Name: Langfristige Culture of Human Breast Cancer Proben und deren Analyse mit Hilfe von optischen Projektion Tomography (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Lernen Sie die Langzeitkultur primärer Brustkrebsgewebe und deren dreidimensionale Analyse mittels optischer Projektionstomographie. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Tumorinvasion und individuellen Arzneimittelreaktionen.

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Wir danken Lorna Renshaw (Edinburgh Breast Unit) für ihre unschätzbare Hilfe bei der Beschaffung von klinischen Proben. Verwendung von Tumormaterial wurde von der Lothian Research Ethics Committee (08/S1101/41) zugelassen und erhältlich unter der Schirmherrschaft des Experimental Cancer Medicine Centre Programm (Edinburgh). Diese Arbeit wird von der Scottish Funding Council unterstützt. ADL ist eine Miss Margaret Butters Reekie Vertrauen klinischen Kollegen.

1. Extrahieren von Collagen aus Rattenschwänzen <ol><li> Legen Sie gefrorenes Frischplasma Rattenschwänzen in 70% Ethanol. </li><li> Deglove die darüber liegende Haut mit einem Skalpell auszusetzen Sehnen. </li><li> Streifen Sehnen weg vom Schwanz und in 70% Ethanol zu sterilisieren. </li><li> Wiegen Sie die gesammelten Sehnen und Transfer zu Essigsäure (1g Sehne 250ml 0,5 M Essigsäure). Mix für 48hr bei 4 ° C. </li><li> Centrifuge die Sehne / Essigsäure-Mix bei 10.000 g für 30min und entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Fügen Sie dem gleichen Volumen 10% (w / v) NaCl, um den Überstand und lassen Sie die Mischung über Nacht stehen bei 4 ° C. </li><li> Sammeln Sie die Kollagen-reich, unlöslich Bodenschicht und Zentrifugat für weitere 30 Minuten bei 10.000 g. </li><li> Resuspendieren Kollagen-reiches Material in 0,25 M Essigsäure bei 4 ° C und Dialyse gegen 1:1000 Essigsäure bei 4 ° C für 3 Tage, Wechsel der Dialyse-Puffer zweimal täglich. </li><li> Weitere sterilisieren Kollagenlösung durch Zentrifugation (20.000 g für 2 Std.) und lagern bei 4 ° C. </li><li> Verdünnen Kollagen mit der Zugabe von sterilem 1:1000 Essigsäure auf einen Bestand Konzentration von 1mg/ml erforderlich. </li></ol> 2. 3D-Assay Creation Die 3D-Test auf eine Zelllinie Assay basiert, veröffentlicht bisher 2. <ol><li> Mehrere Stanzbiopsien aus zustimmenden Patienten zum Zeitpunkt der kurativen Resektion für invasiven Brustkrebs geerntet. </li><li> Mit Auge, teilen sich die Kerne mit einem Skalpell in 1mm 3 Fragmente. Trim und entsorgen makroskopisch deutlich Fett. </li><li> Tauchen Sie die Fragmente in MEGM Komplett Media. Das Gewebe kann in diesem Zustand gelagert werden bis zu 1 Stunde. </li><li> Zum Erstellen der Kollagen-Gel, auf Eis 1mg/ml Rattenschwanz Collagen, bis 1:1000 gefiltert Essigsäure, 10x DMEM/F12 und 0,22 M NaOH in einem Verhältnis von 3:5:1:1 erstellen eine abschließende Kollagen-Konzentration von 0,3 mg / ml. </li><li> Inject 1.2ml von Kollagen-Gemisch in die einzelnen Wells einer 24-Well-Platte aufnehmen und in einem Brutschrank bei 37 ° C für 10 Minuten, um ein Gelieren zu initiieren. </li><li> Nach 10min, entfernen Sie den 24-Well-Platte aus dem Inkubator. Ort des Tumors Stücke auf die Gelier-Kollagen und schieben sie in die Mitte des Gels mit einem 10 &amp;mgr; l Pipettenspitze. Gibt die 24-Well-Platte in den Inkubator für 1 Stunde. </li><li> Für ER + Tumore, zu ergänzen MEGM komplette Medien mit β-Östradiol zu einer Konzentration von 3.2x10 -10 M. Nachdem das Gel Assays für 1 Stunde haben geliert, sorgfältig einführen 1.2ml der ergänzten Medien in jedes Well. Die endgültige β-Östradiol-Konzentration im Assay wird 1.6x10 -10 M equilibriate auf physiologische Östrogenspiegel im Brustgewebe 3 gefunden zu rekapitulieren. </li><li> Führen Sie einen 10 &amp;mgr; l Pipettenspitze um den inneren Rand jeder gut, die Freigabe jedes Gel Umfang, so dass jedes Gel frei schweben in den Medien. Gibt die 24-Well-Platte in den Inkubator. </li><li> Börse ergänzt Medien zweimal wöchentlich bis zur Beendigung des Experiments. Beenden Sie den Versuch durch Entfernen von Medien und das Hinzufügen einer Formalin Fixativ. </li></ol> 3. Antikörper-Färbung von Assay in Vorbereitung für Optical Projection Tomographie Wir haben eine zuvor veröffentlichte Methode zur gesamten Stichprobe Färbung 4 angenommen. <ol><li> Wash Formalin fixierten Proben für 30min in PBS. Entwässern der