Name: Ein Maus-Modell der Cornea Pocket-Assay für die Angiogenese-Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Lernen Sie den Cornea-Pocket-Assay bei Mäusen zur Untersuchung der Angiogenese durch basic FGF. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Blutgefäßneubildung von den Limbusgefäßen aus.

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Unsere Forschung wird durch die Interne Research Program des NIH, National Eye Institute unterstützt.

Alle Geräte und Reagenzien sind steril. Das Protokoll wurde von der Animal Care genehmigt und Verwenden Committee (ACUC) an der NEI / NIH (Tier Studienprotokoll NEI-553), und wurde nach den NIH-Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. 1. Die Herstellung der angiogenen Faktor-haltigen Pellets In diesem Teil werden die Pellets mit dem angiogenen Faktor des Interesses vorbereitet. <ol><li> Machen Sie 10% (w / v) Sucralfat Lösung mit PBS. Shop unter Raumtemperatur. </li><li> Machen Sie 12% (w / v) Poly-HEMA mit absolutem Ethanol. Shop unter Raumtemperatur. </li><li> Machen Sie 1 ug / ul bFGF-Lösung. Shop in -80 ° C. </li><li> Um machen 50 Pellets, mix 5 ul der Poly-HEMA, 1μl von Sucralfat und 4 ul bFGF Stammlösung, gründlich vortexen. </li><li> Legen Sie ein Stück sauberer Parafilm in einer Petri-Schale, setzen Sie es unter UV-Licht für 15 min in einer Gewebekultur Kapuze. Drop 0,2 ul der Lösung Mischung auf dem Parafilm für ein Pellet. So sollten 10 ul der Lösung Mischung Ausbeute 50 Pellets. Lassen Sie die Pellets trocken und bei Raumtemperatur für 1-2 Stunden. Die getrockneten Pellets können in 4 ° C mehrere Tage oder -80 ° C für mehrere Monate gelagert werden. </li><li> Nach Gebrauch, hebeln und holen die Pellets mit den Spitzen einer Pinzette. Seien Sie besonders vorsichtig, sie nicht zu brechen oder machen sie Frühjahr entfernt. </li></ol> 2. Durchführen der Maus Hornhaut Tasche Test In diesem Teil werden wir demonstrieren, wie man eine Tasche in der Maus Hornhaut zu machen, und wie man ein Pellet in die Tasche legen. Die angiogenen Faktor im Pellet wird nach und nach in die Umgebung der Hornhaut (Abb. 1) freigesetzt werden. In dieser Demonstration verwenden wir 8-wöchigen weiblichen C57/BL6-Mäusen. <ol><li> Die Maus ist sehr systematisch betäubt mit der Mischung aus Ketamin (75 mg / kg) und Xylazin (5mg/kg, ip-Injektion). Dies wird mit der Maus unter Narkose Zustand zu halten für 30-60 min. Lokalanästhetikum (0,5% Proparacain HCl) ist die Hornhaut aufgetragen. Nach 5 min, fix ein Auge unter einem Binokular. </li><li> Eine sehr sanfte Schnitt ist in der Mitte der Hornhaut 1,2 -1,4 mm vom Limbus corneae (wie in Abbildung 1 dargestellt) mit einem von Graefe Staarmesser gemacht. Seien Sie besonders vorsichtig, um nicht durch die Hornhaut geschnitten. </li><li> Eine Tasche ist unter dem Epithel der Hornhaut durch horizontal Einsetzen des Messers in die Mitte der Hornhaut und zur Verlängerung der Messer gegen den Limbus sorgfältig (Abb. 1) hergestellt. Die Größe der Tasche hat, um groß genug sein, zu einer angiogenen Faktor-haltigen Pellets unterzubringen. Seien Sie äußerst vorsichtig, um die Punktion durch die Hornhaut. </li><li> Legen Sie eine Tablette mit einer Pinzette in die Tasche langsam. Versuchen Sie, das Pellet so flach wie möglich zu machen. </li><li> Nach der Implantation des Pellets, ist eine topische ophthalmologische antibiotische Salbe auf das Auge angewendet. Die Geräte sind mit 70% Alkohol-Pads zwischen Tieren vernichtet. </li><li> Bewegen Sie die Maus an einen warmen und trockenen Ort und überwachen sie, bis sie in der Lage, eine aufrechte Haltung zu bewahren und dann wieder in seine Heimat Käfig ist. Systemische Analgetika (z. B. Buprenorphin, 2 mg / kg, ip-Injektion) und topische Antibiotika-Salbe (zB Gentamicin) werden zweimal täglich für 2 Tage nach der Operation gegeben und die Maus ist eng für 3 Tage überwacht. Healing wird voraussichtlich innerhalb der ersten 48 Stunden nach der Operation abgeschlossen ist. Das Auge mit der Tasche unter einer Spaltlampe BioMicro Umfang zwischen den Tagen 4-10 nach Pellet-Implantation untersucht werden. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse <ol><li> Sieben Tage nach der Pellet-Implantation, wird die Maus narkotisiert systemisch und topisch, wie in 2.1 beschrieben. </li><li> Beachten Sie die Blutgefäße in der Hornhaut von der angiogenen Faktor unter einem Binokular induziert. In der Hornhaut mit Vehikel behandelt, kann kein Wachstum von Blutgefäßen beobachtet (Abb. 2A, Vehikel-behandelten Hornhaut) werden. In der Hornhaut mit bFGF behandelt wird, kann robust Angiogenese beobachtet (Abb. 2B). Das Wachstum von Blutgefäßen, kann unter Verwendung der maximalen Länge der Blutgefäße (von der normalen Limbus Schiffe an die Spitze der neuen Schiffe), und die gesamte Blutgefäß Bereiche (Abb. 2B, abgegrenzt mit einem roten gestrichelten Linie in der bFGF werden Hornhaut)-behandelt. Andere Quantifizierungsmethoden wurden ebenfalls 2,5 beschrieben. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3077/3077fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. A. Normale Hornhaut mit H &amp; E Färbung. Kein Blutgefäß besteht in einer normalen Hornhaut. B. Machen Sie eine Tasche unter dem Epithel der Hornhaut. C. Embed ein Pellet in die Tasche. D. Die angiogenen Faktor ist aus dem Pellet freigesetzt und neue Blutgefäße wachsen von der normalen Limbus Schiffe. <img src="/files/ftp_upload/3077/3077fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Repräsentatives Ergebnis fünf Tage nach imPlantage des Pellets. A. Cornea mit einem Pellet das Fahrzeug nur. Keine Bildung neuer Blutgefässe in der Hornhaut. Nur die bereits vorhandenen normalen Limbus Schiffe zu sehen sind. B. Cornea mit einem Pellet bFGF. Robust neuer Blutgefäße (dot gesäumten) wuchs von den bereits bestehenden normalen Limbus Schiffe.

