Name: Autologe endotheliale Vorläuferzellen Cell-Sätechnik und Biokompatibilitätstestung Für Herz-Kreislauf-Geräte in Großtiermodell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Erfahren Sie die Zellbesäumung von Titanimplantaten mit autologen endothelialen Vorläuferzellen zur Verbesserung der Biokompatibilität und Thromboseprävention im Schweinemodell. Diese Methode ermöglicht schnelle Anwendung im OP.

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Die Autoren bedanken sich bei Leica Microsystems für ihre wertvollen Ratschläge Bildgebung Titan Abschnitte und Gemini Bio-Produkte danken für die Bereitstellung der Schweine-Serum in dieser Studie verwendet. Wir kommen auch gerne zu den NIH für ihre Unterstützung danken durch Grant &quot;Autologe EPC-Futter auf die Biokompatibilität von Herz-Kreislauf verbessern assist devices&quot;, RC1HL099863-01. Darüber hinaus sind wir dankbar für die National Science Foundation Graduate Research Fellowship der Unterstützung von Alexandra Jantzen. Wir kommen auch gerne zu George Quick, Mike Lowe und Ianthia Parker für die Unterstützung mit vielen Aspekten des chirurgischen Eingriffs und Handhabung unserer Versuchstiere danken. Steven Owen wurde in der Bearbeitung viele Teile unserer Seeding-Gerät von unschätzbarem Wert und Schneiden Titanrohre.