Gele schrittweise in Methanol in PBS mit 0,05% Tween 20 (0,05% PBST) verdünnt: 33%, 66% und 100% für ≥ 15min bei jedem Schritt. </li><li> Inkubieren des Gewebes in frisch zubereiteten MeOH: DMSO: 30% H 2 O 2 in einem Verhältnis von 02.01.03 (15% v / v H 2 O 2) bei Raumtemperatur für 24 Stunden auf die Autofluoreszenz zu stillen. </li><li> Wash-Proben zweimal für 30 Minuten in Methanol. Einfrieren der Proben bis -80 ° C fünf Mal für mindestens 1 Stunde jedes Mal und wieder auf Raumtemperatur (RT) auf, die Antigene in den tieferen Teilen des Gewebes gewährleistet werden zugänglich gemacht. </li><li> Rehydrieren das Gewebe wieder auf 0,05% PBST mit Methanol als Verdünnungsmittel (33%, 66% und 100% für 15 Minuten bei jedem Schritt). </li><li> Block des Gewebes in Blocking-Lösung (10% Serum in 0,05% PBST) für 24 Stunden. </li><li> Inkubieren des Gewebes mit primärer Antikörper gegen das epitheliale Inhalt zu identifizieren, mit Kaninchen-Anti-Cytokeratin in einer Konzentration von 1:500 in 1,5 ml der Sperrung Lösung mit 5% DMSO für 48hr verdünnt. </li><li> Wash Proben viermal mit 0,05% PBST 30 min je. </li><li> Inkubieren des Gewebes mit fluoreszierenden sekundären Antikörper (1:100 Ziege Anti-Kaninchen-Alexa555), in 1,5 ml Blocking-Lösung mit 5% DMSO für 48hr verdünnt. </li><li> Waschen Sie die Proben wieder mit 0,05% PBST viermal für jeweils 30 Minuten. </li></ol> 4. Optical Projection Tomographie Optische Projektions-Tomographie ist ein Mikroskopie-Technik bereits entwickelt, um hochauflösende 3D-Bilder von fluoreszierenden biologischen Proben mit einer Dicke von bis zu 15 Millimeter 5 zu erzeugen. <ol><li> Montieren Sie die stained Gel in 1% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt und entwässern in 100% Methanol für 24 Stunden. Deaktivieren Sie die Probe in BABB Lösung (1:2 Benzylalkohol, Benzylbenzoat) für 48hr und scannen mit dem OPT 3001M Scanner (Bioptonics). </li><li> Sowohl Ziel-und Autofluoreszenz erfasst mit dem Cy3-Filtersatz (Erreger 545nm/30 nm, Emitter 610/75 nm) und GFP1 Filter-Set (Erreger 425nm/40 nm, Emitter LP475 nm) bzw.. </li></ol> 5. Wiederaufbau-und 3D-Quantifizierung <ol><li> Der Satz von eckigen Projektionen OPT erworbene rekonstruiert mit NRecon Software (SkyScan) zu einer Reihe von Querschnitt schneidet durch die Invasion Assay zu erzeugen. Diese Software ist für Sie kostenlos bei Download <a href="http://www.skyscan.be/products/downloads.htm">http://www.skyscan.be/products/downloads.htm</a> . </li><li> Analyse der rekonstruierten Daten mit Volocity Software (PerkinElmer). Kostenlose Demo-Software ist zum Download verfügbar unter <a href="http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/">http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/</a> . </li><li> Um epithelialen Volumen von Zytokeratin-Färbung zu quantifizieren, stellen ein Minimum Voxel Intensität Schwelle für Störungen durch Hintergrundfluoreszenz in der Ziel-Kanal zu reduzieren. Wir definierten diese Schwelle empirisch bei 9000 au Mit einer Liste der verfügbaren Parameter in der Messaufgabe, wir das Volumen des Epithels in Kontinuität mit dem ursprünglichen Kern (abgegrenzt im autofluoreszierenden Kanal) quantifiziert. Dies erlaubt uns zu einem Volumen von epithelialen Auswuchs zwischen verschiedenen quantifizieren Tumorproben. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Bei der Entwicklung des Tests, Biopsie insgesamt 52 Brustkrebs Proben mit einer breiten Palette von Histopathologie verwendet wurden. Von diesen &lt;10% (5 / 52) nicht mindestens eine tragfähige Invasion Assay liefern. Assay Misserfolg war entweder aufgrund bakterieller supra-Infektion oder unzureichende Tumor Biopsie-Material. Deshalb Anwendung des Tests ist nicht an einen bestimmten Subtyp von Brustkrebs beschränkt. Typische Assays (Abbildung 1) nach 20 Tagen in Kollagen Kultur fixiert und anschließend für Cytokeratin gefärbt. Volocity Software ist in der Lage, sowohl die epithelialen Masse kontinuierlich mit dem ursprünglichen Kern und freistehende Gruppen von eindringenden Zellen zu erkennen und zu quantifizieren, jedes Volume separat. <img src="/files/ftp_upload/3085/3085fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Invasion Assays folgende Fixierung und Quantifizierung. Der Test unterstützt Proben aus verschiedenen Brustkrebs-Subtypen erhalten: a) ER + b) HER2 + und c) ER-.

