Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe eines in-vitro-menschlichen Suppressionsassays die Funktion regulatorischer T-Zellen (Treg) zu messen und einen möglichen zukünftigen Funktionsverlust vorherzusehen. Dies wird erreicht, indem zunächst codierte Kügelchen hergestellt und getestet werden, die als Zellstimulatoren verwendet werden. Der zweite Schritt besteht darin, reine naive CD4-positive, CD25-negative T-Zellen, in vivo aktivierte CD4-positive, CD25-low T-Zellen sowie regulatorische CD4-positive, CD25-hohe T-Zellen zu isolieren, um anschließend bestrahlte PBMCs als antigenpräsentierende Zellen (APCs) einzusetzen.

Anschließend werden Einzelkulturen von naiven oder aktivierten T-Zellen als Respondern zusammen mit P-BMCs als APZs oder Co-Kulturen unter denselben Bedingungen, jedoch mit hinzugefügten Tregs im Verhältnis 1 zu 10, angelegt. Im letzten Schritt werden die Zellen geerntet und ihre Proliferation durch die Inkorporation von tritiiertem Thymidin gemessen. Die letztlich erhaltenen Ergebnisse können Unterschiede in der Suppression von Antworten naiver gegenüber in-vivo-aktivierter T-Zellen aufzeigen.

Mein Name ist Jeff Woodcliff. Regulatorische T-Zellen exprimieren keine einzigartigen Oberflächenmarker. Daher müssen sie zur zuverlässigen Bestimmung ihrer Funktion mit Techniken isoliert werden, die die beste Trennung ermöglichen.

Der Hauptvorteil der Nutzung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung gegenüber anderen Methoden wie der Max-Isolierung besteht darin, dass per FACS reine Zellpopulationen erzielt werden können. Die Zellfunktion kann anschließend zuverlässig in In-vitro-Suppressionsassays getestet werden, wie hier gezeigt. Obwohl diese Methode Einblicke in die Treg-Funktion bei gesunden Probanden und bei Personen mit Typ-1-Diabetes ermöglicht, kann sie auch auf andere autoimmune Erkrankungen angewandt werden, wie beispielsweise rheumatoide Arthritis beim Menschen, systemischen Lupus erythematodes, erythema multiforme, multiple Sklerose und andere. Um TAA-L-aktivierte Kügelchen mit Anti-human-CD3 zu beschichten.

Geben Sie ein Milliliter der M450-Aktivierter Kugeln aus dem ursprünglichen Vial in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und stellen Sie das Röhrchen in einen Magnethalter, bis alle Kugeln an der Seitenwand des Röhrchens haften. Entfernen Sie dann den Kugelpuffer, indem Sie ihn abpipettieren, während sich das Röhrchen noch im Magnethalter befindet. Danach nehmen Sie das Röhrchen aus dem Magnethalter und geben ein Milliliter Puffer eins hinzu.

Stellen Sie das Röhrchen erneut auf den Magnethalter. Entfernen Sie den Puffer, während sich das Röhrchen auf dem Magnethalter befindet. Resuspendieren Sie die Kügelchen erneut in einem Milliliter Puffer.

Dieses Mal zusätzlich 40 Mikroliter Anti-human CD3 hinzufügen. Die Kügelchen und den Antikörper 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius schütteln. Anschließend 0,1 % Gewicht pro Volumen BSA hinzufügen und weitere 16 Stunden lang weiter schütteln.

Anschließend werden die Kügelchen zweimal mit Puffer zwei gewaschen, indem man die Kügelchen in einem Milliliter Puffer zwei für fünf Minuten bei zwei bis acht Grad Celsius inkubiert und anschließend den Puffer entfernt, während sich das Gefäß im magnetischen Ständer befindet. Danach erfolgt ein weiterer Waschschritt unter denselben sterilen Bedingungen.