<ol><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+bleeding+and+clotting+in+the+cardiac+surgery+patient%3A+from+vascular+endothelium+to+circulatory+assist+device+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of bleeding and clotting in the cardiac surgery patient: from vascular endothelium to circulatory assist device surface.</a> Circulation. 122, 2068-2077 (2010).</li>
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<li>Arvidsson, S., Askendal, A., Tengvall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+plasma+contact+activation+on+silicon%2C+titanium+and+aluminium%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Blood plasma contact activation on silicon, titanium and aluminium.</a> Biomaterials. 28, 1346-1354 (2007).</li>
<li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biocompatibility+of+titanium+cardiovascular+devices+seeded+with+autologous+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%3A+EPC-seeded+antithrombotic+Ti+Implants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants.</a> Biomaterials. 32, 10-18 (2011).</li>
<li>Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+pig+models+of+venous+thrombosis+mimicking+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease.</a> Thromb Haemost. 89, 256-263 (2003).</li>
<li>Ueberrueck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+ovine+and+porcine+animal+models+for+biocompatibility+testing+of+vascular+prostheses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of the ovine and porcine animal models for biocompatibility testing of vascular prostheses.</a> J Surg Res. 124, 305-311 (2005).</li>
<li>Velik-Salchner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+values+for+thrombelastography+%28ROTEM%29+and+selected+coagulation+parameters+in+porcine+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Normal values for thrombelastography (ROTEM) and selected coagulation parameters in porcine blood.</a> Thromb Res. 117, 597-602 (2006).</li>
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<li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAchneck%2C+HE+%22American+Heart+Association+Scientific+Sessions%2C+Abstract+Oral+Sessions%2C+Medical+Aspects+End+Stage+Heart+Failure%3A+Transplantation+and+Device+Therapies%22">American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies</a>. , (2010).</li>
<li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+titanium+ventricular+assist+device+surfaces+after+gold%2Fpalladium+coating+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy.</a> Microsc Res Tech. 73, 71-76 (2010).</li>
<li>Ford, J. W., Welling, T. H., Stanley, J. C., Messina, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKH26+and+125I-PKH95%3A+characterization+and+efficacy+as+labels+for+in+vitro+and+in+vivo+endothelial+cell+localization+and+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">PKH26 and 125I-PKH95: characterization and efficacy as labels for in vitro and in vivo endothelial cell localization and tracking.</a> J Surg Res. 62, 23-28 (1996).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Methode der Zell-Aussaat Ti Rohre hier vorgestellten ermöglicht Ärzten und Wissenschaftlern, um schnell und gleichmäßig endothelialize Blut-Kontaktflächen von Implantaten. Da wir und zu isolieren, zu erweitern EPCs aus dem peripheren Blut-Proben, kein großer Eingriff erforderlich, um diese Zellen zu ernten. Darüber hinaus sind die EPCs autologen, also das Risiko einer Immunreaktion gegen die Zellen ausgesät Implantat wird eliminiert. Die Grundsätze in seinem Protokoll nachgewiesen werden kann, nicht nur für Ti Rohre, sondern auch für viele andere Biomaterialien, die in der kardiovaskulären Medizin genutzt werden genutzt werden. Kritische Schritte in diesem Protokoll sind die sorgfältige Reinigung der Ti Rohre, wie wir festgestellt, dass eine festhaftende Verunreinigungen Kompromisse Zelladhärenz. Weiterhin ist eine langsame Drehzahl (umgekehrt proportional zum Rohrdurchmesser) wesentlich bei der Aussaat Prozess ist, kann, so dass EPCs langsam absetzen und an der Oberfläche wie die Ti Rohr bewegt. Unsere Methode der Aussaat unmittelbar vor der Implantation vermeidet unpraktisch ex vivo Kultur Zeiten; Zellen einzeln haften und bilden später eine konfluente Blatt in vivo, die Vermeidung der Möglichkeit der Embolisation wie ein Blatt unmittelbar nach der Wiederherstellung der Strömung. Unsere früheren Studien zeigen, dass, sobald die EPCs auf eine konfluente Schicht aufgewachsen sind, sie eine extra-zelluläre Matrix, an die sie fest haften zu machen, zusätzlich Minimierung möglicher Ablösung einer endothelialen Blatt. Obwohl die Möglichkeit der embolischen Ablösung kann nicht vollständig ausgeschlossen werden, so scheint es multifold geringeres Risiko als Thrombose der gesamten Oberfläche der Vorrichtung, das Problem, dass diese Therapie entwickelt, um zu verhindern sein. Unser Ansatz der Implantation in den geringer Scherung, nutzt prothrombotischen Umfeld der unteren Hohlvene eines der am meisten vertraut großen Tiermodelle für die Erforschung Blutverträglichkeit und Thrombose von Geräten 5,6. Beachten Sie, dass alle Tierpflege und Experimente in Übereinstimmung mit dem National Institute of Health Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren und nur nach Genehmigung des Duke University Institutional Animal Care und Verwenden Ausschusses durchgeführt wurde. Um erfolgreich zu nutzen diese Implantation Methode, um Biomaterialien und Geräten zu testen, ist es wichtig, geduldig Skelettierung der IVC-Segment und ligieren alle venösen Zweig Schiffe in Vorbereitung für ein Bestücken der Schaltung, so dass keine Blutung um das Gerät in einen &quot;falschen Lumen&quot; stammt. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Zugabe von DPBS in das Gerät Lumen, so dass die Zellen auf der Innenseite Rohroberfläche feucht bleiben während des Schließens des veinotomy und vor der Reperfusion eingeleitet. Wenn das Gerät nicht in der Lage, wo es implantiert wurde gefunden werden, kann es migriert &quot;Upstream&quot; in der IVC haben. 