Zellbasierte Calcium-Assay für Mittel-bis High-Throughput-Screening von TRP-Kanal-Funktionen mit FlexStation 3

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Anwendung der Flex Station drei zu demonstrieren, um das pharmakologische Profil des transienten Rezeptorpotentials zu untersuchen oder einen Kanal auszulösen. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen präpariert werden, die einen Trip von einem Kanal in 96 exprimieren. Gut Mikrotiterplatten.

Nach dem Waschen der Zellen in einem Mikroplatten-Wascher werden die Zellen mit dem kalziumempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff beladen. Grippe oh 4:00 Uhr, auf eine Zellladeperiode folgen dann mehrere weitere Wäschen. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Verbundplatte vorzubereiten, einschließlich eines Trips, eines One-Agonisten und eines mutmaßlichen Trips, eines One-Antagonisten.

In einem letzten Schritt werden die Softwareparameter für die Plattenlesung im System Flex Station three eingerichtet. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Dosis-Wirkungs-Beziehungen für die Aktivierung von Trip A durch Grippe-Phonemsäure und die Hemmung durch die antagonistische Verbindung A zeigen. Obwohl diese Methode durch Messung des Kalziumeinstroms Einblicke in 21 Aktivierungsmechanismen geben kann. Es kann auch angewendet werden, um die Funktionen anderer kalziumdurchlässiger Augenkanäle und tiefer proteingekoppelter Rezeptoren unter Verwendung von kalziumempfindlichen gefrorenen Farbstoffen oder Maly-Potential-Farbstoffen zu untersuchen.

Der Hauptvorteil dieser Taktik gegenüber bestehenden Methoden wie Calcium-Imaging und manuellem Patch-Mapping besteht darin, dass diese zeitsparende Technik ein Hochdurchsatz-Screening für die Funktion und Modulation der Calciumformel, der Eisenkanäle und anderer ca-mobilisierender Rezeptoren ermöglicht. Vor Beginn dieses Protokolls wachsen HEC 2 93 Zellen, stabil transfiziert mit Trip A eins bis zu einer Dichte von 70 bis 90%, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Um mit der Zellvorbereitung für den Calcium-Assay zu beginnen, beschichten Sie 96-Well-Platten, indem Sie 50 Mikroliter Poly-L-Ornithin pipettieren und die Platten jeweils mindestens 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Nach der Inkubation spülen Sie die Zellen einmal mit der phosphatgepufferten Kochsalzlösung von KO Nach dem Trypsin überführen die HEC 2 93-Zellen die gewünschte Zellmenge in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen mit konischem Boden und zentrifugieren sie. Die Stichprobe. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das resultierende Zellpellet

Im DMEM-Kulturmedium, das mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum ergänzt ist, geben Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. Lassen Sie die Platte mit einer Mehrkanalpipette mindestens 30 Minuten in der Haube ruhen, bevor Sie sie für 20 bis 44 Stunden in den befeuchteten Zellkultur-Inkubator legen. Für die Vorbereitung des Calciumassays bereiten Sie zunächst Lösungen vor, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.

Mischen Sie nach der Zubereitung 10 Mikroliter einer millimolaren Grippe oh 4:00 Uhr mit 10 Mikrolitern Onic. F1 27, übertragen Sie den gesamten Inhalt auf fünf Milliliter Grippe. Oh vier Assay-Puffer, ergänzt mit 0,1 % Rinderserumalbumin.

Waschen Sie als Nächstes die in 96 gewachsenen Zellen. Well-Platten mit HBSS bei 80 Mikrolitern pro Vertiefung zweimal mit einem Mikroplatten-Wascher nach dem Waschen auffüllen, die Grippe oh 4:00 AM Ladelösung mit 50 Mikrolitern pro Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette hinzufügen und die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Während der einstündigen Zellladeperiode wird eine Serie von drei x Lösungen von Agonisten, eine Serie von drei x Lösungen von Antagonisten und ein großes Volumen von 300 Mikromolaren Agonisten in der Grippe OH Four Assay Pufferpipette hergestellt.

