Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen in vitro humanen Suppressionsassay zu verwenden, um die Treg-Funktion zu messen und möglicherweise einen zukünftigen Verlust ihrer Funktion zu antizipieren. Dies wird erreicht, indem zunächst kodierte Kügelchen hergestellt und getestet werden, die als Zellstimulatoren verwendet werden. Der zweite Schritt besteht darin, reine naive CD vier positive CD 25 negative T-Zellen in vivo, aktivierte CD vier positive, CD 25 niedrige T-Zellen und regulatorische CD vier positive CD 25 hohe T-Zellen N zu strahlenden PP BMCs zu isolieren, um sie als Antigen-präsentierende Zellen oder APCs zu verwenden.

Als nächstes werden Einzelkulturen von naiven oder aktivierten T-Zellen als Responder mit P-BMCs als APCs oder Co-Kulturen unter den gleichen Bedingungen aufgebaut, jedoch mit Tregs im Verhältnis eins zu 10. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen zu ernten und ihre Proliferation durch Tritiation zu messen. Die letztendlich erzielten Ergebnisse des Thymidineinbaus können Unterschiede in der Unterdrückung naiver und in vivo aktivierter T-Zell-Antworten zeigen.

Mein Name ist Jeff Woodcliff. Regulatorische T-Zellen exprimieren keine eindeutigen Zelloberflächenmarker. Um ihre Funktion zuverlässig messen zu können, müssen sie daher mit Techniken isoliert werden, die die beste Trennung ermöglichen.

Der Hauptvorteil der Verwendung von fluoreszenzaktivierter Zellsortierung gegenüber anderen Methoden wie maximaler Isolierung besteht darin, dass Fax die reinen Zellpopulationen bietet, die erreicht werden können. Die Zellfunktion kann dann zuverlässig in In-vitro-Suppressionsassays getestet werden, wie hier gezeigt. Diese Methode kann jedoch einen Einblick in die Treg-Funktion bei Gesunden und Probanden mit Typ-1-Diabetes geben. Es kann auch bei anderen Autoimmunerkrankungen wie rheumatoider Arthritis beim Menschen, systemischem Lupus, Ery-Mitose, Multipler Sklerose und anderen angewendet werden.

Geben Sie einen Milliliter der M vier 50 toil aktivierten Kügelchen aus dem Originalfläschchen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und stellen Sie das Röhrchen in einen Magnetständer, bis alle Kügelchen an der Seite des Röhrchens haften. Entfernen Sie dann den Bead-Puffer, indem Sie ihn herauspipettieren, während sich das Röhrchen noch im Magnetständer befindet. Nehmen Sie dann das Röhrchen aus dem Magnetständer und fügen Sie einen Milliliter Puffer hinzu.

Legen Sie das Rohr immer wieder in den Magnetständer. Entfernen Sie den Puffer, während sich das Rohr im Magnetständer befindet. Resus, suspendieren Sie die Kügelchen in einem Milliliter Puffer wieder.

Diesmal wurden auch 40 Mikroliter Anti-Human-CD drei hinzugefügt. Rühren Sie die Kügelchen und den Antikörper 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann 0,1 % Gewicht pro Volumen BS, A hinzu und rühren Sie in den nächsten 16 Stunden weiter.

Waschen Sie die Kügelchen anschließend zweimal mit Puffer zwei, indem Sie die Kügelchen in einem Milliliter Puffer inkubieren. Zwei für fünf Minuten bei zwei bis acht Grad Celsius und dann den Puffer entfernen, während sich das Röhrchen im Magnetständer befindet. Waschen Sie die Kügelchen dann noch einmal unter den gleichen sterilen Bedingungen.