3 mm Abschnitt der PVC-Schlauch so, dass das Rohr fest in ihren jetzigen Standort verankert - Dies kann durch eine Naht (4-O Prolene) durch die Venenwand und durch ein 2 verhindert werden. Hält sich der Forscher Schwierigkeiten, die Fluoreszenz-pre-markierten Zellen in Abbildung 8 nach der Explantation in einer ansonsten Patent Rohr gezeigt haben, ist es wahrscheinlich, dass die Zellen aus als ein zusammenhängendes Blatt geschält. Dies kann durch sehr sanfte Präparation der umliegenden Venen-und Demontagearbeiten der 3 Ti Rohrabschnitte verhindert werden, nach der Fixierung der Vene zusammen mit dem Rohr. Unsere Technologie bietet Proof-of-concept zur Verhinderung von Herz-Kreislauf-Gerät Thrombose durch EPC-Aussaat. Diese Technologie kann in der Entwicklung von &quot;biogenen&quot; Implantate mit patienteneigenen endothelialen Vorläuferzellen gefüttert werden. Die Machbarkeitsstudie in unserer Schweine Tiermodell bietet für die ersten Schritte in Richtung Umsetzung dieses &quot;personalisierten Medizin&quot; in die klinische Praxis.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Name des Unternehmens </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Acepromazine </td><td> Boehringer-Ingelheim </td><td> BIC670025 </td><td> NAC # 10280002 </td></tr><tr><td> Alconox Powered Precision Reiniger </td><td> Alconox </td><td> 1104 </td><td></td></tr><tr><td> Balfour Wund-Spreizer </td><td> Adler </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Baytril </td><td> Bayer </td><td> APVMA 46028/0705 </td><td></td></tr><tr><td> Butterfly-Nadel (19G) </td><td> Terumo </td><td> SV19CLK </td><td></td></tr><tr><td> Chlorhexidin </td><td> 3M </td><td> 9200 </td><td></td></tr><tr><td> Schellen (45-Grad) </td><td> Aesculap </td><td> FC339T </td><td></td></tr><tr><td> DPBS (-/-) </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS (+/+) </td><td> Gibco </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> DuraPrep </td><td> 3M </td><td> 8635 </td><td></td></tr><tr><td> EBM-2 Medium </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td><td> Basis für beide Serum freie und volle Wachstumsmedium </td></tr><tr><td> EGM-2 SingleQuots </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td><td> Gebrauchte mit EBM-2 für beide Serum freie und volle Wachstumsmedium </td></tr><tr><td> Elektrokauter-Tool </td><td> Valleylab </td><td> SurgII-20 </td><td></td></tr><tr><td> Schmirgelleinen </td><td> 3M </td><td> 60-0700-0425-8 </td><td> 240 grit </td></tr><tr><td> Euthasol Euthanasie-Lösung </td><td> Virback Tiergesundheit </td><td></td><td> ANADA #: 200-071 </td></tr><tr><td> Fentanyl-Pflaster </td><td> Actavis </td><td></td><td> NDC # 67767-120-18 </td></tr><tr><td> Flunixin </td><td> Schering-Plough </td><td></td><td> NAC #: 10470183 </td></tr><tr><td> Foley-Katheter (16F) </td><td> Barde </td><td> 730116 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Heißluftgebläse </td><td> Milwaukee </td><td> 8988-20 </td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td><td></td><td></td><td> NDC #: 25021 </td></tr><tr><td> Histopaque-1077 </td><td> Sigma </td><td> H8889-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Intubationstubus </td><td> Mallinckrodt </td><td> 86113 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> MWI, Meridian </td><td></td><td> NDC # 13985-030 </td></tr><tr><td> IV-Katheter (18G) </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 381547 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Fort Dodge </td><td></td><td> NDC # 0856-2013 </td></tr><tr><td> Ebene </td><td> Swanson </td><td> LLA001 </td><td></td></tr><tr><td> Luer-Lock Spitzenkappe </td><td> CML Versorgung </td><td> 909-001 </td><td></td></tr><tr><td> Marcain </td><td> Hospira </td><td></td><td> NDC #: 0409-1560-10 </td></tr><tr><td> Metzenbaum Scissors </td><td> Adler </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Micro-Einführhilfe (5F) </td><td> Galt </td><td> KIT 002-01 </td><td></td></tr><tr><td> Mosquito Zange </td><td> Adler </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Motor </td><td> Herbach und Rademan </td><td> H1-08 </td><td></td></tr><tr><td> Oxymorphon </td><td> Endo Labs </td><td></td><td> NDC: 63481-624-10 </td></tr><tr><td> PKH26 Dye Kit </td><td> Sigma </td><td> PKH26GL-1KT </td><td></td></tr><tr><td> Porcine Serum </td><td> Gemini-Bio-Produkte </td><td> 100-115 </td><td> Konzentration von 2% in voller Wachstumsmedium </td></tr><tr><td> Potts Scissors </td><td> Adler </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Präzise Vista Haut Hefter </td><td> 3M </td><td> 3998 </td><td></td></tr><tr><td> PVC-Schlauch </td><td> McMaster-Carr/Insultab </td><td> 7132K117 </td><td> erweitert ID 15,88 mm, erholt ID 7,95 mm </td></tr><tr><td> Rechtwinklig Medium Size </td><td> Adler </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Skalpell (# 10-15) </td><td> Barde </td><td> 373910 </td><td></td></tr><tr><td> Silikonschlauch </td><td> McMaster-Carr </td><td> 51735K26 </td><td> 16,64 mm OD, 9,52 mm ID </td></tr><tr><td> Spritze (5 cc) </td><td> Becton-Dickinson (BD) </td><td> 309603 </td><td></td></tr><tr><td> Tegaderm </td><td> 3M </td><td> 90001 </td><td></td></tr><tr><td> Drei-Wege-Hahn </td><td> Kendall </td><td> 170060 </td><td></td></tr><tr><td> Ti Rohr </td><td> Tico Titanium </td><td> N / A </td><td> Angegeben als ½ &quot;OD, .065&quot; Wand, .370 &quot;ID, 0,1737 £ / ft </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin neutralisierende Lösung (TNS) </td><td> Lonza </td><td> CC-5002 </td><td> 0,03% </td></tr><tr><td> Vetropolycin </td><td> PharmaDerm Tiergesundheit </td><td></td><td> NAC #: 12920110 </td></tr><tr><td> Vicryl Naht (3-0) </td><td> Ethicon </td><td> J808T </td><td></td></tr><tr><td> Wasserbad Sonicator </td><td> Branson </td><td> B200 </td><td></td></tr></tbody></table>

