Name: Zellbasierte Calcium-Assay für Mittel-bis High-Throughput-Screening von TRP-Kanal-Funktionen mit FlexStation 3 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Lernen Sie einen zellbasierten Calcium-Assay zur Untersuchung von TRPA1-Kanälen mit dem FlexStation 3. Diese Methode ermöglicht High-Throughput-Screening und pharmakologische Profilierung für die Arzneimittelentwicklung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken Drs. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris und Olga Tschumakowa für ihre Unterstützung. Die FlexStation 3-System ist Teil des UTHSC Cytodynamic Imaging Facility. Wir danken auch Drs. Ardem Patapoutian und Michael Bandell vom Scripps Research Institute und Genomics Institute der Novartis Research Foundation (GNF) für die Bereitstellung der HEK293-hTRPA1 stabile Zelllinie. Die Forschung wird zum Teil durch Zuschüsse aus NIH (GM081658 zu MXZ) und Texas Medical Center Digestive Diseases Center (HH) und Mission Connect / TIRR Foundation (HH) unterstützt.

1. Zellpräparationen in 96-Well-Platten Für HEK293-Zellen transient mit menschlichen TRPA1 cDNA trasfected <ol><li> HEK293-Zellen sind für 1-2 Tage in Minimal Essential Dulbecco Medium (DMEM) mit 4,5 mg / ml Glucose (Thermo Scientific, SH3002201), mit 10% Hitze-inaktiviertem fetalem Kälberserum (Invitrogen, 16000-044) ergänzt, 50 Einheiten angewachsen / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin (Invitrogen, 15140-163). Am Tag der Transfektion sollten die Zelldichte zu erreichen 70-90%. </li><li> Coat 96-Well-Platten mit einer Pipette 50 pl Poly-L-Ornithin (Sigma P3655, 20 pg / ml in sterilem destilliertem Wasser) in jede Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C für mindestens 15 min. Spülen Sie jede Vertiefung einmal mit Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) ohne Mg 2 + und Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). Die Platte kann in der Zellkultur Motorhaube für ein paar Stunden verlassen werden. </li><li> Für jede Vertiefung einer 96-Well-Platte in ein 1,5-ml Eppendorf-Röhrchen 0,2 ug cDNA in 25 ul OPTI-MEM (Invitrogen, 31985-070) zu verdünnen. Scale up anteilig nach der Anzahl von Brunnen, die von der gleichen cDNA transfiziert werden. Auch in einem separaten 1,5-ml Eppendorf-Röhrchen 0,4 ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) in 25 ul OPTI-MEM für jeden gut transfizieren zu verdünnen. Scale-up dieser nach der Gesamtzahl der Brunnen transfiziert werden. </li><li> Kurz Wirbel der verdünnten cDNA und Lipofectamine 2000 und lassen Sie sie bei Zimmertemperatur sitzen für ca. 5 min. </li><li> Übertragen eines gleichen Volumens der verdünnten Lipofectamine 2000 an die Röhre, die verdünnte cDNA, Wirbel enthält, und lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur stehen lassen für 15 min bis 2 Stunden. Während dieser Zeit, übertragen Sie die cDNA / Lipofectamine 2000 Mischung bei 49 ul / well auf die poly-L-Ornithin beschichteten Platte. </li><li> Trypsinize der HEK293-Zellen (Schritt 1,1), count Zelldichte mit einer Zählkammer oder Gräfin automatisierte Zellzahl (Invitrogen, C10227), und übertragen die gewünschte Menge an Zellen (in der Regel etwa ~ 125,000-150,000 Zellen / well) zu einem 15-ml sterile konisch-bottom Zentrifugenröhrchen. Bei 1000 x RPM für 5 min. Die Zellen bei ~ 1,250,00-1,500,000 Zellen / ml in DMEM Kulturmedium mit 10% Hitze-inaktiviertem fötalem Rinderserum, aber ohne Antibiotika. </li><li> Dispense 98 ul Zellsuspension in jede Vertiefung, dass die cDNA-Lipofectamine 2000 Mischung mit einem Mehrkanal-Pipette oder die MICROFILL Microplate Dispenser (Bio-Tek) enthält. Lassen Sie die Platte in der Haube sitzen für mindestens 30 min, bevor es auf die befeuchtete Zellkulturbrutschrank. Bei 37 ° C, 5% CO 2 für 20-44 Stunden. </li></ol> Für HEK293-Zellen stabil exprimiert TRPA1 <ol start="8"><li> Folgen Sie Schritt 1.2 zu beschichten 96-Well-Platten. </li><li> Die induzierbaren HEK293-hTRPA1 Zelllinie wurde freundlicherweise von Dr. A. Patapoutian (The Scripps Research Institute) zur Verfügung gestellt und gepflegt in dem gleichen Medium wie die Wildtyp-HEK293-Zellen (Schritt 1,1), aber ergänzt mit 5 pg / ml Blasticidin (Invitrogen, A1113902) und 50 pg / ml Hygromycin B (Invitrogen, 10687010). Wenn die Zelldichte etwa 90% erreicht, trypsinize Zellen zählen Zelldichte und zentrifugieren Sie die gewünschte