Testen Sie diesmal unter Verwendung eines Milliliters Puffer drei die Wirksamkeit der Antikörperbeschichtung, indem Sie eine variable Anzahl von CD drei beschichteten Kügelchen pro Zelle hinzufügen, um das optimale Verhältnis zu bestimmen, und ALI mit 50.020 5.000 P BMCs pro Vertiefung in dreifacher Ausführung in einer 96-Kugelplatte. Nach 72 Stunden in Kultur bei 37 Grad Celsius fügen Sie ein Mikrocurry mit tritiiertem Thymidin hinzu und inkubieren Sie für die nächsten 16 Stunden weiter. Ernten Sie die Zellen in einer Multi-Screen-Ernteplatte o.ä.

Fügen Sie Szintillationsflüssigkeit hinzu und lesen Sie die Zählungen pro Minute oder CPM pro Vertiefung ab. Bestimmen Sie mit einem N XT-Szintillationszähler mit Top-Zählung oder ähnlichem das Verhältnis von Kügelchen zu Zellen mit demjenigen, der einen CPM von konstant über 5.000, aber unserer Erfahrung nach weniger als 15.000 ergibt. Ein Verhältnis von drei Kügelchen pro Zelle ergibt in der Regel bei allen getesteten menschlichen Probanden die optimale Stimulation sowohl für die Responder- als auch für die Treg-Zellen.

Füllen Sie ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 15 Millilitern fal plus. Führen Sie dann eine Verdünnung von 50 Millilitern Buffy Coat von eins bis sechs durch, indem Sie 250 Milliliter PBS in das Blutröhrchen geben. Schichten Sie langsam 25 Milliliter des verdünnten Buffy Coats auf die Fial-Packung, ohne die Schichten zu stören.

Zentrifugieren Sie bei 800 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Wenn die Pause ausgeschaltet ist, sammeln Sie vorsichtig die PBMC-Schicht, d. h. die weiße Zwischenphase zwischen Fial und Puffer. Kratzen Sie bei Bedarf Zellen von der Wand des Röhrchens ab.

Warten Sie ein paar Minuten und sammeln Sie sie aus der Zwischenphase wieder. Füllen Sie die Zellen in frische 50-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie sie, indem Sie die Röhrchen mit PBS-Granulat füllen. Die PBM cs.

Wiederholen Sie den Waschschritt jedes Mal zweimal. Durch die Kombination von zwei Zellpellets in einem einzigen Röhrchen werden schließlich alle Zellpellets in einem einzigen 50-Milliliter-Röhrchen kombiniert. Verwenden Sie dann 20 Mikroliter der suspendierten Zellen, um die Zellviabilität durch Trianblau-Ausschluss zu bestimmen.

Testen Sie die Generierung von APCs, indem Sie einen Milliliter des lebensfähigen PBMC in ein neues Röhrchen übertragen. Fügen Sie dann vier Milliliter Medium hinzu und bestrahlen Sie die Zellen mit 5.000 rad, um das Röhrchen, das den Rest der P-BMCs enthält, mit PBS-Puffer zu füllen. Nachdem Sie die Zellen 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 250 Mal G gedreht haben, gießen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen in vier Millilitern desselben Beimischungsmittels.

Geben Sie dann 200 Mikroliter max anti CD vier Mikrokügelchen in das pbmc und inkubieren Sie die Zell-Beads-Mischung bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation in 40 Millilitern PBS-Puffer und pelletieren Sie die Zellen dann. Gießen Sie dann den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen in acht Millilitern Degas PBS-Puffer bei Raumtemperatur.

Verwenden Sie anschließend Vorabscheidungsfilter, um die Zellsuspension zu filtern. Teilen Sie dann das PBM CS in zwei 15 Milliliter Röhrchen auf. Geben Sie vier Milliliter der P-BMCs in jedes Röhrchen.

Befestigen Sie mit einem dicken Riegel zwei s-Säulen an einem Minimax-Separator und platzieren Sie unter jeder Säule Sammelröhrchen. Geben Sie dann drei Milliliter DGAs PBS-Puffer zu jeder Säule, wenn kein Puffer mehr vorhanden ist, schichten Sie die gesamte vier Milliliter-Zelllösung aus jedem Röhrchen über die Säulen, bevor die Zellsuspension vollständig aufgebraucht ist. Geben Sie drei Milliliter DGAs PBS-Puffer bei Raumtemperatur in jede Säule und lassen Sie den Puffer in die Sammelröhrchen laufen.