<ol><li>Lopez-Garcia, M. A., Geyer, F. C., Lacroix-Triki, M., Marchio, C., Reis-Filho, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+precursors+revisited%3A+molecular+features+and+progression+pathways.+Histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Breast cancer precursors revisited: molecular features and progression pathways. Histopathology.</a> 57, 171-192 (2010).</li>
<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J Cell Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
<li>Dabrosin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+extracellular+local+levels+of+estradiol+in+normal+breast+in+vivo+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Increased extracellular local levels of estradiol in normal breast in vivo during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> J Endocrinol. 187, 103-108 (2005).</li>
<li>Alanentalo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat Methods. 4, 31-33 (2007).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Hidalgo-Carcedo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+requires+suppression+of+actomyosin+at+cell-cell+contacts+mediated+by+DDR1+and+the+cell+polarity+regulators+Par3+and+Par6%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration requires suppression of actomyosin at cell-cell contacts mediated by DDR1 and the cell polarity regulators Par3 and Par6.</a> Nat Cell Biol. 13, 49-58 (2011).</li>
<li>Katz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+on+the+HER2+amplicon%2C+C35%2C+is+an+oncogene+in+breast+cancer+whose+actions+are+prevented+by+inhibition+of+Syk%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A gene on the HER2 amplicon, C35, is an oncogene in breast cancer whose actions are prevented by inhibition of Syk.</a> Br J Cancer. 103, 401-410 (2010).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
</ol>

SEW und JF von MRC-Technologie, welche die Kommerzialisierung Bioptonics OPT-Scanner eingesetzt wird. Andere Autoren erklären, keinen Interessenkonflikt.