Menge an Zellen bei 1000 x RPM für 5 min. Die Zellen in einer Dichte von ~ 1.000.000 Zellen / ml in der gleichen Kulturmedium mit Doxycyclin (Fisher, BP26535, 0,25 pg / ml) ergänzt. </li><li> Dispense die Zellsuspension auf Poly-L-Ornithin beschichteten Platten bei 100 ul / well mit einem Mehrkanal-Pipette oder die MICROFILL (Bio-Tek). Lassen Sie die Platte in der Haube sitzen für mindestens 30 min, bevor es auf die befeuchtete Zellkulturbrutschrank. Bei 37 ° C, 5% CO 2 für 16 bis 24 Stunden. </li></ol> 2. Lösungen <ol><li> Hanks Salzlösung (HBSS) ist als die extrazelluläre Lösung verwendet. Es enthält (in mM): 137 NaCl, 5,4 KCl, 0,25 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 1,3 CaCl 2, 1,0 MgSO 4, 1,0 MgCl 2, 10 Glucose, 10 HEPES mit pH-Wert eingestellt auf 7,4 mit 1 N NaOH). </li><li> Fluo-4-Assay-Puffer enthält 2 mM in HBSS Probenecid. Machen Sie 250 mM Lager Probenecid (Sigma, P8761) in 0,5 N NaOH. Verdünnen, um HBSS bei einem Verhältnis von 1:125. Nachstellen pH auf 7,4 mit 1 N HCl. </li></ol> 3. Zell-Beladung mit Fluo-4 AM <ol><li> 1 mg Fluo-4 AM (Invitrogen, F14202) in 912 ul wasserfreiem DMSO zu einer Stammlösung von 1 mM zu machen. Die Fluo-4 AM Stammlösung bei -20 ° C für mindestens einen Monat gelagert werden. </li><li> Mix 10 ul 1 mM Fluo-4 AM mit 10 ul Pluronic F-127 (Invitrogen, P3000MP, 20% (w / v) Lösung in DMSO) und dann den gesamten Inhalt auf 5 ml Fluo-4-Assay-Puffer (Schritt 2,2) ergänzt mit 0,1% Rinderserumalbumin (Sigma, A9418). </li><li> Wash-Zellen in 96-well-Platten kultiviert (Schritt 1,7 oder 1,10) mit HBSS auf 80 ul / well 2 mal mit einem Mikrotiterplatten-Scheibe (wie ELx405TM von Bio-Tek). </li><li> Fügen Sie die Fluo-4 AM loading-Lösung (Schritt 3,2) bei 50 ul / Vertiefung mit einem Mehrkanal-Pipette oder die MICROFILL (Bio-Tek) und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Wash-Zellen 3 mal mit dem Fluo-4-Assay-Puffer (Schritt 2.2.) Mit dem ELx405TM Mikroplatten Washer. Nach der letzten Waschung, verlassen 80 ul der Fluo-4-Assay-Puffer in jede Vertiefung. </li></ol> 4. Herstellung der Verbindung Platte <ol><li> Während der 1 Std. Zelle Belastungsdauer, bereiten eine Reihe von 3x Verdünnungen von Agonisten (oder Antagonisten) 3x des gewünschten Endkonzentrationen in der Fluo-4-Assay-Puffer. </li><li> Pipette 250-300 ul der verdünnten Verbindung Lösungen für eine 96-Well-Platte Verbindung. Ordnen Sie die serielle Verdünnungen einer Verbindung und die entsprechenden positiven und negativen Kontrollen in der gleichen Spalte der Verbindung Platte haben, wann immer es möglich ist, weil FlexStation 3 lautet einer einzigen Spalte zu einer Zeit. </li></ol> 5. Mikrotiterplatten in FlexStation 3 <ol><li> Schalten Sie das System (FlexStation 3, Computer, und die SoftMax Pro 5.2-Software) </li><li> Sparen Sie das Experiment mit einem neuen Dateinamen. Auf der Set-up, wählen FLEX-Modus und geben Sie die folgenden Werte: </li></ol> Protokoll Nr. 1, agonistische Wirkung <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table1.jpg" alt="Tabelle 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tabelle 1"> Protokoll Nr. 2, Antagonist Wirkung <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table2.jpg" alt="Tabelle 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tabelle 2"><ol start="3"><li> Legen Sie einen neuen Tipp-Box, Verbindung Platte und das Lesen Platte auf die entsprechenden Fächer in FlexStation 3 und klicken Sie auf "read"-Taste. Die FlexStation 3 wird eine Spalte in einer Zeit gelesen, und fügen Sie Verbindungen zu den vorprogrammierten Zeitpunkten ohne Unterbrechung der Lektüre. Es dauert ca. 3 min (5 min zu Protokoll Nr. 2) zu Ende lesen eine Spalte und die Maschine wird weiter in die nächste Spalte mit der Verbindung Ergänzungen durchgeführt, wie durch den Benutzer in Schritt 5.2 programmiert, bis alle Spalten gelesen werden gelesen. </li></ol> 6. Datenanalyse <ol><li> Experimentelle Daten können verarbeitet werden direkt über die SoftMax Pro 5.2 Software oder kopiert und in einem beliebigen Tabellenkalkulationsprogramm wie Microsoft Excel werden. Konzentrations-Wirkungs-Kurve eines TRPA1 Agonist Flufenaminsäure (FFA) wird unter Verwendung der folgenden kleinsten Quadrate Routine. