Name: Organotypische Collagen I Assay: A Temperguss Platform to Cell Verhalten in 3-Dimensional Kontext beurteilen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie ein organotypisches Collagen-I-Assay mit primären menschlichen Fibroblasten etablieren, um Zellmigration und Tumorinvasion in einem 3D-Matrixsystem zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht realistische Studien zur Metastase.

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Ein. Gründung der Fibroblasten-Kulturen aus Hautexplantaten <ol><li> 4 mm Stanzbiopsien vom menschlichen Unterarm erworben werden in MEM platziert ergänzt 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,25 pg / ml Fungizone. </li><li> Schneiden Sie subkutanes Fett und fein hacken die Biopsie in kleine Stücke durch Schaukeln eine Reihe 24 Skalpell gegen den Boden der Petrischale. </li><li> Die Gewebeschnitte Aufschlämmung in einem 25 cm 2 Gewebekulturbehälter mit primären Fibroblasten Wachstumsmedium (MEM mit 10% FCS, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 25 ug / ml Fungizon ergänzt) zugesetzt, bis die Oberfläche des Fadens bedeckt, aber flüssige Tiefe unzureichend für Gewebe zu schweben. </li><li> Nach 3-tägiger Inkubation bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2, 3 ml von primären Fibroblasten-Wachstumsfaktor Medien. </li><li> Nach einer weiteren 3 Tagen Inkubation Change-Medien mit frischen primären Fibroblasten-Wachstumsfaktor Medien, oder wenn cells sind nahezu konfluenten sie 1.04 kann in frischen Medien aufgeteilt werden. (Fungizone können ab diesem Zeitpunkt entfallen). </li></ol> 2. Stufe I - Herstellung von Kollagen I aus Rattenschwänzen Hinweis: Protokoll für ca. 12-14 Jugendlichen (frisch oder gefroren) Rattenschwänzen <ol><li> Planen Rattenschwanz durch Waschen in 70% igem Ethanol und entfernen Sehnen wie folgt: </li><li> Entfernen Sie die Haut vor Rattenschwanz durch Schneiden in der Mitte des Schwanzes von oben nach unten mit einem Skalpell und Läuten entlang der Länge des Schwanzes. </li><li> Trennen Sehne vom Kern des proximalen Bereich des Schwanzes. </li><li> Entfernen Sehne zu dem distalen Bereich des Schwanzes Vermeidung der Hülle mit gezahnten Pinzette. </li><li> Extrakt 1 g Sehne / 250 ml 0,5 M Essigsäure durch Rühren bei 4 ° C für 48 h durchgeführt. </li><li> Zentrifugieren Extrakt (7.500 xg) für 30 Minuten und entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Hinzufügen eines gleichen Volumens von 10% (w / v) NaCl zu dem Überstand, und rühren für 30-60 min. </li><li s g f minuten den verwerfen und wieder aufzul der niederschlag in m essigs bei von r h c.><li> Dialysieren das Kollagen Lösung gegen 6-8 Änderungen 6L ~ 17,5 mM Essigsäure (1 ml Essigsäure je Liter kaltes Wasser, Wechsel 2 x täglich). </li><li> Zentrifuge dialysiert Kollagen bei 30.000 xg für 1,5 Stunden. </li><li> Überstand entfernen und in sterile Flasche. </li><li> Einstellen der Kollagen I-Konzentration auf ~ 2 mg / ml unter Verwendung von 0,5 mM Essigsäure bei 4 ° C. </li></ol> 3. Stage II - Einrichten der 3D-Matrix mit eingebetteten Fibroblasten (lassen für 8 Tage kontrahieren). <ol><li> Montieren Sie die Mischung mit kalter Reagenzien bei 4 ° C in einer vorgekühlten Flasche. Halten Kollagen I auf Eis. </li><li> Für ein T75-Flasche von konfluenten Fibroblasten (~ Zellzahl 1 x 10 6) Verwendung: <ul><li> 25 ml Rattenschwanz Kollagen (ca. conc 2mg/ml) </li><li> 3 ml 10xMEM </li><li> 0,22 M NaOH: erste, fügen 2ml, dann tropfenweise unter Rühren, bis das Kollagen wird orange, </li><li> aber nicht rosa (in der Regel bis zu 3 ml). Ungefähre p H = 