Dieses Mal unter Verwendung von einem Milliliter Puffer drei die Effizienz der Antikörperbeschichtung testen, indem eine variable Anzahl von CD-drei-beschichteten Kügelchen pro Zelle zugegeben wird, um das optimale Verhältnis zu bestimmen, sowie ALI mit jeweils 50.020 bis 5.000 PBMCs pro Vertiefung in Dreifachbestimmung in einer 96-Rillen-Platte. Nach 72 Stunden Kultivierung bei 37 Grad Celsius ein Mikrocurie tritiiertes Thymidin hinzufügen und die Inkubation für die nächsten 16 Stunden fortsetzen. Die Zellen in einer Multi-Screen-Harvest-Platte oder vergleichbaren Vorrichtung sammeln.

Fügen Sie Szintillationsflüssigkeit hinzu und lesen Sie die Zählraten pro Minute oder CPM pro Mulde ab. Bestimmen Sie mit einem Top-Count-N-XT-Szintillationszähler oder einem vergleichbaren Gerät das Verhältnis von Kügelchen zu Zelle, wobei ein CPM-Wert verwendet wird, der nach unserer Erfahrung regelmäßig über 5.000, aber unter 15.000 liegt. Ein Verhältnis von drei Kügelchen pro Zelle führt in der Regel zu einer optimalen Stimulation sowohl der Effektorzellen als auch der Treg-Zellen bei allen getesteten menschlichen Probanden.

Füllen Sie ein 50-Milliliter-Konischgefäß mit 15 Millilitern Fal Plus. Führen Sie dann eine 1:6-Verdünnung von 50 Millilitern Buffy Coat durch, indem Sie 250 Milliliter PBS zum Blutgefäß hinzufügen. Schichten Sie langsam 25 Milliliter des verdünnten Buffy Coats vorsichtig auf die Ficoll-Pack-Schicht, ohne die Schichten zu stören.

Zentrifugieren bei 800 × g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie vorsichtig unter Auslassung des Bremsvorgangs die PBMC-Schicht, die die weiße Zwischenphase zwischen Fläschchen und dem Puffer darstellt. Falls erforderlich, kratzen Sie die Zellen von der Röhrenwand ab.

Warten Sie einige Minuten und sammeln Sie sie erneut aus der Zwischenphase. Überführen Sie die Zellen in frische 50-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie sie, indem Sie die Röhrchen mit PBS-Pellet auffüllen. Die PBM cs.

Wiederholen Sie den Waschschritt jedes Mal zweimal. Kombinieren Sie zwei Zellpellets in einem einzigen Reaktionsgefäß und fassen Sie letztendlich alle Zellpellets in einem einzigen 50-Milliliter-Gefäß zusammen. Verwenden Sie anschließend 20 Mikroliter der suspendierten Zellen, um die Zellviabilität mittels Trypanblau-Ausschluss zu bestimmen.

Erzeugen Sie Test-APCs, indem Sie ein Milliliter der lebensfähigen PBMCs in ein neues Röhrchen überführen. Fügen Sie anschließend vier Milliliter Medium hinzu und bestrahlen Sie die Zellen mit 5.000 Rads. Füllen Sie das Röhrchen, das den Rest der PBMCs enthält, mit PBS-Puffer auf. Nach dem Zentrifugieren der Zellen bei 250 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius gießen Sie den Überstand ab und resuspendieren die Zellen in vier Milliliter derselben Zusammensetzung.

Fügen Sie dann 200 Mikroliter Max Anti-CD4-Mikroperlen zu den PBMCs hinzu und inkubieren Sie das Zell- und Perlen-Gemisch 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen mit 40 Millilitern PBS-Puffer und pelletieren Sie anschließend. Gießen Sie danach den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen in acht Millilitern entgastem PBS-Puffer bei Raumtemperatur.

Verwenden Sie anschließend Pres-Separationsfilter, um die Zellsuspension zu filtern. Danach teilen Sie die PBM-CS in zwei 15-Milliliter-Röhrchen auf. Geben Sie vier Milliliter der P-BMCs in jedes Röhrchen.