Collagen-basierte Assays, um das Verhalten von Krebszelllinien Studie sind jetzt weit 6,7,8 verwendet. Dennoch haben diese Tests nicht in vollem Umfang die Komplexität des Tumors und seiner Umgebung wider. In dieser Studie zeigen wir, dass menschliche Brustkrebszellen Materialien in ähnlicher Weise, ex vivo eingesetzt werden kann. Darüber hinaus ist OPT ein nützliches Werkzeug, um die 3D-Erweiterung von Brustkrebs zu charakterisieren. Wir fanden, dass die wichtigste Einschränkung dieser Technik die Verfügbarkeit von Tumor-Materialien (a Single-Core-Biopsie ist ausreichend für 4-6 Assays) ist. Ein weiterer limitierender Faktor ist, dass strukturelle Invasion tritt nur in etwa 40% des Assays. Um dies zu überwinden, wir regelmäßig add beliebige Behandlung um Tag 7, um alle Tests mit sichtbarem Wachstum. Der Einsatz von OPT könnte in der Zukunft erweitert werden, um auch erkennen, Bulk-Änderungen, ex vivo, die sich aus medikamentöser Behandlung. Dies wiederum könnte zu erleichtern stärker individualisierten Krebstherapie, unabhängig von Tiermodellen. Wir prüfen derzeit die Antwort der ER + Tumore auf Tamoxifen ex vivo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog Nr. </td></tr><tr><td> MEGM Komplette </td><td> Lonza </td><td> CC-3150 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8900 10X1L </td></tr><tr><td> β-Östradiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E8875-250MG </td></tr><tr><td> Rabbit anti-Cytokeratin </td><td> Dako </td><td> Z0622 </td></tr><tr><td> Ziege Anti-Kaninchen-Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr></tbody></table> Alle anderen Standard-Reagenzien wurden von Sigma-Aldrich bezogen.

langfristige culture of human breast cancer proben und deren analyse mit hilfe von optischen projektion tomography

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Brustkrebs ist eine der Hauptursachen für die Sterblichkeit in der westlichen Welt. Es ist bekannt, dass die Ausbreitung von Brustkrebs, zunächst lokal und dann distal, ist ein wichtiger Faktor in die Prognose der Patienten. Experimental-Systeme von Brustkrebs vertrauen auf Zell-Linien in der Regel von Primärtumoren oder Pleuraergüsse abgeleitet. Zwei große Hindernisse stehen dieser Forschung: (i) einige bekannte Sub-Typen von Brustkrebs (vor allem schlechte Prognose luminalen B Tumoren) nicht innerhalb der aktuellen Zeile Sammlungen vertreten; (ii) den Einfluss der Tumor-Mikroumgebung in der Regel nicht berücksichtigt. Wir demonstrieren eine Technik zur Kultur primärem Mammakarzinom Proben aller Sub-Typen. Dies wird durch die dreidimensionale (3D-) Kultur, in dem kleine Stücke des Tumors in weichen Ratte Kollagen I Kissen eingebettet sind erreicht. Innerhalb von 2-3 Wochen, die Tumorzellen in das Kollagen verteilt und bilden verschiedene Strukturen ähnlich denen in der menschlichen tumours1 beobachtet. Tragfähige Adipozyten wurden Epithelzellen und Fibroblasten in den ursprünglichen Kern der Histologie evident. Bösartige Epithelzellen mit squamoid Morphologie wurden gezeigt Invasion in das umgebende Kollagen. Kernpolymorphie war in diesen Zellen evident, zusammen mit Mitosen und apoptotische Körper. Wir haben Optical Projection Tomographie (OPT), ein 3D-Imaging-Technologie, eingesetzt, um das Ausmaß der Tumorausbreitung in Kultur zu quantifizieren. Wir haben OPT verwendet werden, um den Großteil Volumen des Tumors Kultur zu messen, einen Parameter routinemäßig während der neo-adjuvanten Behandlung von Brustkrebs-Patientinnen gemessen werden, um als Reaktion auf medikamentöse Therapie zu beurteilen. Hier präsentieren wir die Gelegenheit, Kultur menschlichen Brusttumoren ohne sub-type Bias und zu quantifizieren, die Ausbreitung dieser ex vivo. Diese Methode könnte in der Zukunft genutzt werden, um Drogen-Empfindlichkeit in ursprünglichen Tumor zu quantifizieren. Dies kann einen besseren prädiktiven Modells als derzeit verwendete Zelllinien.

