Die Quantifizierung der Wirkung als Agonist am G-Protein-gekoppelte Rezeptoren

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die relative Affinitätskonstante KB eines Agonisten für den aktiven Zustand eines Rezeptors durch Analyse seiner Konzentrations-Wirkungs-Kurve zu schätzen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Konzentrations-Wirkungs-Kurven einer Gruppe von Agonisten zur Auslösung einer Antwort an einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor gemessen werden. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Werte für eemax und EC 50 der Agonisten mithilfe einer nichtlinearen Regressionsanalyse zu bestimmen.

Diese Werte werden anschließend zur Berechnung anfänglicher Parameterschätzungen für die nachfolgende nichtlineare Regressionsanalyse unter Verwendung des operationalen Modells genutzt. Im letzten Schritt werden relative Schätzungen der Affinitätskonstanten von Agonisten für den aktiven Zustand des Rezeptors durch globale nichtlineare Regressionsanalyse ihrer Konzentrations-Wirkungs-Kurven erhalten. Letztendlich kann unter Verwendung einer modifizierten Form des operationalen Modells die Affinitätskonstante eines Agonisten für den aktiven Zustand eines Rezeptors, angegeben relativ zu der eines anderen Agonisten, durch globale nichtlineare Regressionsanalyse ihrer Konzentrations-Wirkungs-Kurven geschätzt werden.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Arzneimittelforschung zu beantworten, beispielsweise, ob ein Agonist eine Selektivität für einen bestimmten Signalweg aufweist. In der Regel haben Personen, die mit dieser Methode neu beginnen, Schwierigkeiten aufgrund der Details der mathematischen Analyse. Zur Schätzung relativer agonistischer KB-Werte ist eine Serie von mindestens zwei Konzentrations-Wirkungs-Kurven erforderlich.

Eine Erläuterung der Überlegungen für solche Experimente finden Sie im schriftlichen Protokoll. Nachdem die Wirkstoffkurven erhalten wurden, subtrahieren Sie die basale Reaktion von der in Gegenwart jeder Konzentration des Agonisten gemessenen Reaktion, und beginnen Sie damit, die Daten aus den Konzentrations-Wirkungs-Experimenten in eine Datentabelle einzugeben. In der Prism-Software werden alle logarithmierten Agonistenkonzentrationen in die Spalte eingegeben, die mit X gekennzeichnet ist. Die Messwerte der Reaktion für den Agonisten, der die größte maximale Wirkung oder den höchsten Emax-Wert aufweist, werden in Spalte A eingetragen, und die Werte für die anderen Agonisten werden in die benachbarten, alphabetisch fortlaufenden Spalten eingetragen.

Geben Sie die Messwerte der Konzentrations-Wirkungs-Kurven in Unter-Spalten einer gegebenen Buchstaben-Spalte ein. Wählen Sie das Diagrammblatt aus, auf dem die Daten dargestellt sind, und wählen Sie „analysieren“, um die Daten mittels nichtlinearer Regressionsanalyse unter Verwendung der Gleichung mit variabler Steigung zu analysieren. Beschränken Sie den Parameter „bottom“ auf null und führen Sie die Regressionsanalyse durch. Notieren Sie die Parameter „top“ und „log EC 50“ zur späteren Verwendung bei der Berechnung der Anfangswerte für die Parameterabschätzung.

Zur Berechnung der anfänglichen Parameterschätzungen weisen Sie dem beobachteten log tau K den negativen log EC50-Wert des Standardagonisten zu. Berechnen Sie anschließend den log RAI-Wert jedes Testagonisten als Logarithmus der Größe, die sich aus dem Produkt des eemax-Werts des Testagonisten multipliziert mit dem EC50 des Standardagonisten, dividiert durch das Produkt des emax-Werts des Standardagonisten multipliziert mit dem EC50 des Testagonisten, ergibt. In dieser Gleichung werden die Parameter des Standardagonisten mit einem Apostroph gekennzeichnet.

Weisen Sie dann die Logarithmus-Affinitätskonstante des Testagonisten dem negativen Logarithmus ihrer jeweiligen EC-Werte zu. Stellen Sie nach der Dateneingabe in Prism sicher, dass die Daten für den Agonisten mit dem höchsten EMAX-Wert in Spalte A eingegeben werden. Dieser Agonist wird nun als Standard bezeichnet, während die anderen Agonisten als Testagonisten bezeichnet werden. Geben Sie anschließend eine benutzerdefinierte Gleichung „log RAI“ in mehreren Zeilen in Prism ein.

In diesem Fall umfasst die benutzerdefinierte Gleichung insgesamt fünf Agonisten. Geben Sie die anfänglichen Parameterschätzungen für die Sperre R und die Affinitätskonstante der Testagonisten ein. M sis erhält den EMAX-Wert des Standardagonisten zugewiesen, und M erhält den Wert eins.

Geben Sie nun die anfänglichen Parameterschätzungen der Log-RAI-Werte der Testagonisten ein. Wenden Sie Parameterbeschränkungen an, indem Sie log K eins auf null festlegen und log GR, m, sis und M für alle Datensätze auf einen gemeinsamen Wert setzen. Starten Sie anschließend die nichtlineare Regressionsanalyse.