autologe endotheliale vorläuferzellen cell-sätechnik und biokompatibilitätstestung für herz-kreislauf-geräte in großtiermodell

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Implantierbare Herz-Kreislauf-Geräte werden aus künstlichen Materialien (zB Titan (Ti), expandiertem Polytetrafluorethylen), die das Risiko von Thromboembolien Bildung 1,2,3 Pose hergestellt. Wir haben eine Methode, um die innere Oberfläche des Ti Rohre mit Eigenblut-derived Mensch oder Schwein endothelialen Vorläuferzellen (EPC) 4-Linie entwickelt. Durch die Implantation Ti Röhrchen eine konfluente Schicht von Schweine-EPCs in die untere Hohlvene (IVC) von Schweinen, testeten wir die verbesserte Biokompatibilität der Zell-Oberfläche ausgesät in der prothrombotischen Umfeld eines großen Tiermodell und im Vergleich zu unmodifizierten blanken Metalloberflächen 5,6,7 (Abbildung 1). Diese Methode kann verwendet werden, um Geräte innerhalb von Minuten nach der Implantation endothelialize und testen ihre antithrombotischen Funktion in vivo werden. Periphere Blut wurde von 50 kg Yorkshire Schweinen und ihren mononukleäre Zellfraktion kultiviert, um die EPCs 4,8 isolieren erhalten. Ti Rohre (9,4 mm ID) wurden in drei 4,5 cm Längsschnitten vorgestanzten und wieder mit Schrumpfschlauch. Eine Aussaat Gerät gebaut wurde, das kann für langsame Rotation des Ti Röhren. Wir führten eine Laparotomie auf die Schweine und externalisiert den Darm und Harnblase. Scharfe und stumpfe Präparation wurde die IVC von der Bifurkation distal der rechten Nierenarterie proximalen Skelettierung. Die Ti Röhrchen wurden anschließend mit autologen EPC Federung und drehen bei 10 RPH x 30 min fluoreszenzmarkierten einheitlichen Zell-Beschichtung 9 erreichen gefüllt. Nach Verabreichung von 100 USP / kg Heparin wurden beide Enden der IVC und eine lumbale Vene festgeklemmt. A 4 cm veinotomy wurde durchgeführt und das Gerät eingelegt und mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. Als veinotomy mit einem 4:0-Prolene fortlaufenden Naht verschlossen war, wurde eine Klammer zu de-air der IVC entfernt. Am Ende des Verfahrens, der Faszie mit 0-PDS (Polydioxanon Naht) wurde angenähert, schloss die subkutane Raum mit 2-0 Vicryl und die Haut geheftet geschlossen. Nach 3 bis 21 Tage, Schweine wurden getötet, das Gerät explantiert en-Block und fixiert. Die Ti Rohre wurden demontiert und die inneren Oberflächen abgebildet mit einem Fluoreszenzmikroskop. Wir fanden, dass das blanke Metall Ti Rohre komplett verschlossen, während die EPC-seeded Röhren blieb Patent. Darüber hinaus konnten wir eine konfluente Schicht von EPCs auf der Innenseite mit Blut in Kontakt Oberfläche zu demonstrieren. Abschließend kann unsere Technologie verwendet, um Ti Rohre innerhalb von Minuten nach der Implantation endothelialize mit autologen EPCs zu Thrombosen des Geräts zu verhindern. Unsere OP-Methode ermöglicht die Prüfung der verbesserten Biokompatibilität von solchen modifizierten Geräte mit minimalem Blutverlust und EPC-Oberfläche ausgesät Störung.

Ein Verfahren zur Aussaat Titan mit Blut in Kontakt Biomaterialien mit autologen Zellen und Prüfung Biokompatibilität beschrieben. Diese Methode verwendet endothelialen Vorläuferzellen und Titan Rohre, innerhalb von Minuten von chirurgischen Implantation in porcine Hohlvenen ausgesät. Diese Technik ist geeignet für viele andere implantierbare biomedizinische Geräte.