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq1.jpg" alt="Gleichung 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Gleichung 1"> , Wobei Y der beobachteten Reaktion ist, Y max die normierte maximale Reaktion ist, C die entsprechenden Wirkstoffkonzentration ist, EC 50 die Konzentration, die eine halbmaximale Reaktion hervorgerufen, und n H ist die scheinbare Hill-Koeffizient. Konzentrations-Hemmung Kurve für einen vermeintlichen TRPA1 Antagonist Verbindung A wird durch die Verwendung einer festen Konzentration von FFA (100 uM), und die schrittweise Erhöhung der Konzentration der Verbindung A IC 50-Wert der Verbindung A wird von der kleinsten Quadrate, die wie folgt berechnet erhalten Gleichung. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq2.jpg" alt="Gleichung 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Gleichung 2"> , Wobei Y der beobachteten Reaktion und Y max ist Peak-Ansprechen normalisiert [Ant] ist die entsprechende Verbindung A die Konzentration, ist IC 50 der Antagonist-Konzentration, die eine halbmaximale Hemmung der FFA-evozierte produziert und n H ist die scheinbare Hill Koeffizient. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: TRPA1 ist ein Ca 2 +-permeable Kationen-Kanal, Aktivierung, die Calcium-Einstrom, die von der Ca 2 +-sensitiven Farbstoffs, Fluo-4 (1-2) nachgewiesen werden kann führt. Ein HEK293-hTRPA1 stabile Zelllinie wurde verwendet, um die Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen von TRPA1 Agonisten und Antagonisten zu studieren. Die Zellen wurden mit Fluo-4 AM geladen, platziert in 80 ul des Assay-Puffer und liest mit FlexStation 3. Nach der Aufnahme der Grundlinie Fluoreszenz für 30 s wurden 40 ul einer Verdünnungsreihe des TRPA1 Agonist, FFA, jeweils 3x von der gewünschten Endkonzentration, um die Zellen durch ein Multi-Channel-Pipette hinzugefügt enthalten, da ein Teil der Fluidik-Modul von FlexStation 3. Die Fluoreszenz-Änderungen wurden für weitere 180 s. überwacht (- F 0 F), wo F und F 0 sind Fluoreszenz-Werte zum Zeitpunkt der Zins-und dem Beginn der Lektüre, bzw. die relative Fluo-4 Fluoreszenz-Änderungen für jedes Well wurden als AF = ausgedrückt. Vertreter Spuren der Zeit Kurse zur Fluoreszenz Veränderungen als Reaktion auf eine Reihe von FFA-Konzentrationen sind in Abb.. 1. Hinweis für die letzten vier FFA-Konzentrationen, wobei die maximale Reaktion Ebenen ähnlich sind, die Aktivierung Kinetik deutlich schneller an der höher ist als an der unteren FFA-Konzentrationen ist. Daher unterscheiden diese Unterschiede, die Konzentration - Wirkungs-Beziehung wurde durch Messung der Anfangsgeschwindigkeiten (Steigung) der Fluoreszenz, der bei Zugabe verschiedener Konzentrationen von FFA (Abb. 2) konstruiert. Die Hälfte der maximalen Wirkungive Konzentration (EC 50) der FFA war entschlossen auf 55,4 uM (n = 3). Um zu testen, die vermeintliche TRPA1 Antagonist, Verbindung A, führten wir ein ähnliches Experiment mit dem Protokoll Nr. 2 (Schritt 2). In diesem Fall wurden eine Reihe von Verdünnungen des Antagonisten bei 30 s (40 ul von 3x gewünschten Endkonzentrationen) zugegeben und die FFA wurde 180 s später (60 l bei 300 uM für eine endgültige Konzentration von 100 pM) aufgenommen. Compound A dosisabhängig reduziert die Reaktion der Zellen auf TRPA1 FFA mit einer Hälfte der maximalen Hemmkonzentration (IC 50) von 4,3 uM (n = 3) (Abb. 2). <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Konzentrations-abhängige Aktivierung des menschlichen TRPA1 durch FFA. Die Spuren sind FFA-evozierte Anstieg der Fluoreszenz im Laufe der Zeit (nur Reaktionen in den ersten 60 s gezeigt werden zur besseren Veranschaulichung der schnellen Kinetik der FFA-evozierte Potentiale). Bitte beachten Sie, dass bei höheren Konzentrationen FFA Fluoreszenzerhöhung evoziert mit einer viel schnelleren kinetischen als bei niedrigeren Konzentrationen, obwohl der Peak-Fluoreszenz ähnlich sind. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2 Konzentration -. Wirkungs-Beziehungen für FFA-induzierte Fluoreszenz verändern und Verbindung A-induzierten Hemmung der FFA Reaktion in menschlichen TRPA1 stabil in HEK293 Zellen exprimiert. Δ, die Konzentration - Wirkungs-Beziehung der FFA wurde durch Messung der Anfangsgeschwindigkeiten (Steigung) der normierten Fluoreszenz-Anstieg bei Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von FFA bestimmt. O, Konzentrations-Wirkungs-Beziehung der Inhibition der FFA-evozierte Kalzium Antwort von einem vermeintlichen TRPA1 Antagonist Verbindung A.