7,2. </li><li> Anmerkung: Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Mittel / Gel-neutral oder schwach sauer bleibt als Fibroblasten nicht zusammenziehen wird, wenn das Gel noch leicht alkalischen Bedingungen ausgesetzt. </li></ul></li><li> Trypsinise die Fibroblasten, drehen bei 400 xg für 5 Minuten und entfernen Überstand. </li><li> Während 5 Minuten vor spinnen: Bereiten 12 x 35 mm Kunststoff-Geschirr - normalerweise erreicht 12 Gerichte aus einem Kolben von Fibroblasten / Kollagen-Mix. </li><li> Resuspendieren Fibroblasten in 3 ml FCS und sofort an das Kollagen Mischung hinzufügen und umrühren. </li><li> Platte etwa 2,5 ml Kollagen / Fibroblasten pro Schale so schnell wie möglich. Versuchen Sie, Blasen und Kollagen Einstellung zu vermeiden. </li><li> Lassen Sie das Kollagen bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 in Luft für 10 Minuten eingestellt. </li><li> 1ml von Fibroblasten wachsenth (DMEM + 10% FCS). </li><li> Trennen der Kollagen / Fibroblasten-Matrix von den Seiten der Schale mit Hilfe einer Pipette. </li><li> Nächster Tag: In 1 ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor (DMEM + 10% FCS). </li><li> Ändern Medien jeden zweiten Tag. Lassen Kollagen / Fibroblasten Matrix Vertrag für ca. 8 Tage, bis sie in einer 24-Well-Platte passen (Kontraktion von ~ 3,5 cm bis 1,5 cm im Durchmesser, siehe Abbildung 1). </li></ol> Hinweis: Die Kollagen-Konzentration sollte so eingestellt werden, um die Anwendung angepasst werden. Je verdünnter die Kollagenlösung, desto schneller wird es durch die Fibroblasten kontrahiert werden. Geringfügige Unterschiede in Kontraktionsrate wird mit verschiedenen Chargen von Kollagen in der gleichen Konzentration erfahren werden. Ebenso verschiedenen Fibroblasten-Kulturen wird die Kollagen-Gele mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten kontrahieren, und je mehr Fibroblasten präsentieren, desto schneller die Geschwindigkeit der Kontraktion. Kollagenkonzentration und Fibroblasten-Dichte kann daher durch angepasst, um die Rate der Kontraktion zu verändern,und die endgültige Dichte des Kollagengels. 4. Stage II - Plating Zellen von Interesse auf der Oberseite der Matrix Hinweis: Sterilisieren alle Zangen und Geräte mit Ethanol vor dem Gebrauch. <ol><li> Mit stumpfen Pinzette vorsichtig bewegen vertraglich Matrix 24-Well-Schale. Stellen Sie sicher, dass es nicht klappt. </li><li> Bereiten Suspension von Zellen von Interesse bei etwa 4 x 10 4 / ml und Platte 1ml (nach trypsinising, Spin-Zellen loszuwerden Trypsin) auf der Oberseite der Matrix. Tatsächliche Anzahl der Zellen benötigt variiert je nach Zelltyp. Zellmedium sollte normalen Wachstumsmedium für die Zellen von Interesse sein. </li><li> Erlauben Zellen bis zur Konfluenz auf der Matrix, etwa 3-5 Tage wachsen gelassen. </li></ol> 5. Stufe III - Übertragung der Matrix auf einem Raster für die Invasion (ca. 0-21 Tage) <ol><li> Cut Edelstahlgitterroste ein Stativ zu schaffen und autoklavieren vor der Anwendung (siehe Abbildung 2). </li><li> Zeigen sterile Gitter6 cm Schale, fügen Wachstumsmedium bis zu einem Niveau oberhalb des Gitters (ca. 10.5ml). Matrix Platz auf dem Gitter und sanft absaugen Medien so dass die Unterseite der Matrix in Kontakt mit den Medien, aber nicht getaucht. Dies wird als die Luft / Flüssigkeits-Schnittstelle, die einen Gradienten, Invasion fördert schafft bezeichnet. Ersetzen Medium alle zwei Tage (siehe Abbildung 2). </li><li> Live-Zelle kann kontextuellen Bildgebung mit fluoreszierenden Zellen zu diesem Zeitpunkt oder früher abgebildet werden. Die kontrahierten oder fibrillären Kollagen kann ich abgebildet mit Second Harmonic