Fügen Sie mehr Puffer hinzu, bis er klar herauskommt. Pipettieren Sie fünf weitere Milliliter des DGAs-Puffers auf die LS-Säulen und entfernen Sie dann die LS-Säulen aus dem Minimax-Separator. Setzen Sie die Säulen in neue sterile 50-Milliliter-Sammelröhrchen ein.

Lassen Sie einen halben Milliliter auslaufen und tauchen Sie dann langsam den Rest des Volumens heraus, das sind etwa vier Milliliter. Kombinieren Sie nun die beiden CD vier positive Fraktionen. Geben Sie dann bis zu 50 Milliliter PBS in das Röhrchen und zählen Sie die Zellen, nachdem Sie die Zellen 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 400 mal G gedreht haben.

Resuspendieren Sie die Zellen in zwei Millilitern PBS-Puffer. Kombinieren Sie die Antikörper, die für die Faktenfärbung verwendet werden sollen, in ein Röhrchen Anti-CD 14, CD 32, CD eins 16 und optional Anti-CD vier. Entnehmen Sie ein Aliquot der Mischung zum Färben des FLUOROCHROMS abzüglich eines Röhrchens.

Bereiten Sie das FMO-Röhrchen vor, indem Sie fünf Mikroliter der Milliliter-Zellsuspension des Röhrchens auf ein Faxröhrchen übertragen und die Zellen mit zwei Mikrolitern des zuvor vorbereiteten Antikörpercocktails färben. Als nächstes fügen Sie ungefärbte Zellen und Kügelchen, die mit Maus-IgG beschichtet sind, hinzu, die mit einem einzelnen Fluorochrom gefärbt werden sollen, zu neuen einzelnen Faxröhren, die als Kompensationskontrollen für die Zellsortierung verwendet werden. Geben Sie dann 50 Mikroliter Anti-Human-CD 25 PE in den Cocktail und fügen Sie den Cocktail zum Rest der Zellsuspension hinzu.

Inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie die Zellen mit dem Antikörpercocktail inkubiert haben, fügen Sie den Zellen PBS-Puffer hinzu und pelletieren Sie sie dann mit Resus. Suspendieren Sie das Pellet in PBS-Puffer in einer Konzentration von 10 bis sieben Zellen pro Milliliter Leader.

Verwenden Sie das FMO-Röhrchen, um den Schwellenwert für die Sortierung von CD 25-positiven T-Zellen einzustellen. Unter Verwendung dieser Gating-Strategie legen Sie zunächst einen Gang um die fite-negativen Zellen fest, um die fitz-positiven Zellen auszuschließen, die Monozyten, Makrophagen und alle anderen vier CD-positiven Nicht-T-Zellen umfassen, wie in dieser Abbildung gezeigt. Zeichnen Sie in einem separaten Diagramm die Gangarten für CD 25 negative und CD 25 niedrige T-Zellen und CD 25 hohe Treg-Zellen wie in dieser Abbildung.

Sortieren Sie nach dem Durchfluss die Zelluntergruppen, pelletieren Sie die Sammelröhrchen und halten Sie die T-Zelle bis zur Beschichtung auf Eis. Beschriften Sie eine 96-Well-Platte mit U-Boden wie in der Tabelle gezeigt. Suspendieren Sie ein 50-Mikroliter-Aliquot von CD mit drei beschichteten Kügelchen, berechnet auf eine Konzentration von drei Kügelchen pro Responderzelle pro Well, in vollständigen Medien mit 10 % gepooltem humanem AB-Serum in der 96-Well-Platte, und verdünnen Sie dann die zuvor bestrahlten APCs in Medien auf eine Konzentration von fünfmal 10 bis fünften Zellen pro Milliliter.