<ol><li>Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+angiogenic+activity+and+hypoxia+induction+of+heterodimers+of+placenta+growth+factor%2Fvascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor.</a> The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).</li>
<li>Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cornea+micropocket+angiogenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mouse cornea micropocket angiogenesis assay.</a> Nature. 2, 2545-2550 (2007).</li>
<li>Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cornea+as+a+transplantation+site+for+live+imaging+of+engineered+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-B+is+dispensable+for+blood+vessel+growth+but+critical+for+their+survival%2C+and+VEGF-B+targeting+inhibits+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).</li>
<li>Tong, S., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+response+of+angiogenesis+to+basic+fibroblast+growth+factor+in+rat+corneal+pocket+assay%3A+I.+Experimental+characterizations%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations.</a> Microvascular research. 75, 10-15 (2008).</li>
<li>Muthukkaruppan, V., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+mouse+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the mouse cornea.</a> Science. 205, 1416-1418 (1979).</li>
<li>Ziche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+assay+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Corneal assay for angiogenesis.</a> Methods in molecular medicine. 46, 131-142 (2001).</li>
<li>Ziche, M., Morbidelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+pocket+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">The corneal pocket assay.</a> Methods in molecular biology. 467, 319-329 (2009).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Maus Hornhaut Tasche Test-Modell wurde erstmals 1979 von Muthukkaruppan VR und Auerbach R 6 beschrieben. Detaillierte Protokolle wurden von verschiedenen Labors 2,3,7,8 veröffentlicht worden. Unser Labor hat modifiziert und verwendet diese Methode in unsere Studien seit vielen Jahren 4. Die Maus Hornhaut pocket-Assay ist ein relativ einfaches Modell mit großer Reproduzierbarkeit. Ein weiterer Vorteil dieses Modells ist, dass da die Hornhaut in der Regel fehlt Blutgefäße, gibt es mini...