<ol><li>Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRPA1+channels+by+fenamate+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).</li>
<li>Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+activates+damage-sensing+TRPA1+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels.</a> Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).</li>
<li>Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+calcium+channels+mediate+neurotransmitter+release+from+peripheral+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons.</a> Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).</li>
<li>Mason, S. A., MacLeod, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+action+potential+duration+and+calcium+regulation+in+males+and+females%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females.</a> Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).</li>
<li>Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-contraction+relationship+in+rat+mesenteric+arterial+smooth+muscle.+Effects+of+exogenous+and+neurogenic+noradrenaline%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline.</a> Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).</li>
<li>Alagarsamy, S., Johnson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+calcium+channel+involvement+in+NMDA-induced+activation+of+NOS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS.</a> Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).</li>
<li>Su, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM7+regulates+cell+adhesion+by+controlling+the+calcium-dependent+protease+calpain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain.</a> J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).</li>
<li>Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+concentrations+during+%22chemical+hypoxia%22+and+excitotoxic+neuronal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury.</a> J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).</li>
<li>George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channel+activation+augments+NMDA+receptor+function+and+promotes+neurite+outgrowth+in+immature+cerebrocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).</li>
<li>Price, K. L., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FlexStation+examination+of+5-HT3+receptor+function+using+Ca2%2B+-+and+membrane+potential-sensitive+dyes%3A+advantages+and+potential+problems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">FlexStation examination of 5-HT3 receptor function using Ca2+ - and membrane potential-sensitive dyes: advantages and potential problems.</a> J Neurosci Methods. 149, 172-177 (2005).</li>
<li>Laude, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+functional+assays+of+recombinant+IP3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors.</a> Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).</li>
<li>Marincsak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analgesic+drug%2C+tramadol%2C+acts+as+an+agonist+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid-1%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1.</a> Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).</li>
<li>Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+high+throughput+screening+assays+against+three+subtypes+of+Ca%28v%293+T-type+channels+using+molecular+and+pharmacologic+approaches.+Assay+Drug+Dev+Technol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol.</a> 5, 191-203 (2007).</li>
<li>Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-sensing+G+protein-coupled+receptor+mobilizes+calcium+in+human+synovial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).</li>
<li>Boulay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+a+novel+mammalian+homolog+of+Drosophila+transient+receptor+potential+%28Trp%29+involved+in+calcium+entry+secondary+to+activation+of+receptors+coupled+by+the+Gq+class+of+G+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein.</a> J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).</li>
<li>Nanda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+of+adrenergic+receptors+by+measuring+intracellular+calcium+using+the+FlexStation+scanning+fluorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter.</a> Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Intrazelluläre Ca 2 + spielt eine wichtige Rolle in vielen physiologischen und pathologischen Bedingungen, wie die Freisetzung von Neurotransmittern (3), kardiale Aktionspotential (4), Muskelzelle Kontraktion (5), Zell-Signaltransduktion (6-7), und excitotoxic Zelltod ( 8). Die Messung der intrazellulären Ca 2 +-Spiegel hilft, funktionelle Veränderungen der Ca 2 +-permeable Kanäle in der Plasmamembran oder intrazellulären Organellen und der Beitrag der Aufklärung Ca 2 +...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> FlexStation 3 </td><td> Molecular Devices </td><td> FLEX3 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Well, FlexStation Pipettenspitzen </td><td> Molecular Devices </td><td> 9000-0912 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Well-Platten </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 655090 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Well Klare Flachbodenplatten </td><td> Costar </td><td> 3595 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12430-104 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4 AM </td><td> Invitrogen </td><td> F14202 </td><td></td></tr><tr><td> PluronicF-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-Ornithin </td><td> Sigma </td><td> P36551 </td><td></td></tr><tr><td> Probenecid </td><td> Sigma </td><td> P8761 </td><td></td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td></td></tr></tbody></table>