Autologe endotheliale Vorläuferzellen Cell-Sätechnik und Biokompatibilitätstestung Für Herz-Kreislauf-Geräte in Großtiermodell

Implantierbare kardiovaskuläre Geräte werden aus künstlichen Materialien (z. B. Titan (Ti), expandiertem Polytetrafluorethylen) hergestellt, welche das Risiko bergen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, vaskuläre Implantate mit autologen, aus dem Blut gewonnenen endothelialen Vorläuferzellen zu besiedeln und anschließend die Wirkung dieser Behandlung auf die Thrombosebildung in einem Großtiermodell zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem eine periphere Blutprobe von Schweinen entnommen wird, um späte porcine endotheliale Vorläuferzellen mit proliferativer Auswuchsaktivität zu isolieren. Anschließend ein implantierbares Gerät.In unserer Prinzipstudie wird der Titanrohr mit den autologen PC besetzt. Anschließend wird das Gerät in die untere Hohlvene des Schweins implantiert. Die Ergebnisse zeigen einen Schutz vor Thrombose, basierend auf der Durchgängigkeit des mit EPC besetzten Titanrohrs im Vergleich zum Kontrollrohr und dem verstopften blanken Metallrohr.Die Chirurgie an der Duke University ist bestrebt, bahnbrechende und innovative Forschung zu fördern. Die folgende Präsentation ist ein Beispiel dafür, wie wir interdisziplinär und fächerübergreifend zusammenarbeiten, um die Medizin voranzubringen. Dr. EK leitet eine Forschungsinitiative zur Entwicklung einer Zellbesiedlungstechnologie, die Thrombosen verhindern soll, indem die blutberührende Oberfläche von vaskulären Implantaten mit den eigenen Vorläuferzellen des Patienten ausgekleidet wird.Da diese Zellen von denselben Patienten stammen, die das Implantat erhalten werden, vermeiden wir eine Abstoßung durch das Immunsystem. Unser Erfolg und die hier beschriebenen Methoden sind das Ergebnis einer umfangreichen Teamleistung. Die chirurgische Implantation wird von Sean Gage aus der Abteilung für Gefäßchirurgie, von Whitney Lane, einer Medizinstudentin der Duke University, und von mir durchgeführt.Ich möchte nun Alexander Janssen vorstellen, einen Doktoranden aus dem Fachbereich Biomedizinische Technik, der uns den Zellseeding-Prozess detailliert erläutern wird. Ich werde demonstrieren, wie Titanröhrchen kurz vor der Implantation in ein Schweinemodell mit aus Blut gewonnenen endothelialen Progenitorzellen besiedelt werden. Diese Methode dient als Machbarkeitsnachweis, und die gleichen grundlegenden Prinzipien können auf viele andere implantierbare Geräte angewendet werden, beispielsweise auf Nitinol-Stents und mechanische zirkulatorische Assistenzsysteme. EPCs werden isoliert, indem die mononukleäre Zellfraktion von Schweineblut ausplattiert wird, und erscheinen gewöhnlich nach etwa sieben Tagen.Sie sind an ihrer typischen kieselsteinartigen Morphologie erkennbar. Vermehren Sie EPCs in der Kultur auf eine Gesamtzahl von 9 Millionen Zellen. Waschen Sie die vorbereiteten EPCs zweimal in serumfreiem Medium aus, wobei darauf geachtet werden sollte, ihre Lichtexposition während und nach der Markierung zu begrenzen.Decken Sie die Zellen anschließend mit einer fluoreszierenden Markierung, PKH 26, ab und notieren Sie die applizierte Lösungsmenge. Inkubieren Sie die Zellen vier Minuten bei Raumtemperatur. Beenden Sie die Markierungsreaktion, indem Sie eine Minute später ein äquivalentes Volumen Schweineserum zur Farbstofflösung hinzufügen.Verdünnen Sie die kombinierten Lösungen im Verhältnis eins zu eins mit vollständigem Wachstumsmedium. Danach aspirationsieren Sie die Flüssigkeit und spülen die Zellen dreimal mit vollständigem Wachstumsmedium, gefolgt von zwei Waschungen mit DPBS ohne Calcium- oder Magnesiumchlorid. Anschließend bedecken Sie die