<table border="1"><tbody><tr><th> Ausstattung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Präpariermikroskop </td><td> World Precision Instruments </td><td> PZMIV-BS </td></tr><tr><td> Von Graefe Staarmesser (1.5x25mm Klinge, flach) </td><td> Ambler Surgical </td><td> 3401E </td></tr><tr><td> Dumont Nr. 5 Zangen </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11252-50 </td></tr><tr><td> Spaltlampe </td><td> Zeiss </td><td> 30 SL-M </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Ausrüstungen <table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Firma </th><th> Catalog # </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> bFGF (basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor) </td><td> PeproTech INC </td><td> 100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Sucralfat (Saccharose octasulfate-Aluminium-Komplex) </td><td> Sigma </td><td> S0652 </td><td> 10% in PBS </td></tr><tr><td> Poly-HEMA (Poly (2-Hydroxyethylmethacrylat)) </td><td> Sigma </td><td> P3932 </td><td> 12% in Ethanol </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Reagenzien und Materialien

ein maus-modell der cornea pocket-assay für die angiogenese-studie

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

Eine normale Hornhaut ist klar, der vaskulären Gewebe. Allerdings kann die Blutgefäße induziert, zu wachsen und in der Hornhaut, wenn potente angiogene Faktoren 1 verabreicht werden überleben. Diese Einzigartigkeit hat die Hornhaut Tasche Assay eine der am häufigsten verwendeten Modelle zur Angiogenese-Studien. Die Hornhaut komponiert mehrere Schichten von Zellen. Es ist daher möglich, ein Pellet mit der angiogenen Faktor des Interesses an der Hornhaut, um seine angiogene Wirkung 2,3 untersuchen einbinden. Hier bieten wir Ihnen eine Schritt für Schritt Demonstration, wie man (I) produzieren die angiogenen Faktor-haltige Pellet (II) betten die Pellets in die Hornhaut (III) eine Analyse der Angiogenese durch den angiogenen Faktor von Interesse induziert. Da die basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) als einer der stärksten angiogenen Faktoren 4 bekannt ist, ist es hier, die Angiogenese in der Hornhaut zu induzieren.

Die Hornhaut ist einzigartig, es fehlt Gefäßgewebe. Allerdings kann robuste Wachstum der Blutgefäße und das Überleben in der Hornhaut durch potente angiogenen Faktoren ausgelöst werden. Daher kann die Hornhaut mit uns ein wertvolles Instrument für die angiogenen Studien. Dieses Protokoll zeigt, wie die Maus-Modell der Hornhaut Tasche Test und wie die Angiogenese durch angiogene Faktoren mit diesem Modell induziert Beurteilung durchzuführen.