zellbasierte calcium-assay für mittel-bis high-throughput-screening von trp-kanal-funktionen mit flexstation 3

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

Die Molecular Devices &quot;FlexStation 3 ist ein Tischgerät Multi-Mode Mikroplatten-Reader mit einer automatisierten Fluoreszenz-Messung in Multi-Well-Platten. Es ist ideal für mittel-bis High-Throughput-Screens in einem akademischen Umfeld. Es verfügt über einen integrierten Fluid-Transfer-Modul mit einer Multi-Channel-Pipette und die Maschine liest eine Spalte in einer Zeit, zur Fluoreszenz Veränderungen einer Vielzahl von fluoreszierenden Reagenzien-Monitor ausgestattet. Zum Beispiel hat FlexStation 3 wurde verwendet, um die Funktion der Ca 2 +-permeable Ionenkanäle und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren durch die Messung der Veränderungen der intrazellulären freien Ca 2 +-Spiegel zu studieren. Transient receptor potential (TRP)-Kanäle sind eine große Familie von nicht selektiven Kationen-Kanäle, die eine wichtige Rolle spielen in vielen physiologischen und pathophysiologischen Funktionen. Die meisten der TRP-Kanäle sind Kalzium durchlässig und induzieren Calcium-Einstrom bei Aktivierung. In diesem Video zeigen wir die Anwendung der FlexStation 3, um die pharmakologische Profil der TRPA1 Kanal, einen molekularen Sensor für zahlreiche schädliche Reize zu studieren. HEK293-Zellen transient oder stabil exprimieren menschliches TRPA1 Kanäle, in 96-well-Platten kultiviert, sind mit einem Ca 2 +-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4, und Echtzeit-Fluoreszenz-Veränderungen in diesen Zellen geladen werden, vor und während der Anwendung gemessen ein TRPA1 Agonist mit dem FLEX-Modus des FlexStation 3. Die Wirkung eines mutmaßlichen TRPA1 Antagonisten wurde ebenfalls untersucht. Die Daten stammen aus der SoftMax Pro-Software übertragen, um Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen von TRPA1 Aktivatoren und Inhibitoren konstruieren.