Wir haben eine Kollagen-basierten entwickelt<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay, der Proliferation und Invasion fördert von Proben aller Brustkrebs-Subtypen. Optical Projection Tomographie, eine dreidimensionale Mikroskopie-Technik wurde verwendet, um zu visualisieren und zu quantifizieren Tumorausdehnung. Dieser Test kann verwendet werden, um Drogen-Reaktion der einzelnen Tumorproben zu quantifizieren.

Langfristige Culture of Human Breast Cancer Proben und deren Analyse mit Hilfe von optischen Projektion Tomography

Brustkrebs ist eine der führenden Todesursachen in der westlichen Welt. Es ist hinreichend belegt, dass die Ausbreitung von Brustkrebs, zunächst lokal und später ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Langzeitkultur von primärem Brustkrebsgewebe herzustellen und das dreidimensionale Wachstumsmuster zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Typ-I-Kollagen aus Rattenschwänzen extrahiert wird. Anschließend wird die Krebsbiopsieprobe präpariert und in die Kollagenmatrix eingebettet.Nach 20 Tagen in Kultur wird das Brustkrebsgewebe immunfluoreszent angefärbt und mittels optischer Projektionstomographie gescannt, und die Daten werden rekonstruiert und quantifiziert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die das Invasionsmuster eines individuellen Tumors zeigen und die durch eine dreidimensionale Analyse weiter quantifiziert werden können. Der Hauptvorteil von ex-vivo-Kulturen besteht darin, dass echte Krebsmaterialien in einem physiologischen Kontext verwendet werden.Im Gegensatz zu Zellkulturen aus Zelllinien ist die visuelle Demonstration dieser Technik wichtig, da es schwierig ist, primäres Krebsgewebe zu erhalten. Die korrekte Technik erhöht die Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen experimentellen Ergebnisses. Diese Technik werde ich gemeinsam mit Joanne Farrell vom MRC Technology demonstrieren, um mit der Extraktion von Typ-I-Kollagen zu beginnen.Gefrorene Rattenschwänze in 70 % Ethanol legen, bis sie aufgetaut sind. Mit einem Skalpell die überliegende Haut abziehen, um die Sehnen freizulegen, die Sehnen vom Schwanz ablösen und zur Sterilisation in 70 % Ethanol geben. Die gesammelten Sehnen wiegen und in Essigsäure überführen.Rühren Sie 48 Stunden bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie danach die Sehnen-Essigsäure-Mischung 30 Minuten lang mit 10.000 × g und verwerfen Sie das Pellet.Geben Sie ein gleiches Volumen von 10% Natriumchlorid zum S-Supernatant hinzu und lassen Sie die Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius stehen. Pipettieren Sie die obere Schicht ab und entsorgen Sie sie. Sammeln Sie anschließend die kollagenreiche unlösliche untere Schicht und zentrifugieren Sie diese 30 Minuten lang bei 10.000 ×g.Das kollagenreiche Material anschließend durch Schwerkraft erneut suspendieren, in 0,25-molarer Essigsäure bei vier Grad Celsius resuspendieren und per Pipette in einen Dialysebeutel überführen. Drei Tage lang gegen 1:1000 verdünnte Essigsäure bei vier Grad Celsius dialysieren.Den Dialysepuffer zweimal täglich wechseln. Kollagen kann für diesen Assay durch einen weiteren Zentrifugationsschritt und Resuspendierung in Essigsäure zusätzlich sterilisiert werden. Beginnen Sie mit mehreren Kernbiopsien, die von einwilligenden Patienten zum Zeitpunkt der kurativen chirurgischen Resektion eines invasiven Mammakarzinoms mittels Augenschein und mit einem Skalpell entnommen wurden.Teilen Sie das Gewebe in Fragmente von je einem Kubikmillimeter auf, entfernen und verwerfen Sie makroskopisch erkennbares Fettgewebe. Die Probe auf einer Skalpellklinge zu befestigen, ermöglicht eine bessere Sicht im Sicherheitswerkbank und macht die Dissektion präzise und sicher. Tauchen Sie die Fragmente in komplettes MEGM-Medium ein.Das Gewebe kann bis zu einer Stunde in diesem Zustand aufbewahrt werden, um eine Mischung aus Kollagengel mit einer Konzentration von 0,3 Milligramm pro Milliliter herzustellen. Kühlen Sie die Mischung auf Eis; verwenden Sie dazu ein Milligramm pro Milliliter Rattenschwanzkollagen, gefilterte Essigsäure im Verhältnis 1 zu 1000, 10-fach konzentriertes D-M-E-M-F 12 und 0,22 molares Natriumhydroxid. Pipettieren Sie 1,2 Milliliter der Kollagenmischung in die einzelnen Vertiefungen einer 24-Loch-Platte und stellen Sie die Platte 10 Minuten lang in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Um die Gelierung einzuleiten, nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator.Platzieren Sie die Tumorstücke auf dem gelierten Kollagen und verwenden Sie eine 10-Mikroliter-Pipettenspitze, um sie vorsichtig in die Mitte des Gels zu drücken. Stellen Sie die Platte für eine Stunde in den Inkubator zurück. Ergänzen Sie das vollständige A-M-E-G-M-Medium mit Beta-Estradiol auf eine Endkonzentration von 3,2 × 10⁻¹⁰ M.Nach einer