Geben Sie 50 Mikroliter der Zellen in die 96-Well-Platte und fügen Sie dann 2,5 mal 10 zu den vier CDs vier positiven CD 25 negativen oder vier positiven CD 25 niedrigen T-Zellen pro Vertiefung in dreifacher Ausfertigung hinzu Treter zu Reihe B und zu den Vertiefungen, die nur als Treg der Co-Kultur gekennzeichnet sind, in einem Verhältnis von eins zu 10, wie hier gezeigt. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator mit 5 % CO2 bei gesättigter Luftfeuchtigkeit für 72 Stunden. Als nächstes pulsieren Sie die Zellen mit einem Mikro-Curie tritiiertem Thymidin und setzen Sie die Inkubation bei 37 Grad Celsius für die nächsten 16 Stunden fort, nachdem das Thymidin in den letzten Stunden der Co-Kultur eingebaut wurde.

Verwenden Sie einen Filter-Mate-Harvester, um die Zellen auf einer Ernteplatte mit mehreren Sieben zu ernten. Decken Sie dann die Ernteplatte mit einer transparenten Kunststoffabdeckung ab, die zuvor mit einer Szintillationsflüssigkeit gefüllt wurde. Lesen Sie schließlich den CPM pro Well ab.

Unter Verwendung eines Szintillationszählers können T-Zell-Untergruppen durch dieses System auf eine hohe Reinheit isoliert werden, wie in der folgenden Reihe von Punktdiagrammen zu sehen ist: CD vier positive CD 25 negative T-Zellen sind hier im unteren Gate dargestellt. In der nächsten Abbildung sind hochgereinigte CD vier positive CD 25 niedrige T-Zellen zu sehen. Eine reine Population von strömungssortierten CD vier positiv.

CD 25 High-Treg-Zellen sind in der Top-Gate-Steuerung zu sehen. Einzelzellkulturen von APCs und Tregs von gesunden Probanden zeigten wenig bis gar keine Proliferation über den Hintergrund, gemessen durch Thymidin-Inkorporation, während naive CD 25-negative und in vivo aktivierte CD 25 niedrige T-Zellen eine ausgeprägte Proliferation zeigten, die unterdrückt wird, wenn diese Responder-Zelltypen mit Treg-Zellen kokultiviert werden. Obwohl geringfügige Unterschiede in der Fähigkeit von Tregs zur Unterdrückung von Responder-naiven CD 25-negativen und in vivo aktivierten CD 25-niedrigen T-Zellen beobachtet wurden.

Es war keine signifikante Kontrolle. Einzelzellkulturen von APCs und Tregs von Risikoprobanden zeigten wenig bis gar keine Proliferation über den Hintergrund, gemessen durch Thymidin-Inkorporation. Während naive CD 25-negative und InVivo-aktivierte CD 25-Zellen mit niedrigem T-Gehalt im Vergleich zu gesunden Kontrollen eine geringere Proliferation aufwiesen.

Die Responder-T-Zellen wurden durch Treg- und Co-Kulturen weiter unterdrückt, da der Assay zuverlässige Ergebnisse liefert. Darüber hinaus können wir daraus schließen, dass niedrige CPM-Werte auf mögliche Defekte in der Signaltransduktion hindeuten, die in einer anderen Art von Studie weiter untersucht werden sollten. Der Unterschied in der Fähigkeit von Treg, CD-25-negative und CD 25-Low-Responder-T-Zellen bei Risikopersonen zu unterdrücken, war jedoch signifikant.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie alle notwendigen Schritte für einen erfolgreichen und zuverlässigen Funktionstest auf das Vorhandensein von Tregs bei gesunden Probanden und Probanden mit geschwächtem Immunsystem reibungslos miteinander verbinden können. Zum Beispiel bei Probanden mit Typ-1-Diabetes.