Generation (SHG, siehe Abbildung 3). Mittels Multi-Photonen-Anregung mit großem Feld Detektion kombinierten wir feststellen, dass SHG mindestens 100 um in die Matrix abgebildet werden, wohingegen Zellen, die GFP cytoplasmatischen abbildbar mindestens 200 um tief sein. </li></ol> Hinweis: Im Hinblick auf die Quantifizierung der Invasion, definiert der Tag, an dem Matrizen auf den Gittern platziert werden Tag 0. Platzierung auf Gittern einen Gradienten von Zellkulturmedien, die Invasion int fördert o die Matrix. Die Proben können in den nächsten 1 abgebildet werden - 21 Tage (oder länger) an biologischen Prozessen wie Invasion, Proliferation, Überleben oder Differenzierung (siehe Referenzliste) zu beurteilen. 6. Stufe IV - Fixation <ol><li> 5 ml 4% PFA in einem Falcon-Röhrchen. </li><li> Übertragen Sie die Matrix auf eine ebene Fläche. Schneiden Sie die Matrix in zwei Hälften mit einem frischen, sauberen Skalpell (wie werden Sie Färbung der Querschnitt), heben Sie die Matrix mit Skalpell und Transfer zum 4% PFA, fix über Nacht. </li><li> Organotypische Matrizen sind nun bereit, mit dem Antikörper färben / Fleck der Wahl (siehe Abbildung 3). </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3089/3089fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1 Beispiel Fibroblasten vergeben Kollagen I. Mischung aus Fibroblasten und Rattenschwanz Kollagen aus der Petrischale gelöst und erlaubt, über 6-8 Tage schrumpfen. Abbildung 2 "src =" / files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg "/&gt; Abbildung 2 Organotypische Assay Progression. Eine schematische organotypischer Einrichtung und Progression. B, Beispiel von Kollagen / Fibroblasten-Matrix auf der Oberseite Edelstahl, sterilen Gitters, um Luft / Flüssigkeits-Grenzfläche zu schaffen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3089/3089fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3 Anwendungen organotypischer Assay. A, B eindringenden nichtinvasiven und invasiven duktalen Adenokarzinom (PDAC) Zellen im Laufe der Zeit mit organotypischen Matrix. C, lebenden Hautäquivalent, das eine geschichtete Epidermis eines Fibroblasten vergebene kollagenen dermalen Komponente. D, eindringenden C8161 Melanomzellen in einem Fibroblast -Vertrag kollagenen dermal gleichwertig. E, invasive PDAC Zellen (grün) interagieren und Invasion mit Fibroblasten (rot) in der organotypischen Matrix. F

<ol><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Edward, M., Gillan, C., Micha, D., Tammi, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+regulation+of+fibroblast+hyaluronan+expression%3A+a+mechanism+to+facilitate+tumour+growth+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Tumour regulation of fibroblast hyaluronan expression: a mechanism to facilitate tumour growth and invasion.</a> Carcinogenesis. 26, 1215-1223 (2005).</li>
<li>Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+human+breast+cancer+cells+in+vivo+requires+both+paracrine+and+autocrine+loops+involving+the+colony-stimulating+factor-1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Invasion of human breast cancer cells in vivo requires both paracrine and autocrine loops involving the colony-stimulating factor-1 receptor.</a> Cancer Res. 69, 9498-9506 (2009).</li>
<li>Serrels, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+study+of+E-cadherin+and+membrane+dynamics+in+living+animals%3A+implications+for+disease+modeling+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time study of E-cadherin and membrane dynamics in living animals: implications for disease modeling and drug development.</a> Cancer Res. 69, 2714-2719 (2009).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