Die Ergebnisse liefern die beobachteten Werte für log K und log RAI der Testagonisten zur Schätzung der Agonisten-KB-Werte in absoluten Einheiten inverser molaren Einheiten. Zellbasierte In-vitro-Assays, die eine konstitutive Rezeptoraktivität aufweisen, werden verwendet. Wählen Sie Agonisten aus und planen Sie das Experiment wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Berechnen Sie die konstitutive Rezeptoraktivität und die Antwort auf jede Konzentration des Agonisten als gemessene Antwort abzüglich der basalen Antwort in Zellen, die nicht mit dem hier gezeigten Rezeptor transfiziert wurden. Hier dargestellt sind Antworten auf verschiedene Agonisten, die auf diese Weise für einen Signalweg berechnet wurden, der eine sehr geringe konstitutive Aktivität aufweist, für die vorläufige Analyse.

Zunächst werden die Daten wie für die nicht konstitutive Aktivität beschrieben in Prism eingegeben. Akzeptieren. Tragen Sie außerdem die durch die konstitutive Rezeptoraktivität hervorgerufene Antwort in den entsprechenden Spalten mit Buchstaben in der Zeile ein, die einer Log-Agonistenkonzentration von minus 20 entspricht. Hier wird ein großer negativer Logarithmus eingegeben, um einer Agonistenkonzentration von null zu approximieren.

Analysieren Sie die Daten wie zuvor, mit der Ausnahme, dass für die konstitutive Aktivität der Parameter „Untergrenze“ so eingeschränkt werden sollte, dass er für alle Datensätze gemeinsam verwendet wird. Notieren Sie den gemeinsam genutzten Parameter sowie die Parameter „Obergrenze“ und log EC für jeden Agonisten. Nachdem die Log-Affinitätskonstante des Standardagonisten in separaten Experimenten bestimmt wurde, berechnen Sie die Anfangsschätzung des beobachteten log K-Werts jedes partiellen Testagonisten als Logarithmus des Ausdrucks, der sich aus der Differenz zwischen dem emax-Wert des Standardagonisten und dem Testagonisten dividiert durch das Produkt aus EC 50 und der Differenz zwischen dem eemax-Wert des Standardagonisten und der konstitutiven Antwort ergibt.

Berechnen Sie die Anfangsschätzung von log KB für jeden Agonisten und die Anfangsschätzung von log T cis, um die KB-Werte des Agonisten abzuschätzen. Geben Sie die Daten in Prism ein und anschließend eine benutzerdefinierte Gleichung. Geben Sie log KB wie hier für den Fall von zwei Agonisten gezeigt in mehreren Zeilen in Prism ein.

Geben Sie als Nächstes die anfänglichen Parameterschätzungen ein, indem Sie die Affinitätsstellung jedes Agonisten angeben. Der log T sis schätzt die M sis-Schätzung, und die M-Schätzung; M sis erhält den EMAX-Wert des Standardagonisten, und M erhält den Wert eins. Geben Sie abschließend die anfänglichen Schätzungen von log kb ein.

Wenden Sie Parameterbeschränkungen an, indem Sie log K eins auf seinen zuvor bestimmten Wert fixieren und log T sis, m sis sowie M auf einen gemeinsamen Wert für alle Datensätze setzen. Starten Sie die nichtlineare Regressionsanalyse. Die Ergebnisse liefern das log KB des Standardagonisten, das beobachtete log K sowie die log KB-Werte der partiellen Agonisten.

Die maximale Antwort des Systems, der Log T cys-Wert für den freien Rezeptorkomplex und der Transduktor-Steigungsfaktor im hier gezeigten operativen Modell beziehen sich auf die durch muskarinische Agonisten induzierte Hydrolyse von Phosphoinositiden in Zellen der chinesischen Hamsterovarie, die stabil den M-drei-muskarinischen Rezeptor exprimieren. Die Konzentrations-Wirkungs-Kurven ausgewählter muskarinischer Agonisten wurden in diesem Test gemessen, und die Daten wurden wie hier beschrieben analysiert, um den KB-Wert jedes Agonisten relativ zu dem von Oxo Tremaine M zu schätzen. Die theoretischen Kurven stellen die Kleinste-Quadrate-Anpassung der Regressionsgleichung an die Daten dar. Die log RAI-Schätzungen sind für Kabale, A Recline, Pilocarpin und McNeil angegeben.

Eine 3, 4 3. Die entsprechenden Schätzungen der maximalen Systemantwort und des Steigungsfaktors des Wandlers wurden bestimmt. Die beobachteten log K-Werte der Agonisten wurden ebenfalls für jeden dargestellten Agonisten ermittelt.

Hier sind die Ergebnisse von Experimenten zur muskarinergen Agonisten-induzierten Hydrolyse von Phosphoinositiden in HC 2 93-Zellen. Die stabile Expression von G alpha 15 und die transiente Expression des M-drei-muskarinergen Rezeptors führten zu einer Zunahme der basalen Phosphoinositid-Hydrolyse, die auf eine konstitutive Rezeptoraktivität zurückgeführt wurde. Die Daten wurden analysiert, um die Log KB-Werte von Oxo Tremaine M und MacNeil, A 3 43 zu schätzen.

Die theoretischen Kurven stellen die Kleinste-Quadrate-Anpassung der Regressionsgleichung an die Daten dar. Die log KB-Schätzungen werden für Oxo Tremoring M und McNeil, A 3 43 angegeben. Der geschätzte K-Wert des beobachteten Werts von McNeil A 3 43 wurde ebenfalls bestimmt.

Wenn man diese Datenanalysetechnik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Anwendung in wenigen Minuten durchgeführt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man sowohl relative als auch tatsächliche KB-Werte aus den Konzentrations-Wirkungs-Kurven von Agonisten zur Auslösung einer Antwort in der nachgeschalteten Signalkaskade eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors abschätzen kann.