Befestigen Sie zwei S-Säulen an einem Minimax-Trenner und stellen Sie Sammelröhrchen unter jede Säule. Geben Sie dann drei Milliliter DGAs-PBS-Puffer in jede Säule. Wenn kein Puffer mehr vorhanden ist, schichten Sie die gesamte vier Milliliter große Zelllösung aus jedem Röhrchen über die Säulen, bevor die Zellsuspension vollständig durchgelaufen ist. Fügen Sie drei Milliliter DGAs-PBS-Puffer bei Raumtemperatur zu jeder Säule hinzu und lassen Sie den Puffer durch die Säulen in die Sammelröhrchen laufen.

Fügen Sie weiteres Puffer hinzu, bis die Lösung klar austritt. Pipettieren Sie weitere fünf Milliliter des DGAs-Puffers auf die LS-Säulen und nehmen Sie anschließend die LS-Säulen vom Minimax-Separator ab. Stellen Sie die Säulen in neue sterile 50-Milliliter-Sammelröhrchen.

Lassen Sie einen halben Milliliter ablaufen und drücken Sie dann langsam den restlichen Volumen, etwa vier Milliliter, heraus. Kombinieren Sie nun die beiden CD4-positiven Fraktionen. Geben Sie anschließend bis zu 50 Milliliter PBS in das Röhrchen und zählen Sie die Zellen, nachdem Sie diese bei vier Grad Celsius 10 Minuten lang mit 400 × g zentrifugiert haben.

Suspendieren Sie die Zellen in zwei Millilitern PBS-Puffer. Kombinieren Sie die für die FACS-Färbung verwendeten Antikörper in einem Gefäß: anti-CD14, CD32, CD116 und optional anti-CD4. Entnehmen Sie eine Aliquotmenge der Mischung zur Färbung des Fluorochrom-minus-eins-Gefäßes.

Bereiten Sie das FMO-Röhrchen vor, indem Sie fünf Mikroliter der Zellsuspension pro Milliliter in ein Fax-Röhrchen überführen und die Zellen mit zwei Mikrolitern des zuvor hergestellten Antikörpercocktails anfärben. Fügen Sie anschließend unbehandelte Zellen und mit Maus-IgG beschichtete Perlen, die mit einem einzelnen Fluorochrom angefärbt werden sollen, neuen einzelnen Fax-Röhrchen hinzu, die als Kompensationskontrollen für die Zellsortierung dienen. Geben Sie danach 50 Mikroliter Anti-human CD 25 PE zum Cocktail hinzu und geben Sie den Cocktail zur restlichen Zellsuspension.

Inkubieren Sie die Röhrchen bei vier Grad Celsius für 30 Minuten. Nach der Inkubation der Zellen mit dem Antikörpercocktail fügen Sie PBS-Puffer zu den Zellen hinzu und pelletieren Sie anschließend Resus. Suspendieren Sie das Pellet in PBS-Puffer mit einer Konzentration von 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter.

Verwenden Sie das FMO-Röhrchen, um die Schwelle für die Sortierung von CD25-positiven T-Zellen festzulegen. Legen Sie bei dieser Gating-Strategie zunächst ein Tor um die FITC-negativen Zellen, um die FITC-positiven Zellen auszuschließen, zu denen Monozyten, Makrophagen und alle anderen CD4-positiven Nicht-T-Zellen gehören, wie in dieser Abbildung dargestellt. Zeichnen Sie in einem separaten Diagramm Tore für CD25-negative und CD25-schwach positive T-Zellen sowie für CD25-stark positive Treg-Zellen, wie in dieser Abbildung gezeigt.

Nach dem Durchfluss, Sortierung der Zellsubpopulationen, die Sammelröhrchen pelletieren und die T-Zellen anschließend auf Eis lagern, bis sie in die Platte gegeben werden. Eine U-förmige 96-Well-Platte wie in der Tabelle gezeigt beschriften. Ein 50 µL Aliquot von CD3-beschichteten Perlen, berechnet auf drei Perlen pro Effektorzelle pro Well, in komplettem Medium mit 10 % gepooltem menschlichem AB-Serum in der 96-Well-Platte suspendieren, dann die zuvor bestrahlten APZs in Medium auf eine Konzentration von 5 × 10⁵ Zellen pro Milliliter verdünnen.