<li>Edward, M., Quinn, J. A., Pasonen-Seppanen, S. M., McCann, B. A., Tammi, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Methylumbelliferone+inhibits+tumour+cell+growth+and+the+activation+of+stromal+hyaluronan+synthesis+by+melanoma+cell-derived+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">4-Methylumbelliferone inhibits tumour cell growth and the activation of stromal hyaluronan synthesis by melanoma cell-derived factors.</a> Br. J. Dermatol. 162, 1224-1232 (2010).</li>
<li>Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+characteristics+of+transformed+keratinocytes+from+mouse+and+human+skin+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation characteristics of transformed keratinocytes from mouse and human skin in vitro and in vivo.</a> J. Invest. Dermatol. 81, 168s-175s (1983).</li>
<li>Nystrom, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J. Pathol. 205, 468-475 (2005).</li>
<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J. Cell. Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
<li>Amjad, S. B., Carachi, R., Edward, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+regulation+of+TGF-beta+and+connective+tissue+growth+factor+expression%3A+a+role+in+suppression+of+scar+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte regulation of TGF-beta and connective tissue growth factor expression: a role in suppression of scar tissue formation.</a> Wound Repair Regen. 15, 748-755 (2007).</li>
<li>Gaggioli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-led+collective+invasion+of+carcinoma+cells+with+differing+roles+for+RhoGTPases+in+leading+and+following+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells.</a> Nat. Cell. Biol. 9, 1392-1400 (2007).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Hier stellen wir ein Verfahren zur Herstellung einer 3-dimensionalen Matrix geeignet für Untersuchungen von invasiven Zellmigration 6-8. Die Matrix besteht aus Kollagen Typ 1 Fibrillen, die sich über einen Zeitraum von mehreren Tagen durch primäre menschliche Fibroblasten epidermalen zusammengezogen sind. Das Kollagen durch Säureextraktion nicht enzymatische Verdauung, die Reaktivität bewahrt an den Poly-Peptid Enden und fördert Vernetzung der Kollagenfibrillen zu größeren Aggregaten bei Neutralisation der Pufferbedingungen 9 hergestellt. Dies führt zu einem rekonstituierten Gel, stärker imitiert die Funktionen von Kollagen in vivo und hat wichtige Konsequenzen für die invasive Eigenschaften von Zellen in den Gelen gezüchtet. Es spielt keine Rolle, ob frisch oder gefroren Ausgangsmaterial verwendet wird, aber die Verwendung von Jugendlichen Rattenschwänzen ist wichtig, weil Kollagen Vernetzung ist labile bei jüngeren Tieren. Collagen I von jüngeren Tieren ist daher leichter zu extrahieren und re-stellt with höhere Treue. Die Kollagenmatrix fixiert und mit Antikörpern gegen entweder invasiv Tumorzellen oder Stromafibroblasten 2,10 gerichteten gefärbt werden und sind sehr nützlich zum Testen der Wirksamkeit von Wirkstoffen, die Invasion 5,6 hemmen könnte. Obwohl dieses Protokoll schlägt die Verwendung von primären humanen Hautfibroblasten, ist es machbar, primäre Fibroblasten, die von anderen Gewebearten zu verwenden, je nach der Art der zu untersuchenden Gewebe. Es ist auch möglich, die Kulturen mit immortalisierten Fibroblasten, einschließlich Zellen, die stabil mit fluoreszierenden Proteins transfiziert Konjugate herzustellen. Auf diese Weise sowohl Stroma-und Tumorzellen markiert, um Zell-Zell-Interaktionen während der Invasion 11 visualisieren.