Erzeugung eines multivalent anzeigenden Impfstoffs gegen äußere Membranvesikel

Nehmen wir Transfektionspolyplexe, die Zielplasmide enthalten, die an ein Polymer gebunden sind. Die Plasmide kodieren für ein virales Antigen, das mit einem Peptid-Tag und einem Affinitäts-Tag fusioniert ist.

Inkubieren Sie die Polyplexe mit Säugetierzellen, die die Polyplexe in den Endosomen internalisieren.

Das Polymer induziert einen Vesikelbruch. Die freigesetzten Plasmide exprimieren das virale Antigen, das extrazellulär sezerniert wird.

Ernten Sie den Überstand, der das Antigen und die Kontaminanten enthält. Fügen Sie ein konkurrierendes Mittel in niedriger Konzentration hinzu.

Laden Sie es auf eine Affinitätschromatographiesäule.

Die Affinitätsmarkierungen binden an das Säulenharz und immobilisieren das Antigen, während der konkurrierende Wirkstoff die unspezifische Bindung verringert.

Fließen Sie das konkurrierende Mittel in einer niedrigen Konzentration, um schwach gebundene Verunreinigungen zu entfernen.

Waschen Sie mit steigenden Konzentrationen konkurrierender Wirkstoffe, um die stark gebundenen Antigene zu verdrängen und zu eluieren.

Bakterielle Vesikel der äußeren Membran (OMVs) mit einem oberflächengebundenen Fängerprotein einführen und inkubieren.

Antigen-Peptid-Tags binden an die einfangenden Proteine und bilden einen OMV-Impfstoff mit einer multivalenten Antigenanzeige.

Führen Sie die OMV SpyCatcher-Reinigung durch. Beginnen Sie mit dem Zentrifugieren der Bakterienlösung. Filtrieren Sie den Überstand mit einem 0,22-Mikrometer-Membranfilter und konzentrieren Sie ihn dann mit einer Hohlfasersäule. Filtrieren Sie das Konzentrat durch einen 0,22-Mikrometer-Membranfilter, zentrifugieren Sie es dann zwei Stunden lang mit einer Ultrazentrifuge bei 150.000 g bei 4 Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette. Resuspendieren Sie den Niederschlag mit PBS und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius.

Um eine RBD-SpyTag-Transfektion durchzuführen, beginnen Sie mit der Auswahl eines geeigneten eukaryotischen Expressionssystems und kultivieren Sie die Zellen nach der Genesung über Nacht bei 130 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius. Geben Sie 20 Mikroliter HEK293F Zelllösung in den automatisierten Zellzähler. Notieren Sie die Anzahl der Zellen. Stellen Sie die Konzentration auf 1 mal 10 bis sechste Zellen pro Milliliter ein und kultivieren Sie die Zellen dann 4 Stunden lang bei 130 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius.

Filtrieren Sie das RBD-SpyTag-Plasmid durch einen 0,22-Mikrometer-Membranfilter und geben Sie 300 Mikrogramm Plasmide in das Zellkulturmedium, bis das endgültige Volumen 10 Milliliter beträgt. 10 Sekunden lang schütteln. PEI im Wasserbad auf 65 Grad Celsius erhitzen. Mischen Sie 0,7 Milliliter PEI mit 9,3 Millilitern Zellkulturmedium und schütteln Sie es 10 Sekunden lang mit Unterbrechungen.

Geben Sie die Plasmidlösung in die PEI-Lösung. Schütteln Sie die Mischung 10 Sekunden lang mit Unterbrechungen und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie die Mischung in 280 Milliliter Zellkulturmedium und kultivieren Sie sie 5 Tage lang bei 130 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius.

Führen Sie als Nächstes die RBD-SpyTag-Reinigung durch. Beginnen Sie damit, die Zellen bei 6.000 mal g bei 25 Grad Celsius für 20 Minuten zu zentrifugieren. und verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand aufzufangen. Bauen Sie die Säule mit 2 Millilitern Nickel-NTA-Agarose und waschen Sie sie dreimal mit PBS.

Geben Sie Imidazol in den Zellüberstand, um die Endkonzentration von 20 Millimolar zu erreichen, und laden Sie den Zellüberstand. Fügen Sie 3 Säulenvolumina PBS mit 20 Millimolar Imidazol zum Waschen hinzu und sammeln Sie die Waschfraktion. Gradienteneluierung mit drei Säulenvolumina PBS, die niedrige bis hohe Konzentrationen von Imidazol enthalten. Eluieren Sie zweimal für jede Konzentration.

Um die Proteinkonzentration nach der BCA-Methode zu bestimmen, verdünnen Sie die Standard-BSA-Proteinlösung seriell von 2 auf 0,0625 Milligramm pro Milliliter. Verdünnen Sie den gereinigten OMV SpyCatcher und RBD-SpyTag 10-mal. Mischen Sie dann die BCA-Arbeitslösungen A und B im Verhältnis 50 zu 1. Verdünnte Proteinlösung hinzufügen und mit BCA-Arbeitslösung mischen. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Messen Sie die Extinktion bei 562 Nanometern jeder Vertiefung und berechnen Sie die Proteinkonzentration aus der Standardkurve.

Um die Biokonjugation von OMV SpyCatcher und RBD-SpyTag durchzuführen, mischen Sie OMV SpyCatcher in RBD-SpyTag in PBS im Verhältnis 40 zu 1. Vertikal drehen, um die Mischung über Nacht mit 15 Umdrehungen pro Minute bei 4 Grad Celsius zu mischen. Führen Sie die Reinigung von OMV RBD mit PBS-Lösung unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens wie die OMV SpyCatcher-Reinigung durch.