trypsin 10 ml DMEM mit 10% FBS in die Rinde gegeben wurde, um die Trypsinreaktion zu stoppen.

Das 15-ml-Röhrchen, das den Kortex und DMEM 10%FBS enthält, wird zwei Minuten lang bei 2.500 U/min zentrifugiert. In der Biosicherheitswerkbank wird eine Vakuumabsaugung, die an einer Glaspipette befestigt ist, verwendet, um den Überstand aus der Rinde zu entfernen. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören oder zu verdrängen.

Ein ml neurales Basalmedium, das B 27 und Glutamat enthält, wird dem Cortex-Pellet zugesetzt und vorsichtig auf und ab pipettiert. Es ist sehr wichtig, beim Auf- und Abpipettieren keine Luftblasen zu erzeugen, da die Luftblasen die Zellen durch Oxidation schädigen können. Als nächstes wird die feuerpolierte hintere Pipette mit der breitesten Öffnung verwendet, um die Hirnrinde zu trizieren, indem ein steriler Gummikolben am Ende der Pipette befestigt und etwa fünfmal auf und ab pipettiert wird.

Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen. Okay. Der Prozess wurde mit den beiden anderen Glaspipetten fortgesetzt, jeweils mit der verringerten Öffnungsgröße. Wie bereits erwähnt, ist darauf zu achten, dass während des Tri stri stri ation Prozesses keine Blasen eingebracht werden.

Sie sollten auch feststellen, dass Sie keine sichtbaren Blöcke mehr sehen. Es ist wichtig, das Tri-Rating so lange beizubehalten, bis Sie keinen der Teile des Kortex mehr in den Medien sehen können. Nach der Ation werden die Zellen erneut zwei Minuten lang bei 2.500 U/min zentrifgeschmolzen.

Das ist ungefähr die Größe des Pellets, die man von zwei Cortex-Stücken erwarten würde. Nach der Zentrifugation wird das Sup Natin wieder aus dem Küvettenpellet entfernt. Nach der Entfernung von Super Natin wird ein ml neurobasales Medium, das B 27 und Glutamat enthält, dem Kortex zugesetzt und zur Wiederbelebung des Cortex-Suspends verwendet.

Das Zellpellet wird noch einmal vorsichtig auf und ab pipettiert, um Blasenbildung zu vermeiden und sicherzustellen, dass das Zellpellet gleichmäßig verteilt und aufgebrochen wird. Ein weiterer mil neurobasales Medium wird der Zellsuspension zugesetzt, wodurch das endgültige Volumen auf zwei mil ankommt. Als nächstes wird die resuspendierte Zelllösung durch ein 40-Mikron-Zellsieb von BD biosciences filtriert, um die Zellen zu zählen und die Lebensfähigkeit zu beurteilen.

60 Mikroliter frisches neurales Basalmedium werden in ein steriles Mikrofuge-Röhrchen gegeben. 20 Mikroliter Zellen werden dann zu den 60 Mikrolitern neuronalen Basalmedien hinzugefügt, und schließlich werden 20 Mikroliter Trianblau zu den Zellen im neurobasalen Medium hinzugefügt. Das Trianblau färbt Zellen, die nicht mehr lebendig sind, nachdem die Zellen mit Trianblau gefärbt wurden.

Wir pipettieren 20 Mikroliter auf ein Hämozytometer und betrachten sie unter dem Mikroskop. Lebensfähige Zellen erscheinen klar und durchscheinend, während Zellen, deren Membranen durchstochen sind, aufgrund des Trianblaus blau gefärbt sind. Typischerweise erhalten wir etwa 2,5 Millionen Zellen und 8 Millionen Zellen pro Kortex.

Normalerweise erhalten wir zwei Teile des Kortex von einem Gehirn, wobei die Zellen in einem Endvolumen von zwei mil resuspendiert werden. Daher liegt die Endkonzentration von Zellen typischerweise zwischen 2,5 Millionen Zellen pro Monat und 8 Millionen Zellen pro Jahrtausend. Normalerweise laden wir etwa 20 Mikroliter Zellen pro Gerät.

Damit haben wir einen Zellbereich pro Gerät zwischen 50.000 Zellen und 160.000 Zellen. Die Zelldichten können je nach Anwendung variiert werden. Die Aussaat primärer Neuronen mit einer zu geringen Dichte führt jedoch in der Regel zum Zelltod. Geräte, die zuvor mit neuralen Basalmedien hergestellt wurden, werden in die Biosicherheitswerkbank gebracht, um die Sterilität aufrechtzuerhalten.