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> 10x MEM </td><td> Gibco </td><td> 21430 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> 367.176-500G </td><td> Bereiten 0,22 M Vorratslösung in Wasser </td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15-101 </td><td> - </td></tr><tr><td> 35 mm Schalen </td><td> Falke </td><td> 353001 </td><td> Für den Schritt 3,4 </td></tr><tr><td> 60 mm Schalen </td><td> Falke </td><td> 353004 </td><td> Für den Schritt 5,2 </td></tr><tr><td> Frühling Pinzette stumpf </td><td> Samco </td><td> E003/02 </td><td> Zahnriemen, nicht glatt </td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyd </td><td> Elektronenmikroskopie Dienstleistungen </td><td> 15710 </td><td> Verdünnte bis 4% in PBS vor der Verwendung </td></tr><tr><td> Bildschirme für cd-1, Größe 40 mesh </td><td> Sigma </td><td> S07707-5EA </td><td> Edelstahlgitterroste, 5 pro Packung </td></tr><tr><td> Dialyseschlauch </td><td> Medicell International </td><td> 7607 2295 </td><td> 12 bis 14 kD </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Oxoid </td><td> BR0014G </td><td> - </td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> Sigma </td><td> 242853 </td><td> - </td></tr><tr><td> 24 Well-Platte </td><td> Falke </td><td> 353047 </td><td> Für den Schritt 4,1 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> In Vitrogen </td><td> 15290018 </td><td> - </td></tr></tbody></table>

organotypische collagen i assay: a temperguss platform to cell verhalten in 3-dimensional kontext beurteilen

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Zellmigration ist grundlegend für viele Aspekte der Biologie, einschließlich Entwicklung, Wundheilung, die zellulären Reaktionen des Immunsystems und Metastasierung von Tumorzellen. Migration hat auf Deckgläsern wurden untersucht, um zelluläre Dynamik zugänglich Untersuchung mit dem Lichtmikroskop zu machen. Allerdings hat sich gezeigt, dass viele Aspekte der Zellmigration auf Merkmale der lokalen Umgebung einschließlich seiner Elastizität Proteinzusammensetzung und Porengröße, die nicht originalgetreu durch starre zweidimensionalen Substraten wie Glas und Kunststoff 1 dargestellt abhängen. Darüber hinaus hat die Interaktion mit anderen Zelltypen, einschließlich Stromafibroblasten 2 und Immunzellen 3, wurde gezeigt, dass eine kritische Rolle bei der Förderung der Invasion von Krebszellen spielen. Untersuchung auf molekularer Ebene zunehmend gezeigt, daß molekularer Dynamik, einschließlich Reaktion auf Medikamente, identischer Zellen signifikant verschieden sind, wenn verglichen <em&gt; In vitro und in vivo 4. Im Idealfall wäre es am besten, um die Zellwanderung in seiner natürlich vorkommenden Kontext, in lebenden Organismen zu studieren, dies ist jedoch nicht immer möglich. Zwischenprodukt Gewebekultursystemen wie Zellen abgeleiteten Matrix, Matrigel, organotypische Kultur (hier beschrieben) Gewebeexplantate, Organoiden und Xenotransplantate sind daher wichtig experimentellen Zwischenprodukte. Diese Systeme ungefähre bestimmte Aspekte der in vivo-Umgebung sind aber offen für experimentelle Manipulation wie die Verwendung von stabil transfizierten Zelllinien, medikamentöse Behandlung Regime, langfristige und hochauflösende Bildgebung. Solche Zwischensysteme sind insbesondere als Prüfgeländen um Sonden herzustellen validieren und Parameter, die zur Abbildung des dynamischen Verhaltens von Zellen und fluoreszierenden Reporter vor der Durchführung Bildgebung in vivo 5. Als solche können sie eine wichtige Rolle bei der Verringerung des Bedarfs an Experimente dienen living Tieren.

