Beurteilung der mitochondrialen Funktion in zerebralen vaskulären Endothelzellen

Beginnen Sie mit zerebralen vaskulären Endothel- oder CVE-Zellen in Kulturmedien.

CVE-Zellen sind Zellen mit hohem Energiebedarf, die die Blutgefäße des Gehirns auskleiden und für die Physiologie des Gehirns unerlässlich sind.

Legen Sie die Zellen in eine extrazelluläre Flussmittel-Zellkulturplatte. Inkubieren für die Zelladhäsion.

Ersetzen Sie das Nährmedium durch extrazelluläre Flussmittel-Assay-Medien mit dem gewünschten pH-Wert.

Inkubieren Sie ohne Kohlendioxid, um den pH-Wert aufrechtzuerhalten.

Nehmen Sie als Nächstes eine extrazelluläre Flusssensorpatrone, die Sensoren und eine Bodenplatte enthält.

Geben Sie eine Kalibrierlösung auf die Platte und inkubieren Sie ohne Kohlendioxid, um die Sensoren zu hydratisieren.

Diese Sensoren können die Veränderungen der Sauerstoffkonzentration in der extrazellulären Umgebung messen, die auf die mitochondriale Aktivität hinweisen.

Laden Sie dann die Kartusche in ein Bioanalysegerät und kalibrieren Sie die Sensoren.

Ersetzen Sie die untere Platte durch die Platte, die die Zellen enthält.

Messen Sie die mitochondriale Funktion von CVE-Zellen.

Nach der entsprechenden Anzahl von Subkulturen säen Sie 1,6 x 10⁴ Zellen in 80 Mikrolitern vollständigem Medium pro Vertiefung auf eine extrazelluläre Flux-Zellkulturplatte mit 96 Well und legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.

Hydratisieren Sie am Tag vor dem Assay zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion eine extrazelluläre Flusssensorkartusche mit 150 Mikrolitern extrazellulärer Flussmittelkalibrierungslösung und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid.

Am nächsten Morgen wechseln Sie das Zellkulturmedium mit der Plattenwaschstation in ein extrazelluläres Flussmittel mit einem pH 7,0 und inkubieren Sie die Zellen dann 30 bis 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid. Wenn sich die Zellen äquilibriert haben, laden Sie die hydratisierte Kartusche in den Bioanalysator und klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um die Kalibrierung zu starten.

Klicken Sie am Ende der Kalibrierung auf die Eingabeaufforderung Kartusche entsperren, um die Bodenplatte der Kartusche zu entfernen, und laden Sie die Zellplatte, öffnen Sie dann die Datendatei, um die Ratenwerte vom Bioanalysator für den Export in die Tabellenkalkulationsdatei abzurufen.