Autologe endotheliale Vorläuferzellen Cell-Sätechnik und Biokompatibilitätstestung Für Herz-Kreislauf-Geräte in Großtiermodell

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, vaskuläre Implantate mit autologen endothelialen Vorläuferzellen aus dem Blut zu säen und dann die Wirkung dieser Behandlung auf die Thrombose in einem großen Tiermodell zu beobachten. Dies wird erreicht, indem eine periphere Blutprobe von Schweinen entnommen wird, um endotheliale Vorläuferzellen von Schweinen im späten Wachstum zu isolieren. Als nächstes ein implantierbares Gerät.

Das Titanrohr in unserer Proof-of-Principle-Studie sitzt neben den autologen PCs. Das Gerät wird dann in die untere Hohlvene des Schweins implantiert. Die Ergebnisse zeigen, dass der Schutz vor Thrombosen auf der Durchgängigkeit des EPC-sitzenden Titanrohrs im Gegensatz zum Kontroll- und verschlossenen Bare-Metal-Rohr basiert.

Die Duke-Chirurgie hat es sich zur Aufgabe gemacht, bahnbrechende, innovative Forschung zu fördern. Die folgende Präsentation ist ein Beispiel dafür, wie wir abteilungs- und disziplinübergreifend daran arbeiten, die Medizin voranzubringen. Dr. EK hat ein Forschungsprojekt zur Entwicklung einer Zellsitztechnologie geleitet, die Thrombosen verhindert, indem die blutberührende Oberfläche von Gefäßgeräten mit patienteneigenen Vorläuferzellen ausgekleidet wird.

Da diese Zellen von denselben Patienten stammen, die das Implantat erhalten werden, vermeiden wir eine Abstoßung durch das Immunsystem. Unser Erfolg und die hier beschriebenen Methoden sind das Ergebnis einer großen Teamleistung. Die chirurgische Implantation wird von Sean Gage aus der Abteilung für Gefäßchirurgie, Whitney Lane, einer Medizinstudentin der Duke, und mir demonstriert.

Ich möchte nun Alexander Janssen, einen Doktoranden vom Department für Biomedizinische Technik, vorstellen, der uns durch den Prozess der Zellaussaat führen wird. Im Detail werde ich zeigen, wie man Titanröhrchen mit aus dem Blut gewonnenen endothelialen Vorläuferzellen kurz vor der Implantation in ein Schweinemodell aussät. Diese Methode dient als Proof of Concept und die gleichen Grundprinzipien können auf viele andere implantierbare Geräte wie Nitinol-Stents und mechanische Kreislaufunterstützungssysteme angewendet werden. EPCs werden durch Plattieren der mononukleären Zellfraktion aus Schweineblut isoliert und treten in der Regel nach etwa sieben Tagen auf.

Man erkennt sie an ihrer typischen Kopfsteinpflaster-Morphologie. Erweitern Sie die EPCs auf eine Gesamtzahl von 9 Millionen Zellen in Kultur. Spülen Sie die vorbereiteten EPCs zweimal in serumfreiem Medium und achten Sie darauf, die Lichteinwirkung während und nach der Markierung zu begrenzen.

Decken Sie dann die Zellen mit einer Fluoreszenzmarkierung, PKH 26, ab und notieren Sie, wie viel Lösung aufgetragen wird. Inkubieren Sie die Zellen vier Minuten lang bei Raumtemperatur. Stoppen Sie die Markierungsreaktion, indem Sie eine Minute später der Farbstofflösung eine gleiche Menge Schweineserum hinzufügen.

Verdünnen Sie die kombinierten Lösungen eins zu eins mit vollem Wachstumsmedium. Saugen Sie dann die Flüssigkeit ab und spülen Sie die Zellen dreimal mit vollem Wachstumsmedium aus, gefolgt von zwei Wäschen und DPBS ohne Calcium- oder Magnesiumchlorid. Bedecken Sie anschließend die Zellen mit Trypsin, notieren Sie sich das verwendete Volumen und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius.

Überprüfen Sie nach dreiminütiger Inkubation mit der Mikroskopie, ob sich die Zellen abgelöst haben, und wenn ja, fügen Sie doppelt so viel Trypsin-Neutralisationslösung hinzu, wie hinzugefügt wurde. Trypsin, kombinieren Sie die Zelllösungen in einem einzigen Röhrchen und messen Sie die Zelldichte mit einem Hämozytometer. Zum Schluss wird die Zellsuspension pelletiert und die Zellen in mindestens 4,5 Millilitern serumfreiem Medium resuspendiert.

Nachdem Sie das Schwein für die Operation vorbereitet haben, schneiden Sie die Mittellinie mit einer Skalpellklinge Nummer 15 aus dem zweiten Satz Gedächtnisdrüsen ein. Cran führte zum vorletzten Satz verhätschelt mit Elektrokauter. Tragen Sie die Dissektion bis zur Bauchfaszie.