Zellen mit Trypsin, notieren Sie das verwendete Volumen und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius.Nach dreiminütiger Inkubation unter dem Mikroskop überprüfen, ob die Zellen abgelöst sind, und gegebenenfalls doppelt so viel Trypsin-Neutralisationslösung zugeben wie zuvor Trypsin hinzugefügt wurde. Die Zellsuspensionen in einem einzigen Reaktionsgefäß vereinigen und die Zelldichte mit einem Hämozytometer bestimmen. Abschließend die Zellsuspension zentrifugieren und die Zellen in mindestens 4,5 Milliliter serumfreiem Medium resuspendieren.Nach der Vorbereitung des Schweins für die Operation die Mittellinie mit einer Klingennummer 15 vom zweiten Satz der Speicheldrüsen aus incisieren. Kranial bis zum vorletzten Satz kaudal mithilfe von Elektrokauter fortsetzen. Die Präparation bis zur Bauchfascie fortsetzen.Heben Sie das Peritoneum mit einer feinen Pinzette an und öffnen Sie es vorsichtig mit einer Metzenbaum-Schere, führen Sie die Harnblase heraus und setzen Sie eine Umstichnaht aus Vicryl 3-0 in die Blasenwand ein. Führen Sie einen Stichschnitt in deren Mitte durch und bringen Sie einen 16-Fr.-Foley-Katheter über die Inzision ein. Anschließend verabreichen Sie intravenöse Flüssigkeit, um die Harnproduktion während der Operation auf mindestens ein Milliliter pro Kilogramm Körpergewicht pro Stunde einzustellen.Anschließend den kleinen erweiterten Darm außerhalb der Bauchhöhle platzieren und zwei chirurgische Bour-Retraktoren anbringen, um die hintere Bauchhöhle freizulegen und die Vena cava inferior (VCI) durch scharfe und stumpfe Präparation zu identifizieren. Die VCI vorsichtig vom umgebenden Gewebe lösen. Danach das Gefäß vom rechten Nierenarterienabgang bis zur Bifurkation der VCI distal abpräparieren.Äußerste Vorsicht während der Präparation der V. cava inferior, da bereits ein sehr kleiner Defekt an der V. cava inferior zu einer raschen Blutung und letztlich zur Exsanguination des Tieres führen kann. Alle Seitenäste des V.-cava-inferior-Abschnitts erfordern besondere Sorgfalt, insbesondere die beiden großen hinteren Lumbalvenen unmittelbar proximal zur Bifurkation der V. cava inferior. Häufig findet sich auf der dorsalen Seite eine große Lumbalvene.Dissezieren Sie diese Vene frei und führen Sie sie mit Gefäßschlingen. Beginnen Sie nun parallel zur Operation, die Implantate mit EPCs zu besiedeln, bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen. Die Gewebesitzgerüste aus Titanröhrchen müssen vollständig zusammengebaut und in einem sterilen Bereich einsatzbereit sein.Öffnen Sie die gassterilisierte Titanrohranordnung in einer 5-cc-Spritze. Entfernen Sie anschließend den Kolben aus der 5-cc-Spritze, verwerfen Sie ihn jedoch nicht. Befestigen Sie eine feste Verschlusskappe an der Spritze. Füllen Sie die Spritze mit der EPC-Suspension, indem Sie eine Pipette verwenden.Danach den Kolben wieder einsetzen. Die Kappe entfernen und das Luer-Ende der Spritze in die offene Silikonschlauchleitung der Vorrichtung einführen, bis sie fest sitzt, jedoch nicht weiter. Eventuelle Blasen entfernen, indem die Zelllösung langsam vorgeschoben wird, bis sie die Oberseite des Kopfstücks erreicht.Danach die Vorrichtung mit einer Lockstoffkappe verschließen und in einem sterilen Handschuh mit Klebeband fixieren. Die gesamte Vorrichtung in einen gefrästen Spritzenhalter einsetzen und in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator stellen. Mithilfe eines Messgeräts sicherstellen, dass die Sitzkammern waagerecht ausgerichtet sind, und die Vorrichtung unter leichter Rotation inkubieren lassen.Setzen Sie die Operation unmittelbar nach der Ligatur der V. cava inferior fort, indem Sie 100 Einheiten Heparin pro Kilogramm Schwein