Dieses Video gibt einen detaillierten Protokoll für die Untersuchung der pharmakologischen Profil des menschlichen TRPA1 Kanäle mit FlexStation 3. Das Protokoll umfasst Einzelheiten Zellpräparation, Farbstoff Laden und Betrieb der Mikroplatten-Reader, FlexStation 3.

Zellbasierte Calcium-Assay für Mittel-bis High-Throughput-Screening von TRP-Kanal-Funktionen mit FlexStation 3

Die FlexStation 3 von Molecular Devices ist ein Multi-Mode-Mikroplattenlesegerät für den Tischaufsatz, das eine automatisierte Fluoreszenzmessung in Multi-Well-Platten ermöglicht. Sie ist ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Anwendung des Flex Station Three zur Untersuchung des pharmakologischen Profils des transienten Rezeptorpotentials oder des TRPA1-Kanals zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen, die TRPA1-Kanäle exprimieren, in 96-Well-Mikrotiterplatten vorbereitet werden.Nachdem die Zellen in einem Mikroplattenwascher gewaschen wurden, werden sie mit dem kalziumsensitiven fluoreszierenden Farbstoff beladen. Fluoh 4:00 AM – eine Zellbeladungsphase – wird anschließend durch mehrere zusätzliche Waschschritte ergänzt. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Substanzplatte vorzubereiten, einschließlich eines Trip, eines Agonisten und eines putativen Trip, eines Antagonisten.Im letzten Schritt werden die Softwareparameter für das Plattenlesen im Flex Station Three-System eingerichtet. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die Dosis-Wirkungs-Beziehungen für die Aktivierung von Trip A1 durch Fluorphonsäure sowie die Hemmung durch die antagonistische Verbindung A zeigen. Obwohl diese Methode Einblicke in Aktivierungsmechanismen von 21 durch Messung des Calciumeinstroms ermöglicht, kann sie ebenfalls zur

cell-based-calcium-assay-for-medium-to-high-throughput-screening-trp

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Verfahren zum Entwickeln und Validieren eines quantitativen Fluoreszenz-Assay zur Messung der Aktivität von Kalium Einwärtsgleichrichter (KIR) Kanäle für das Hochdurchsatz-Screening Verbindung wird vorgestellt.

High-throughput Screening niedermolekularer Modulatoren von Inward Gleichrichter-Kaliumkanäle

Die hier beschriebene Fluoreszenz-basierten Calciummobilisierungsassay ist ein Medium-Durchsatz Rückwärts pharmakologischen Screening-System für die Identifizierung von funktionell aktivierenden Liganden (n) der Orphan-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs).

Charakterisierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren durch eine Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay

Hier präsentieren wir Techniken zur Abbildung lokaler IP3-vermittelter Ca2+-Ereignisse mittels Fluoreszenzmikroskopie in intakten Säugetierzellen, die mit Ca2+-Indikatoren beladen sind, zusammen mit einem Algorithmus, der die Identifizierung und Analyse dieser Ereignisse automatisiert.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Wir präsentieren Protokolle für die Anwendung unseres gezielten genetisch codierten Calciumindikators (GECI) CatchER + zur Überwachung von schnellen Calcium-Transienten im endoplasmatischen / sarkoplasmatischen Retikulum (ER / SR) von HEK293 und Skelettmuskel-C2C12-Zellen mittels Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie. Ein Protokoll für die in situ K d Messung und Kalibrierung wird ebenfalls diskutiert.