Überschüssiges Medium aus den Vertiefungen wird durch eine Vakuumsektion entfernt. Man muss jedoch darauf achten, dass nicht alle Medien entfernt werden. Es dürfen sich einige Medien im Hauptkanal befinden, die nur Medien aus den Behältern ansaugen.

Nur 20 Mikroliter Zellen werden auf das obere linke Reservoir des Geräts aufgebracht. Die Zellen fließen in das Gerät und heften sich an die PLL-behandelte Oberfläche. Hier können Sie sehen, wie die Zellen durch den Hauptkanal nach unten fließen, und Sie werden sehen, wie einige von ihnen tatsächlich mit dem Glas verbunden sind.

Nach dem Laden werden die Geräte, die die Zellen enthalten, für etwa 10 Minuten in einen Inkubator gelegt, damit sich die Zellen anheften können. Nach 10 Minuten im Inkubator werden die Geräte wieder in die Biosicherheitswerkbank gebracht, die Reservoirs mit Medien gefüllt und die Geräte dann wieder in den Inkubator gestellt. Abhängig vom Inkubator und der Luftfeuchtigkeit, die das Medium benötigt, müssen die Geräte alle zwei bis drei Tage gewechselt werden.

Es empfiehlt sich, frisches Medium in die oberen Vertiefungen zu geben und etwas frisches Medium durch das Gerät in die Hauptkanäle fließen zu lassen, bevor alle Reservoirs gefüllt werden. Die Neuronen werden hier mit Calcium am visualisiert, einem zelldurchlässigen Farbstoff, der lebende Zellen färbt. Hier sehen Sie das So-Kompartiment oder die Zellseite des Geräts, das die Zellkörper, Axone und Dendriten enthält.

Wenn wir über das Gerät schwenken, können Sie die Mikrorillen sehen, durch die die Axone wachsen, um die andere Seite des Geräts zu erreichen, die Axonseite, die eine reine axonale Fraktion enthält. Zu Demonstrationszwecken. Diese fluoreszenzmarkierten Zellen werden verwendet, um das Verfahren der Axotomie zu veranschaulichen.

Eine der Eigenschaften des Neuronengeräts besteht darin, dass es dem Forscher ermöglicht, eine Exotomie durchzuführen, d. h. die Axone aus der reinen axonalen Fraktion des Geräts zu schneiden. Um Forschungen durchzuführen, wie z. B. die Untersuchung der axonalen Regeneration. Keano wird nun die Durchführung der Exotomie im Neuronengerät demonstrieren, wobei die Exotomie durch ein Vakuum durchgeführt wird.

Eine sterile Glaspipette wird an der unteren Öffnung der Vertiefung auf der axonalen Seite platziert, das Medium wird durch Vakuum abgesaugt. Alle Medien werden vollständig von der axonalen Seite des Geräts entfernt, einschließlich der Medien im Hauptkanal. Um den Vorgang nach dem Entfernen des Mediums zu wiederholen, werden 150 Mikroliter Medium in den Hauptkanal gedrückt, indem die Spitze der Pipette an die Öffnung des Hauptkanals gesetzt und die Pipette mit Kraft gedrückt wird.

Als nächstes wird das Vakuum an die Öffnung des Hauptkanals und die obere Vertiefung der axonalen Seite des Geräts angelegt. Auch hier wird das Vakuum verwendet, um alle Medien von der axonalen Seite, einschließlich des Hauptkanals, zu entfernen. Auch hier werden 150 Mikroliter Medium in den Hauptkanal gedrückt, indem die Spitze der Pipette an die Öffnung des Hauptkanals gesetzt und die Pipette mit Kraft gedrückt wird.

Zu diesem Zeitpunkt kann der Forscher das Gerät unter einem Mikroskop betrachten, um die Effizienz des Axonschnitts zu überprüfen. Werden die Axone nicht ausreichend geschnitten, kann der Vorgang bei Bedarf noch einmal wiederholt werden. In diesem Video haben wir Ihnen gezeigt, wie Sie kortikale E 18-Rack-Neuronen vorbereiten und in das Neuronengerät laden.

Der Hauptvorteil dieser Geräte ist die Fähigkeit, die Kultivierung der Neuronenzellkörper auf der einen Seite des Geräts von einer reinen axonalen Fraktion auf der anderen Seite des Geräts zu trennen und zu unterteilen. Wir hoffen, dass Sie dieses Video informativ und hilfreich fanden. So, das war's vom John Lab.

Danke fürs Zuschauen.