verabreichen. Danach klemmen Sie die V. cava inferior unverzüglich in einem Winkel von 45 Grad distal an der V. cava inferior und der Lumbalvene und anschließend proximal ab. Verwenden Sie als Nächstes eine Skalpellklinge Größe 11 und eine Gefäßschere, um eine vier Zentimeter lange longitudinale Venotomie zwischen den proximalen und distalen Klammern anzulegen.Entfernen Sie jegliches Blut aus der V. cava inferior und spülen Sie deren Lumen mit steriler DPBS. Bringen Sie nun das Implantat mit angesiedelten EPC oder ein metallenes Kontrollimplantat in die V. cava inferior ein, um Austrocknung der Zellen und Luftansammlungen zu verhindern. Füllen Sie die V. cava inferior mit DPBS, die Calciumchlorid und Magnesiumchlorid enthält.Danach verschließen Sie die Venotomie mit einer laufenden Vier-Null-Prolinnaht und entfernen eine proximale Klemme, um die V. cava inferior durch eine geringe Rückblutung zu entlüften. Nach der Blutung entfernen Sie die distale Klemme, um die Implantation an Ort und Stelle zu halten. Legen Sie eine Haltenaht in den PVC-Schlauch, der durch die Venenwand verläuft.Schließen Sie die Faszie mit OPDS an einer CT-Nadel. Schließen Sie den subkutanen Raum mit zwei o Vicryl-laufenden Nähten. Anschließend verschließen Sie die Haut mit Hautklammern.Verabreichen Sie bis zu 20 Milliliter 0,25 % Marcaine subkutan entlang der Schnittstelle und bedecken Sie die Wunde zur Schmerzlinderung mit Mull und Tegaderm. Verabreichen Sie Flu Nixon und Oxymorphon bei Bedarf subkutan. Beenden Sie die Anästhesie und kehren Sie das Tier in seinen Käfig zurück, sobald es aufwacht, und pflegen Sie es über die nächsten sieben Tage.Verabreichen Sie Atri alle 24 Stunden als antibiotische Prophylaxe und stellen Sie sicher, dass das Fentanyl-Pflaster, das vor der Operation angebracht wurde, insgesamt drei Tage lang haftet. Nach drei Tagen wurden die sitzenden Titanröhrchenimplantate entfernt und die inneren Oberflächen untersucht. Bei einer Anregungswellenlänge von 550 Nanometern fand sich in einem weiteren Röhrchen eine zusammenhängende Schicht fluoreszenzmarkierter Zellen.Die Schnittzellen wurden zusätzlich mit einem Markierungsmolekül für die Plättchen-Endothelzell-Adhäsion gefärbt, um die Zellgrenzen sichtbar zu machen. Eine Vielzahl verschiedener Färbungen kann bei diesem Verfahren verwendet werden. Im Gegensatz dazu verschließt ein reiner Titanröhrchen-Implantat vollständig im prothrombotischen Umfeld mit niedriger Scherbelastung der Vena cava inferior.Wie in den Bildern A und C veranschaulicht, ist der zellbesiedelte Titanrohr in Bild B dargestellt und blieb nach unserem Say-Isolationsverfahren mit Spitzenvolumen an Blut gerinnungsfrei. EPC erscheinen nach durchschnittlich sieben Tagen in Kultur. Während des chirurgischen Eingriffs ist es äußerst wichtig, die V. cava inferior (VCI) sowohl sorgfältig als auch schonend zu freilegen, da bereits der kleinste Riss in der VCI oder ihren Seitenästen zu einer Exsanguination des Schweins führen kann. Nach diesem Verfahren können andere blutkontaktierende Materialien rasch endothelialisiert werden, um eine Thrombose zu verhindern.Endotheliale vaskuläre Stents, beispielsweise mit unseren EPCs, ahmen die natürliche Auskleidung der Blutgefäßwand nach und könnten nach ihrer Entwicklung eine Stent-Restenose und Thrombose verhindern. Unsere Schnell-beschichtende Technologie ermöglicht es, intravasale Geräte innerhalb weniger Minuten im Operationssaal oder Katheterlabor mit endothelialen Vorläuferzellen aus dem Blut des Patienten zu beschichten. Daher ist ein verlängerter ex vivo-Kulturaufwand nicht notwendig.Die Zeit am Gerät selbst wird vermieden, und die Technologie wird praktisch für die Übertragung in die klinische Anwendung.

