Eine In-vitro-Technik zur Untersuchung der Bildung von Inflammasom-Komplexen in Makrophagen

Beginnen Sie mit einer Platte, die eine Kultur mit primären Makrophagen enthält.

Einführung des bakteriellen Lipopolysaccharids, LPS, das an Toll-like-Rezeptoren auf Makrophagen bindet und eine Hochregulierung der Pyrindomäne 3 oder NLRP3 der Proteinfamilie NLR-Familie auslöst.

Fügen Sie ein Ionophor hinzu, das den Ausfluss von Kaliumionen vermittelt. Vermindertes zytosolisches Kalium aktiviert NLRP3. Aktiviertes NLRP3 oligomerisiert und induziert die Rekrutierung eines Adapterproteins, das wiederum Pro-Caspase-1 rekrutiert und ein Inflammasom bildet.

Die Autoproteolyse wandelt Pro-Caspase-1 in aktive Caspase-1 um, die den entzündlichen Zelltod oder die Pyroptose vermittelt. DNA-Schäden während der Pyroptose führen zur Kernkondensation.

Fixieren Sie die Zellen und behandeln Sie sie mit einem Reinigungsmittel, um sie zu permeabilisieren.

Fügen Sie einen primären Antikörper hinzu, der an das Inflammasom-assoziierte Adapterprotein bindet, und einen fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper, der an den primären Antikörper bindet und das Inflammasom markiert.

Führen Sie eine fluoreszierende Nukleinsäurefärbung ein, um den Zellkern zu markieren. Unter einem Fluoreszenzmikroskop zeigen die