300 Mikroliter der verdünnten Verbundlösungen in eine 96-Well-Verbundplatte geben. Die serielle Verdünnung einer Verbindung und die entsprechenden Positiv- und Negativkontrollen sind nach Möglichkeit in derselben Spalte der Verbindungsplatte zu veranlassen. Während die Flex-Station drei jeweils eine einzelne Säule ablestet, pipettieren Sie als letzten Zellvorbereitungsschritt 300 Mikroliter der 300-mikromolaren Agonistenlösung neben jeder Vertiefung, die den Antagonisten enthält.

Waschen Sie die geladenen Zellen nach dem letzten Waschen dreimal mit dem Grippe- oder Vier-Säuren-Puffer mit dem Mikroplattenwascher. Lassen Sie 80 Mikroliter der Grippe oh vier Säuren Puffer in jeder Vertiefung. Um mit dem Lesen der Platten zu beginnen, schalten Sie das Flex Station three-System ein und rufen Sie die Software soft max Pro 5.2 auf.

Speichern Sie das Experiment unter einem neuen Dateinamen beim Setup. Wählen Sie den Flex-Modus und geben Sie die Parameter ein, um die Agonisten- und Antagonistenwirkung zu messen, wie in der schriftlichen Prozedur aufgeführt. Legen Sie anschließend eine neue Tippbox, die Compoundplatte und die Leseplatte in die entsprechenden Fächer der Flexstation. Drei.

Beginnen Sie mit dem Lesen der Platte, indem Sie auf die Schaltfläche "Lesen" in der Soft Max Pro-Software klicken. Die Flex Station three liest eine Spalte nach der anderen und fügt Verbindungen zu den vorprogrammierten Zeitpunkten hinzu, ohne die Messung zu unterbrechen. Sobald der Lauf abgeschlossen ist, können die Versuchsdaten direkt mit der Soft Max PRO-Software verarbeitet oder kopiert und in ein beliebiges Tabellenkalkulationsprogramm wie Microsoft Excel eingefügt werden.

Um die Daten zu analysieren, generieren Sie Konzentrationsreaktionskurven für den Trip, eine One-Agonist-Grippe-Phonemsäure, und für den mutmaßlichen Trip eine Ein-Antagonisten-Verbindung unter Verwendung der Anpassung der kleinsten Quadrate, wie in der schriftlichen Prozedur Trip beschrieben. A One ist ein kalziumdurchlässiger Kationenkanal, dessen Aktivierung zu einem Kalziumeinstrom führt, der durch den kalziumempfindlichen Farbstoff flu oh 4:00 AM nachgewiesen werden kann. Repräsentative Spuren der Zeitverläufe bis hin zu Fluoreszenzänderungen als Reaktion auf eine Reihe von Grippe-Phonemsäure- oder FFA-Konzentrationen sind bei höheren Konzentrationen dargestellt. Die FFA-evozierte Fluoreszenz steigt mit einer viel schnelleren Kinetik an als bei niedrigeren Konzentrationen trotz ähnlicher Spitzenfluoreszenzwerte.

Um diese Unterschiede zu unterscheiden, wurde die Konzentrations-Wirkungs-Beziehung konstruiert, indem die Anfangsraten des Fluoreszenzanstiegs gemessen wurden. Nach Zugabe unterschiedlicher Konzentrationen von FFA wurde die halbe maximale effektive Konzentration von FFA auf 55,4 Mikromolar bestimmt. Die Konzentrations-Wirkungs-Beziehung der Hemmung von FFA, die durch einen mutmaßlichen Trip einer Ein-Antagonisten-Verbindung A hervorgerufen wurde, wird ebenfalls gezeigt.

Eine Dosis reduzierte unabhängig voneinander das Ansprechen der Trip-A-Ein-Zellen auf FFA mit einer halbmaximalen Hemmkonzentration von 4,3 Mikromolaren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die pharmakologischen Profile von Triple A One und verwandten Kanälen mit der Flaggenstation Drei untersuchen können.