Es wird ein Verfahren zur Herstellung einer 3-dimensionalen Matrix, bestehend aus Kollagen Typ I und primären humanen Fibroblasten beschrieben. Diese organotypischen Gel dient als nützliches Substrat invasive Zellmigration beurteilen, da es grundlegende Funktionen von Gewebestroma nachahmt und ist offen für viele Formen der Mikroskopie.

Organotypische Collagen I Assay: A Temperguss Platform to Cell Verhalten in 3-Dimensional Kontext beurteilen

Die Zellmigration ist grundlegend für viele Aspekte der Biologie, einschließlich der Entwicklung, der Wundheilung, der zellulären Reaktionen des Immunsystems und ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine gewebelike dreidimensionale Kollagenmatrix zur Untersuchung der Zellfunktion zu etablieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Kollagen aus Rattenschwanzsehnen extrahiert wird. Anschließend werden Kollagenfasern in Gegenwart von Fibroblasten rekonstituiert, um den Fibroblasten die Kontraktion des Kollagengels zu ermöglichen.Im dritten Schritt werden Tumorzellen im letzten Schritt auf der Matrix aufgebracht. Die Matrix wird auf einem Metallgitter inkubiert, um eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche zu erzeugen, die das Eindringen der Tumorzellen in die Matrix ermöglicht. Abschließend können immunhistochemische Färbungen und die Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden, um die Matrixsynthese, Zellmigration sowie Tumorzellinvasion und Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen zu analysieren.Daher eignet sich diese Methode ideal zur Untersuchung von Invasion und Metastasierung sowie der Tumorentwicklung. Auf einem komplexen dreidimensionalen S können wir Aspekte wie Differenzierung, Zellüberleben und Zellwachstum untersuchen. Insbesondere können wir jedoch untersuchen, wie Tumorzellen während zentraler Ereignisse der Invasion mit dem Stroma interagieren.Einer der frühesten Schritte bei der Metastasierung von Krebs selbst, um Fibroblastenkulturen aus Hautimplantaten zu etablieren. Geben Sie zunächst einige Tropfen MEM, ergänzt mit Penicillin, Streptomycin und Fungizid, auf den Boden einer Petrischale. Anschließend werden vier Millimeter große Stanzbiopsien, die von einem menschlichen Unterarm stammen, in die Schale gelegt.Als Nächstes schneiden Sie die Biopsie durch Schwenken einer Skalpellklinge Größe 24 über dem Boden der Petrischale in kleine Stücke. Geben Sie die Gewebemischung in einen 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturflasche. Anschließend gießen Sie das Wachstumsmedium für primäre Fibroblasten über das Gewebe.Das reicht aus, um die Oberfläche des Kolbens zu bedecken, ist jedoch nicht ausreichend, damit das Gewebe schwimmt. Inkubieren Sie den Kolben drei Tage lang bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO2 und geben Sie anschließend nach weiteren drei Tagen Inkubation drei Milliliter frisches primäres Fibroblasten-Wachstumsmedium hinzu. Ersetzen Sie das Medium durch frisches primäres Fibroblasten-Wachstumsmedium.Wenn die Zellen nahezu konfluent sind, können sie im Verhältnis 1:4 in neue Flaschen mit frischem Medium aufgeteilt werden. Beginnen Sie damit, die Rattenschwänze in 70 % Ethanol zu waschen, und kühlen Sie eine Flasche mit 0,5 molarer Essigsäure auf vier Grad Celsius, um die Sehnen aus den Rattenschwänzen zu entfernen. Entfernen Sie zuerst die Haut von jedem einzelnen Rattenschwanz.Als Nächstes lösen Sie die