einstündigen Inkubationszeit der Gel-Assays vorsichtig 1,2 Milliliter des supplementierten Mediums in jedes Loch geben. Die endgültige Beta-Estradiolkonzentration stellt sich auf 1,6 × 10⁻¹⁰ mol ein, um die physiologischen Östrogenspiegel in Brustgewebe nachzubilden. Einen 10-Mikroliter-Pipettenspitze entlang der Innenkante jedes Lochs führen, um jedes Gel zirkumferenziell freizusetzen, sodass jedes Gel frei im Medium schwimmen kann.Das 24-Loch-Plättchen erneut in den Inkubator zurückstellen und das Medium zweimal wöchentlich erneuern, bis das Experiment beendet ist. Invasives Wachstum kann in Echtzeit mithilfe eines Hellfeldmikroskops beobachtet werden. Eine Zeitrafferaufnahme mit erweiterter Schärfentiefe zeigt die Invasion des Epithels vom Tumorrand in die umgebende Kollagenmatrix über einen Zeitraum von 60 Stunden vom siebten bis zum neunten Tag.Beenden Sie das Experiment, indem Sie das Medium entfernen, und geben Sie eine Formulierung hinzu. Fixieren Sie für 48 Stunden, um die Proben aus dem 3D-Assay für die optische Projektionstomographie immunzufärben. Überführen Sie die in Formalin fixierten Proben zunächst aus den Vertiefungen in ein Gefäß.Anschließend 30 Minuten lang waschen. Die Gele in PBS einer stufenweisen Dehydrierung unterziehen, indem Methanol in PBS mit 0,05 % Tween 20 verdünnt wird; das Gewebe für 24 Stunden bei Raumtemperatur in frisch zubereiteter Methanol-Lösung mit 30 % DMSO und 30 % Wasserstoffperoxid im Verhältnis zwei zu eins zu drei inkubieren, um die Autofluoreszenz zu unterdrücken. Danach die Proben zwei Mal je 30 Minuten waschen.Bei der Methanol-Freeze-Thaw-Methode werden die Proben fünfmal von minus 80 Grad Celsius auf Raumtemperatur aufgetaut, wobei jeder Zyklus mindestens eine Stunde dauert, um sicherzustellen, dass die Antigene in den tieferen Gewebeschichten zugänglich gemacht werden. Anschließend wird das Gewebe unter Verwendung von Methanol als Verdünnungsmittel mit PBS mit 0,05 %T zwischen 20 wieder rehydriert, das Gewebe 24 Stunden bei vier Grad Celsius in einer Blockierungslösung inkubiert, um epitheliale Bestandteile nachzuweisen, und die Proben werden 48 Stunden bei vier Grad Celsius in Kaninchen-Anti-Cytokeratin-Primärantikörpern, die in 1,5 Milliliter Blockierungslösung mit 5 % DMSO verdünnt wurden, inkubiert. Die Proben werden danach 24-mal für jeweils 30 Minuten in PBS mit 0,05 %T gewaschen.Das Gewebe in fluoreszierenden sekundären Antikörpern inkubieren, verdünnt in 1,5 Milliliter Blockierungslösung mit 5% DMSO, für 48 Stunden bei vier Grad Celsius. Die Proben erneut in PBS mit 0,05% Tween 24-mal für jeweils 30 Minuten waschen. Um die Proben für die optische Projektionstomographie vorzubereiten, das gefärbte Gel in 1%iger Low-Melting-Point-Agarose einbetten und 24 Stunden in 100% Methanol dehydrieren.Als Nächstes das Präparat 48 Stunden lang in BABB-Lösung klären. Die Proben mit dem OPT-3001-M-Scanner scannen. Ziel- und Autofluoreszenz werden jeweils mit den Filter-Sets SI drei und GFP eins erfasst.Die Probe wird in einem transparenten Zylinder aus Aro-Gel gehalten und in Winkelschritten von 0,9 Grad gedreht. Bei jeder der 400 Drehpositionen wird ein digitales Bild der ruhenden Probe aufgenommen. Verwenden Sie die n recon-Software, um den Satz der in der OPT gewonnenen Winkelprojektionen zu rekonstruieren, indem eine Reihe von Querschnittsschnitten durch den Invasionstest erzeugt wird.Analysieren Sie die rekonstruierten Daten mithilfe von Geschwindigkeitssoftware, um das epitheliale Volumen durch Zytokeratin zu quantifizieren. Färben Sie eine minimale Voxel-Intensitätsschwelle fest, um Störungen durch Hintergrundfluoreszenz im Zielkanal zu reduzieren. Diese Schwelle wird empirisch auf 9.000 willkürliche Einheiten festgelegt.Verwenden Sie abschließend eine Liste der verfügbaren Parameter in der Messanwendung und die Daten aus dem autofluoreszierenden Kanal, der das mit dem ursprünglichen Kern verbundene Epithel abgrenzt, um das Volumen des Epithels in einem Tumorwachstum zu quantifizieren. Hier ist ein typisches Assay dargestellt, das nach 20 Tagen in Kollagenkultur fixiert und anschließend mit Cytokeratin gefärbt wurde. Die Velocity-Software kann sowohl die epitheliale Masse, die mit dem ursprünglichen Kern verbunden ist, als auch abgelöste Gruppen von eindringenden Zellen erkennen und jedes Volumen separat quantifizieren.Die ursprünglich gewonnenen Biopsien stammten aus einer Vielzahl von Tumoren nach ex-vivo-Kulturen. Man könnte auch andere Techniken wie die Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz verwenden, um Proliferations- oder Apoptoseraten oder Ähnliches zu bestimmen. Die Entwicklung dieser Technik hat es Forschern auf dem Gebiet der translationalen Brustkrebsforschung ermöglicht, Methoden zur Identifizierung von Arzneimittelresistenz bei Personen mit Brustkrebs zu erforschen.