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Endothelial koloniebildenden Progenitorzellen (ECFCs) sind ein viel versprechendes Instrument, um vaskuläre Homöostase und Reparatur zu studieren.

Isolation und großräumige Ausdehnung der erwachsenen Menschen Endothelial Colony Forming Progenitorzellen

Hier beschreiben wir eine Methode zur menschlichen Nabelschnurblut-derived endothelial Kolonie-bildenden Zellen (ECFCs) und Knochenmark gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in einem Kollagen / Fibronektin Gel eingebettet, subkutan in immundefizienten Mäusen. Liefern Diese Zelle / Gel-Kombination erzeugt eine humane vaskuläre Netzwerk, das mit der Maus Gefäßsystem verbindet.

Bioengineering humane mikrovaskuläre Networks in immundefizienten Mäusen

Nach unserer Kenntnis der zellulären und molekularen neotissue Bildung zu verbessern, wurde ein Maus-Modell der TEVG vor kurzem entwickelt. Die Transplantate wurden als infrarenalen Vena cava Zwischen Transplantate in C57BL / 6 Mäusen implantiert. Dieses Modell erzielt ähnliche Ergebnisse wie in unserer klinischen Untersuchung erreicht wird, sondern über einen weit verkürzt Zeitverlauf.

Die Implantation von Vena Cava Interposition Graft in Maus-Modell

Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die inter-Positions Platzierung von Tissue Engineered Vessels (TEVs) in die Halsschlagader eines Schafes mit End-to-End-Anastomose und digitale Echtzeit-Beurteilung in vivo bis Tieropfer.

Operationstechnik zur Implantation von Tissue Engineered Gefäßprothesen und Folge<em&gt; In-vivo-</em&gt; Überwachung

Hier zur Gewebezüchtung Gefäßimplantate, die zum Pfropfen in Mäusen durch Impfen Doppel partiell pluripotenten Stammzellen funktional erzeugen präsentieren wir ein Protokoll (PiPSC) - abgeleiteten glatten Muskelzellen und PiPSC - abgeleitete Endothelzellen auf einer dezellularisierten Gefäßgerüst Bioreaktor.

Generierung und Pfropfen von Tissue Engineering Gefäße in einem Maus-Modell

Wir beschreiben ein mikrochirurgisches Ansatz zur Erzeugung eines arteriovenösen (AV) loop als Modell Vaskularisierung in vivo in einem isolierten und gut charakterisierten Umgebung zur Analyse. Dieses Modell ist nicht nur nützlich für die Untersuchung der Angiogenese, ist aber auch für den Maschinenbau axial vaskularisiert und transplantierbaren Geweben optimal geeignet.

Die arteriovenöse (AV) Loop in einem Kleintiermodell zur Untersuchung Angiogenesis und Vaskularisierte Tissue Engineering

Jede Art von vaskularisierte zusammengesetzte Allotransplantation hängt derzeit long-term-Immunsuppression, schwer, für nicht-Leben-kritische Hinweise zu unterstützen. Wir präsentieren ein neues Porcines tibiale VCA-Modell, das Knochen VCA zu studieren und demonstrieren den Einsatz von chirurgischen Angiogenese weiterhin Knochen Rentabilität ohne die Notwendigkeit der langfristigen immun-Modulation verwendet werden kann.

Chirurgische Angiogenese in porcinen tibiale Allotransplantation: eine neue große Tierknochen durchblutet zusammengesetzte Allotransplantation Modell

Hier beschreiben wir ein präklinisches Großtiermodell (Schweine) der orthotopischen Herztransplantation, das fest etabliert und zur Untersuchung neuartiger kardioprotektive Strategien genutzt wurde.

Ein präklinisches Porcine-Modell der orthotopischen Herztransplantation

Dieses Protokoll zielt darauf ab, ein biogedrucktes 3D-Pflaster auf das Epikardium von infarktierten Mäusen zu transplantieren, die Herzinsuffizienz modellieren. Es enthält Details über Anästhesie, die chirurgische Brustöffnung, permanente Ligation der linken vorderen absteigenden (LAD) Koronararterie und die Anwendung eines biobedruckten Pflasters auf den Infarktbereich des Herzens.

Transplantation eines biobedruckten 3D-Patches in einem Murine-Modell des Myokardinfarkts

In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Implantation eines Tissue-Engineering-Gefäßtransplantats in die Halsschlagader der Maus mit Hilfe der Manschettentechnik vorgestellt, das ein geeignetes Tiermodell für die Untersuchung von Regenerationsmechanismen des Gefäßgewebes bietet.

Implantation eines Tissue-Engineering-Gefäßtransplantats in die Halsschlagader der Maus mittels Manschettentechnik

In dieser Studie wird ein Schweinemodell zur Bewertung von Transplantaten mit kleinem Durchmesser in Oberschenkelarterien vorgestellt. Das Modell ahmt die Gefäßdynamik des Menschen nach und bewertet umfassend die Durchgängigkeit von Transplantaten, die Hämodynamik und den Gefäßumbau. Es bietet eine wertvolle Plattform, um Gefäßtransplantate zu testen und mit Doppler-Ultraschall und Angiographie zu überwachen.

Implantation eines femoralen Gefäßtransplantats in einem Schweinemodell zur Prüfung von Gefäßtransplantaten mit kleinem Durchmesser

Erfahren Sie die Zellbesäumung von Titanimplantaten mit autologen endothelialen Vorläuferzellen zur Verbesserung der Biokompatibilität und Thromboseprävention im Schweinemodell. Diese Methode ermöglicht schnelle Anwendung im OP.

Autologe endotheliale Vorläuferzellen Cell-Sätechnik und Biokompatibilitätstestung Für Herz-Kreislauf-Geräte in Großtiermodell

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