Sehne vom Kernbereich des proximalen Schwanzabschnitts. Entfernen Sie abschließend die Sehne im distalen Schwanzbereich mit einer Pinzette. Nachdem die Sehnen entfernt wurden, geben Sie 250 Milliliter 0,5-molarer Essigsäure in einen Glaskegelflasche.Extrahieren Sie ein Gramm Sehne pro 250 Milliliter Säure, indem Sie 48 Stunden bei vier Grad Celsius rühren, nachdem die Sehne extrahiert wurde. Zentrifugieren Sie die Säure-Sehnen-Lösung bei 7.500 ×g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie danach das Pellet. Geben Sie anschließend ein gleiches Volumen einer 10 %igen (Gewicht pro Volumen) NaCl-Lösung zum Überstand und rühren Sie nach dem zweiten Rührschritt weitere 30 bis 60 Minuten.Zentrifugieren Sie die Lösung. Dieses Mal bei 10.000 × g, entfernen Sie den Überstand und lösen Sie das Präzipitat erneut in 0,25 molarer Essigsäure unter weiterem Rühren für 24 Stunden bei vier Grad Celsius auf. Anschließend dialysieren Sie die Kollagenlösung gegen sechs bis acht Wechsel von jeweils sechs Litern etwa 17,5 millimolarer Essigsäure.Nach dem Dialyse-Pelletieren wird das Kollagen bei 30.000 × g für 1,5 Stunden zentrifugiert. Anschließend wird der Überstand in eine sterile Flasche überführt und die Kollagenkonzentration mit zuvor gekühlter 0,5-millimolarer Essigsäure auf etwa zwei Milligramm pro Milliliter eingestellt, wobei das Kollagen stets auf Eis gehalten wird. Zunächst werden drei T-75-Flaschen mit konfluenten primären Fibroblasten ausgewählt.Stellen Sie einen Behälter mit FCS bei vier Grad Celsius zum Abkühlen. Geben Sie anschließend 75 Milliliter des zuvor hergestellten Kollagens aus Rattenschwanz in eine 100-Milliliter-Glasflasche, die steril und vorgekühlt ist. Fügen Sie dann unter Rühren der Mischung neun Milliliter 10 XMEM hinzu.Geben Sie sechs Milliliter 0,22 normaler Natriumhydroxidlösung hinzu, wobei Sie beim Annähern an den letzten Milliliter langsamer werden. Um sicherzustellen, dass die Endfarbe zwischen orange und rosa liegt. Verdauen Sie die Fibroblasten mit Trypsin und pelletieren Sie die Zellen anschließend bei 400 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.Während des Schleudervorgangs 36 35-mm-Kunststoffschalen vorbereiten. Den Pellet in 10 Milliliter vorgekühltem FCS resuspendieren und die Fibroblasten unverzüglich dem Kollagen zugeben. Den Kollagen-Fibroblasten-Gemisch vorsichtig mischen und so schnell wie möglich etwa 2,5 Milliliter pro 35-mm-Schale auftragen.Vermeiden Sie Blasenbildung und Aushärtung des Kollagens. Stellen Sie die Schalen 10 Minuten lang in den Inkubator, damit das Kollagen ein lockeres Gel bilden kann, und geben Sie anschließend je einen Milliliter Fibroblasten-Wachstumsmedium in jede Schale. Lösen Sie dann mithilfe einer Pipette die Kollagen-Fibroblasten-Matrix von den Rändern der Schale und stellen Sie die Schalen erneut in den Inkubator.Am nächsten Tag weiterein Milliliter Wachstumsmedium für Fiberblasten zu den Schalen hinzufügen. Danach das Medium alle zwei Tage für etwa die nächsten acht Tage wechseln. Während dieser Zeit sollte sich jede Kollagen-Fibroblasten-Matrix von etwa 3,5 Zentimetern auf etwa 1,5 Zentimeter Durchmesser zusammenziehen, bevor mit dem nächsten Schritt begonnen wird. Alle Pinzetten und Geräte mit Ethanol sterilisieren.Dann mit stumpfen, sterilisierten Pinzetten vorsichtig eine kontrahierte Matrix in eine Vertiefung einer 24-Loch-Platte überführen, wobei sichergestellt werden muss, dass