Ein Maus-Modell der Cornea Pocket-Assay für die Angiogenese-Studie

Eine normale Hornhaut ist frei von vaskulärem Gewebe. Blutgefäße können jedoch in der Hornhaut induziert werden und dort überleben, wenn potente angiogene Faktoren ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe des Maus-Kornea-Taschen-Assay-Modells die angiogenetische Wirkung von basischem FGF zu testen. Dies wird erreicht, indem eine Tasche in der Maus-Kornea angelegt und ein Pellet mit basischem FGF in die Tasche eingebracht wird. Das basische FGF wird anschließend aus dem Pellet freigesetzt und induziert das Wachstum neuer Blutgefäße ausgehend von den limbalen Gefäßen.Schließlich kann dieses Protokoll ein robustes neues Wachstum von Blutgefäßen ausgehend von den limbalen Gefäßen in Richtung des basischen FGF-Pellets hervorrufen. Hallo, ich bin Shuan aus dem Dr. Shiley-Labor am National Institute INIH. Der Hauptvorteil dieses Modells liegt darin, dass es ein relativ einfaches Modell mit hoher Reproduzierbarkeit darstellt.Ein weiterer Vorteil ist, dass die normale Hornhaut keine Blutgefäße enthält, wodurch der Hintergrund sehr gering ist. Nun haben wir die allgemeine Vorstellung des Modells. Ich zeige Ihnen Schritt für Schritt, wie man die Hornhauterkrankung erzeugt.Beginnen wir nun. Zur Vorbereitung dieses Verfahrens bereiten Sie die folgenden Lösungen vor: 10 % Gewicht pro Volumen Sate und PBS, 12 % Gewicht pro Volumen Polyhema und Ethanol sowie 1 Gramm pro Mikroliter basisches FGF. Das basische FGF muss bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden, die anderen beiden Lösungen können jedoch bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.Um 50 angiogenetische Faktor-Pellets herzustellen, mischen Sie fünf µL Poly-hema-Lösung, ein µL Sate-Lösung und vier µL basische FGF-Lösung in einer 200-µL-PCR-Röhrchen und wirbeln Sie das Gemisch gründlich. Geben Sie nun einen Abschnitt Parfum in eine Petrischale und geben Sie 0,2-µL-Tropfen des Gemischs auf das Parfum ab.Jeder Tropfen trocknet zu einem Pellet. Lassen Sie die Pellets bei Raumtemperatur ein bis zwei Stunden trocknen. Die getrockneten Pellets können mehrere Tage bei vier Grad Celsius oder mehrere Monate bei minus 80 Grad Celsius aufbewahrt werden.Um die Pellets zu verwenden, heben Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette aus der Verpackung, und achten Sie darauf, dass sie nicht zerbrechen oder wegspringen. Nach der Anästhesie einer Maus mit einem Gemisch aus Ketamin und Xylazin geben Sie mit einer Pipette 50 Mikroliter einer 0,5%igen Procainhydrochloridlösung auf die Hornhaut. Warten Sie fünf Minuten, und positionieren Sie dann die Maus unter einem Stereomikroskop, sodass sich ein Auge direkt unter dem Objektiv befindet.Verwenden Sie ein steriles von-Gräfe-Kataraktmesser, um einen sehr vorsichtigen Schnitt in der Mitte der Hornhaut etwa 1,2 bis 1,4 Millimeter vom Hornhautlimbus entfernt anzulegen. Achten Sie sorgfältig darauf, die Hornhaut nicht vollständig zu durchtrennen. Erstellen Sie nun durch horizontales Einführen des Messers in den Schnitt und vorsichtiges Vorwärtsschieben des Messers eine Tasche unter der epithelialen Schicht der Hornhaut.Machen Sie die Tasche groß genug, um einen Pellet mit basischem FGF aufzunehmen. Achten Sie erneut sorgfältig darauf, die Hornhaut nicht zu verletzen. Legen Sie den Pellet auf die Hornhaut und falten Sie ihn zweimal.Unter Verwendung einer Pinzette wird das Pellet langsam in die Tasche eingebracht und anschließend mithilfe der Pinzette so gut wie möglich abgeflacht. Zum Abschluss des Vorgangs wird die gesamte Augenoberfläche mit einem Applikator mit Augenspitze bedeckt. Anschließend wird eine topische antibiotische Augensalbe aufgetragen und die Maus in einen warmen und trockenen Bereich verbracht. Wenn die Maus in der Lage ist, eine aufrechte Körperhaltung beizubehalten, wird sie zweimal täglich während der Erholungsphase in ihren Heimkäfig zurückgebracht.Systemische Analgetika wie Buprenorphin und topische antibiotische Salbe auf das Auge zwischen vier und 10 Tagen nach der Pellet-Implantation auftragen, die Maus anästhesieren und das Auge untersuchen. Unter dem Spaltlampe und Biomi­kroskop wurden Blutgefäße in der Hornhaut, die durch den angiogenen Faktor induziert wurden, am Stereomikroskop beobachtet und eine Hornhaut, die nur mit einem Fahrzeugmittel behandelt wurde, untersucht. Kein Blutgefäßwachstum wurde in einer Hornhaut beobachtet, die mit basischem FGF behandelt wurde, was auf Angiogenese hinweist.Das Wachstum neuer Blutgefäße war kräftig. Das Blutgefäße-Wachstum wurde bewertet, indem die maximale Länge zwischen den normalen limbischen Gefäßen und der Spitze der neuen Gefäße gemessen wurde. Ebenso wurde auch die gesamte Blutgefäße-Fläche gemessen.Sie sehen, dies ist ein relativ einfacher Eingriff. Einmal beherrscht, kann er innerhalb von fünf Minuten pro Auge durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist besondere Vorsicht erforderlich, insbesondere beim Erstellen der Tasche und beim Einbringen des Pads in die Tasche.Das Messer muss präzise gehandhabt werden, damit die Hornhaut nicht verletzt wird. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit. Viel Erfolg.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Normalen Erwachsenen vaskularisierten Säugetiergewebe, dass physiologische Angiogenese fehlt und die nicht zur chirurgischen Intervention wird verwendet, um Studie ausgesetzt worden: (i) die Initiierung und Entwicklung der Angiogenese nach intraperitonealer Verabreichung von Test-Agenten, und (ii) die Veränderung der Angiogenese nach systemischer Gabe von ausgewählten Test-Agenten.