Geben Sie 50 Mikroliter der Zellen in die 96-Well-Platte und fügen Sie dann 2,5 × 10⁴ CD4-positive, CD25-negative oder CD4-positive, CD25-low T-Zellen pro Well im Triplikat hinzu. Fügen Sie Tregs in Reihe B und in die als Tregs-only gekennzeichneten Wells der Ko-Kultur im Verhältnis 1:10 hinzu, wie hier gezeigt. Inkubieren Sie anschließend die Platte 72 Stunden lang bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO₂ bei gesättigter Luftfeuchtigkeit. Danach pulsieren Sie die Zellen mit einem Mikrocurie tritiiertem Thymidin und setzen die Inkubation bei 37 °C für die nächsten 16 Stunden fort, nachdem das Thymidin in den letzten Stunden der Ko-Kultur eingebaut wurde.

Verwenden Sie einen Filtermate-Harvester, um die Zellen auf einer Multi-Screen-Harvest-Platte zu sammeln. Danach decken Sie die Harvest-Platte mit einer transparenten Kunststoffabdeckung ab, die zuvor mit einem Szintillationsfluid gefüllt wurde. Abschließend messen Sie die CPM pro Bohrung.

Mithilfe eines Szintillationszählers können T-Zell-Subpopulationen mit diesem System in hoher Reinheit isoliert werden, wie in der folgenden Serie von Punktdiagrammen zu sehen ist: CD4-positive, CD25-negative T-Zellen sind hier im unteren Tor dargestellt. In dieser nächsten Abbildung sind hochgereinigte CD4-positive, CD25-schwach positive T-Zellen zu erkennen. Eine reine Population von durch Flusszytometrie sortierten CD4-positiven.

CD25-hohe Treg-Zellen sind im oberen Gate-Control sichtbar. Einzelzellkulturen von APZs und Tregs von gesunden Probanden zeigten eine geringe bis keine Proliferation über dem Hintergrund, gemessen durch Thymidin-Inkorporation, während naive CD25-negative und in vivo aktivierte CD25-niedrige T-Zellen eine deutliche Proliferation zeigten, die unterdrückt wird, wenn diese reagierenden Zelltypen gemeinsam mit Treg-Zellen kultiviert werden. Obwohl geringfügige Unterschiede in der Fähigkeit der Tregs zur Unterdrückung der reagierenden naiven CD25-negativen und in vivo aktivierte CD25-niedrigen T-Zellen beobachtet wurden.

Es war keine signifikante Kontrolle. Einzelzellkulturen von APZs und Tregs von risikobehafteten Probanden zeigten eine geringe bis keine Proliferation über dem Hintergrund, gemessen durch Thymidin-Inkorporation. Während naive CD 25-negative und in vivo aktivierte CD 25-low T-Zellen geringere Proliferationsraten im Vergleich zu gesunden Kontrollen aufwiesen.

Die reagierenden T-Zellen wurden durch Tregs und Koinkubationen weiter unterdrückt, da der Test zuverlässige Ergebnisse liefert. Zusätzlich lässt sich schließen, dass niedrige CPM-Werte auf mögliche Defekte in der Signaltransduktion hindeuten, die in einer anderen Studienart weiter untersucht werden sollten. Der Unterschied in der Fähigkeit von Tregs, CD25-negative gegenüber CD25-low reagierenden T-Zellen bei gefährdeten Probanden zu unterdrücken, war jedoch signifikant.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie alle notwendigen Schritte nahtlos miteinander verbunden werden können, um einen erfolgreichen und zuverlässigen funktionellen Test zum Nachweis von Tregs bei gesunden Probanden und Probanden mit beeinträchtigtem Immunsystem durchzuführen. Zum Beispiel bei Probanden mit Typ-1-Diabetes.