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Biologie

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Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines mikrophysiologischen In-vitro-Systems zur Untersuchung von Brustkrebs unter Verwendung von primärem menschlichem Brustgewebe mit Handelsmaterialien.

Modellierung von Brustkrebs im menschlichen Brustgewebe mit einem mikrophysiologischen System

Im Zeitalter der Krebsimmuntherapie hat das Interesse an der Aufklärung der Dynamik der Tumormikroumgebung markant zugenommen. Dieses Protokoll beschreibt eine massenspektrometrische Bildgebungstechnik in Bezug auf ihre Färbe- und Bildgebungsschritte, die eine stark gemultiplexte räumliche Analyse ermöglichen.

Erweiterung des Verständnisses der Tumormikroumgebung mittels massenspektrometrischer Bildgebung von formalinfixierten und paraffineingebetteten Gewebeproben

Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Etablierung von humanen Brustorganoiden aus patienteneigenen Brusttumorresektionen oder normalem Brustgewebe bereitgestellt. Das Protokoll enthält eine umfassende Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Kultivieren, Einfrieren und Auftauen von Brustorganoiden aus menschlichen Patienten.

Etablierung und Kultivierung von patienteneigenen Brustorganoiden

Lernen Sie die Langzeitkultur primärer Brustkrebsgewebe und deren dreidimensionale Analyse mittels optischer Projektionstomographie. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Tumorinvasion und individuellen Arzneimittelreaktionen.

Langfristige Culture of Human Breast Cancer Proben und deren Analyse mit Hilfe von optischen Projektion Tomography

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