Rat Mesenterium Angiogenese Assay

Dieses Video zeigt die Entwicklung eines ex vivo-Modells der Aderhautkeimung zur Untersuchung der okulären mikrovaskulären Angiogenese. Der Assay umfasst die Kultivierung von Mausaugen-Explantaten, die das Aderhautgewebe enthalten, das an der Sklera und dem retinalen Pigmentepithel befestigt ist, unter bestimmten Bedingungen, die das keimende choroidale mikrovaskuläre Keimen fördern.

Aderhaut-Keimungs-Assay zur Ex-vivo-Untersuchung der okulären mikrovaskulären Proliferation

Neovaskularisation (NV) der Hornhaut können mehrere optische Pathologien erschweren. Mit Hilfe eines kontrollierten, alkali Verbrennungen Modell kann ein quantifizierbarer Höhe der Hornhaut NV für mechanistische Studie der Hornhaut NV und Bewertung von möglichen Therapien für neovaskulären Erkrankungen hergestellt werden.

Eine Alkali-brennen Verletzungsmodell der Hornhaut Neovaskularisation bei der Maus

Das Protokoll beschreibt die Hornhaut-Mikrotaschen-Assay in Mäusen entwickelt.

Die Hornhaut-Mikrotest: Ein Modell der Angiogenese bei der Maus Augen

Hier präsentieren wir das Maus-Laser-induzierte choroidale Neovaskularisation (CNV) Protokoll, ein experimentelles Modell, das die vaskulären Kennzeichen der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration (AMD) nachbildet. Einmal gemeistert, kann es zuverlässig und effektiv CNV als Modellsystem induzieren, um verschiedene experimentelle Maßnahmen zu testen.

Ein Mausmodell für Laser-induzierten CNV

Iris Neovaskularisation, eine häufige Komplikation der ischämischen Netzhauterkrankung kann zu Anblick-bedrohlichen neovaskulären Glaukoms führen. Hier beschreiben wir eine murinen Protokoll zur Induktion experimentelle Iris Neovaskularisation, die für nicht-invasive Beurteilung der Angiogenese-modulierender Substanzen verwendet werden kann.

Punktion-induzierte Iris Neovaskularisation als einem Mausmodell der Rubeosis Iridis

Hier stellen wir ein Protokoll zur Ablösung von hornhauten Endothelzellen (CEC) von Descemets Membran (DM) unter Verwendung eines Neodym:YAG (Nd:YAG) Lasers als Ex-vivo-Krankheitsmodell für bullöse Keratopathie (BK) vor.

Entwicklung eines nichtinvasiven, laserunterstützten Versuchsmodells des cornealen Endotheliaalzellverlustes

Dieses Protokoll stellt einen Aderhautkeim-Assay dar, ein Ex-vivo-Modell der mikrovaskulären Proliferation. Dieser Test kann verwendet werden, um Wege zu bewerten, die an sich vermehrenden aderatorischen Mikrogefäßen beteiligt sind, und medikamentöse Behandlungen mit Wildtyp und genetisch verändertem Mausgewebe zu bewerten.

Ein Ex Vivo Choroid Sprouting Assay der ocular Microvascular Angiogenese

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