Monitoring ER / SR Calcium Release mit dem gezielten Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor Catcher<sup&gt; +</sup

Techniken zur Erzeugung einer Bibliothek von kurzen Peptiden, die Mastzellen über den MRGPRX2-Rezeptor aktivieren können, werden beschrieben. Zugehörige Techniken sind einfach, kostengünstig und können auf andere Zellrezeptoren ausgeweitet werden.

Screening von Peptiden, die MRGPRX2 mit engineered HEK Cells aktivieren

Das vorliegende Protokoll beschreibt die rein optische Kontrolle und Beobachtung der ausgelösten zellulären Aktivität in iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten (iPSC-CMs) für Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening und Toxizitätstests. Multiparametrische Quantifizierung phänotypischer Muster in Zeit und Raum werden gezeigt. Langzeitwirkungen von Medikamenten über Stunden oder sequentielle Messungen über Tage werden nachgewiesen.

Optische Hochdurchsatzkontrolle und Aufzeichnung des Kalziumsignals in iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten für Toxizitätstests und phänotypisches Arzneimittelscreening

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Untersuchung von elektrogenen Membranproteinen durch Messung von Änderungen des Membranpotentials. Dieser Assay bietet eine Plattform für die funktionelle Auslesung mehrerer Ionenkanäle, die endogen in Epithelzelllinien exprimiert werden.

Ein fluoreszenzbasierter Assay des Membranpotentials zur Hochdurchsatz-Funktionsuntersuchung zweier endogener Ionenkanäle in zwei Epithelzelllinien

In dieser Arbeit wird ein intrazellulärer Hochdurchsatz-Calciumfluoreszenz-Assay für 384-Well-Platten beschrieben, um kleine Molekülbibliotheken auf rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) zu screenen. Das Ziel, der Kinin-Rezeptor aus der Rinderpestzecke Rhipicephalus microplus, wird in CHO-K1-Zellen exprimiert. Dieser Assay identifiziert Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der gleichen Zellen in einem "Dual-Addition"-Assay.

Ein "Dual-Addition"-Calciumfluoreszenz-Assay für das Hochdurchsatz-Screening von rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

Das pharmakologische Targeting von Ionenkanälen ist ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung solider Tumore. Es werden detaillierte Protokolle zur Charakterisierung der Ionenkanalfunktion in Krebszellen und zur Untersuchung der Auswirkungen von Ionenkanalmodulatoren auf die Lebensfähigkeit von Krebs bereitgestellt.

Screening von Ionenkanälen in Krebszellen

Es wurde ein verbessertes Protokoll für einen Kalziummobilisierungsassay mit Endothelzellen entwickelt, der zur Identifizierung von Liganden von Protease-aktivierten Rezeptoren (PARs) verwendet wird. Das neue Protokoll reduziert die Gesamttestzeit um 90-120 Minuten und liefert reproduzierbare Konzentrations-Wirkungs-Kurven.

Charakterisierung von Modulatoren von Protease-aktivierten Rezeptoren mit einem Calciummobilisierungsassay unter Verwendung eines Plattenreaders

In diesem Artikel wird eine Methode zur quantitativen Echtzeitüberwachung der Calciumionenkonzentration (Ca2+) in Zellen unter Verwendung von Einzelzell-Ca2+ -Bildgebung mit dem Fura-2/AM-Farbstoff vorgestellt. Diese Technik ermöglicht eine effiziente Farbstoffbeladung und eine genaue Berechnung des Ca2+ -Gehalts durch Fluoreszenzintensitätsverhältnisse, was sie zu einem einfachen und schnellen Ansatz für Forschungsanwendungen macht.

Einzelzell-Calcium-Imaging zur Untersuchung der Aktivierung von Calcium-Ionenkanälen

Lernen Sie einen zellbasierten Calcium-Assay zur Untersuchung von TRPA1-Kanälen mit dem FlexStation 3. Diese Methode ermöglicht High-Throughput-Screening und pharmakologische Profilierung für die Arzneimittelentwicklung.

Zellbasierte Calcium-Assay für Mittel-bis High-Throughput-Screening von TRP-Kanal-Funktionen mit FlexStation 3

Weitere Videos entdecken