sich die Matrix nicht faltet. Anschließend einen Kolben mit zu untersuchenden Zellen auswählen, die Zellen wie zuvor abspinnen und das Zellpellet resuspendieren, danach die Zellen in Medium resuspendieren und ein Milliliter der Zellsuspension auf die Matrix aufpipettieren und die belegte Matrix in den Inkubator stellen, bis die Zellen nahezu konfluent auf der Matrixoberfläche gewachsen sind. Ungefähr drei bis fünf Tage nach der Autoklavierung vorgeschnittene Edelstahlgitter zur Herstellung von Tripoden vor der Verwendung sterilisieren, ein steriles Gitter in eine sechs Zentimeter große Kunststoffschale geben und ausreichend Wachstumsmedium hinzufügen, um das Gitter zu bedecken.Das Erstellen der Luft-Flüssig-Grenzfläche ist der empfindlichste Teil dieses Verfahrens. Die Matrix muss auf dem Objektträger platziert und anschließend das Medium vorsichtig abgesaugt werden, sodass die Matrix von unten her weiterhin teilweise untergetaucht bleibt und von unten ernährt wird. Dies erzeugt einen chemotaktischen Gradienten und ermöglicht es den Zellen an der Oberseite, in die Matrix einzudringen. Das Zellverhalten in diesem Aufbau kann anschließend über einen Zeitraum von 21 Tagen oder länger bewertet werden. Platzieren Sie eine Matrix auf dem Raster. Danach saugen Sie vorsichtig das Medium ab, bis der Boden der Matrix mit dem Medium in Kontakt steht, dieses jedoch nicht bedeckt.Die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche sollte anschließend ähnlich wie in dieser Abbildung aussehen. Übertragen Sie danach eine infiltrierte Matrix auf eine flache Oberfläche. Schneiden Sie die Matrix mit einem frischen Skalpell halb durch und heben Sie sie dann mit dem Skalpell an, um sie in 4 % PFA zu überführen.Fixieren Sie die Matrix über Nacht bei Raumtemperatur. In den folgenden beiden Abbildungen wurden pankreatische duktale Adenokarzinomzellen oder PDAC-Zellen über eine organotypische Matrix geschichtet. In der ersten Abbildung sind nicht-invasive PDAC-Zellen als Schicht auf der Oberfläche der Matrix zu erkennen, während in dieser zweiten Abbildung invasive PDAC-Zellen, die in die Matrix eingedrungen sind, beobachtet werden können. Hier ist ein lebendes Hautäquivalent sichtbar, das einen stratifizierten Epidermis auf einem kollagenen, fibroblastengezogenen dermalen Bestandteil zeigt. Invasive PD-Zellen in Grün sind hier sichtbar, wie sie mit Fibroblasten in Rot interagieren, wodurch die Invasion der PDX-Zellen in die organotypische Matrix gefördert wird.Die hier erneut grün dargestellten invasiven PD-Zellen sind innerhalb der Kollagenmatrix sichtbar, die mittels zweiter harmonischer Erzeugung abgebildet und in Lila dargestellt wird. Stellen der Matrixdegradation erscheinen als dunkle Löcher innerhalb der lila gefärbten Matrix. In dieser Abbildung C 8 1 61 werden Melanomzellen gezeigt, die in ein fibroblastengekontrahiertes, kollagenöses, dermisches Ersatzgewebe eindringen. Neben der Untersuchung des Verhaltens grundlegender Prozesse fluoreszierender Proteine während dieses Assays kann man diesen auch zusammen mit immunhistochematischer Färbung verwenden, um Proliferationsmarker der Zellen sowie Unterschiede in der Zellüberlebensfähigkeit usw. zu analysieren.

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Dissection und Kultur von Maus-dopaminergen und Striatale Explantate in dreidimensionalen Kollagen-Matrix-Assays

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