Heben Sie das Bauchfell mit einer Mückenzange an und dringen Sie vorsichtig mit einer Mets-Andalschere in das Peritoneum ein, externalisieren Sie die Harnblase und platzieren Sie eine Drei-Oh-Vicryl-Handtaschennaht in die Blasenwand. Machen Sie einen Stichschnitt in der Mitte und führen Sie einen 16 French Foley-Katheter in den Schnitt ein. Verabreichen Sie dann intravenöse Flüssigkeiten, um die Urinausscheidung während der Operation auf mindestens einen Milliliter pro Kilogramm pro Stunde zu titrieren.

Als nächstes wird der vergrößerte Dünndarm externalisiert und zwei chirurgische Retraktoren platziert, um den hinteren Aspekt der Bauchhöhle freizulegen und die IVC durch scharfe und stumpfe Dissektion zu identifizieren. Befreien Sie die IVC vorsichtig vom umgebenden Gewebe. Skelettieren Sie dann das Gefäß von der rechten Nierenarterie proximal zur Bifurkation der distalen IVC-Übung.

Äußerste Vorsicht während der IVC-Dissektion, da selbst ein sehr kleiner Defekt in der IVC zu einer schnellen Blutung und Ausblutung der Tierligate führen kann. Alle Seitenäste des IVC-Segments werden besonders sorgfältig präpariert und die beiden großen hinteren Lendenvenen unmittelbar proximal der Bifurkation der IVC präpariert und ligiert. Auf der hinteren Seite befindet sich oft eine große Lendenvene.

Präparieren Sie diese Vene frei und kontrollieren Sie sie mit Gefäßschlingen. Beginnen Sie nun parallel zur Operation mit der Bestückung des Implantats mit EPCs, bevor Sie mit diesem Eingriff beginnen. Die Sitzgerüste aus Titanrohrgewebe müssen vollständig montiert und für den Einsatz im sterilen Bereich bereit sein.

Öffnen Sie die gassterilisierte Titanröhrchenbaugruppe in einer Fünf-cm³-Spritze. Entfernen Sie dann den Kolben von der Fünf-cm³-Spritze, entsorgen Sie ihn jedoch nicht. Eine feste Verlockungskappe an der Spritze. Verwenden Sie eine Pipette, um die Spritze mit der EPC-Suspension zu füllen.

Setzen Sie dann den Kolben wieder ein. Entfernen Sie die Kappe und stecken Sie das Köderende der Spritze in den offenen Silikonschlauch der Baugruppe, bis es gerade fest anliegt. Entfernen Sie jedoch keine Blasen mehr, indem Sie die Zelllösung langsam vorschieben, bis sie die Oberseite des Kopfstücks erreicht.

Verschließen Sie dann die Baugruppe mit einer Köderkappe und kleben Sie sie mit einem sterilen Handschuh zu. Setzen Sie diese gesamte Baugruppe in einen maschinell bearbeiteten Spritzenhalter ein und legen Sie sie in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Stellen Sie mit einem Messgerät sicher, dass die Sitzkammern nivellieren und die Baugruppe mit sanfter Drehung inkubieren kann.

Setzen Sie die Operation unmittelbar nach der Ligatur der IVC fort, indem Sie 100 Einheiten Heparin pro Kilogramm Schwein verabreichen. Klemmen Sie dann die IVC sofort in einem 45-Grad-Winkel distal auf die IVC und die Lendenvene und dann proximal. Verwenden Sie als Nächstes eine Skalpellklinge Nummer 11 und eine Topfschere, um eine vier Zentimeter lange Längsvenenotomie zwischen den proximalen und distalen Klemmen durchzuführen.

Evakuieren Sie jegliches Blut aus der IVC und spülen Sie das innere Lumen mit sterilem DPBS. Setzen Sie nun das EPC-Sitzimplantat oder eine Bare-Metal-Steuerung in die IVC ein, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern und Luft abzuführen. Füllen Sie den IVC mit DPBS mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid

Dann verschließen Sie die Venenotomie mit einer vier Oh Prolin Laufnaht und entfernen Sie eine proximale Klemme, um die IVC durch eine kleine Menge Rückenblutung zu entlüften. Entfernen Sie nach der Blutung die distale Klemme, um das Implantat an Ort und Stelle zu halten. Bringen Sie eine Bleinaht in den PVC-Schlauch an, der durch die Venenwand verläuft.

Verschließen Sie die Faszie mit OPDS auf einer CT-Nadel. Verschließen Sie den subkutanen Raum mit zwei o Vicryl. Tackern Sie dann die Haut zu.

Verabreichen Sie bis zu 20 Milliliter 0,25%iges Marcain subkutan entlang der Inzisionsstelle und bedecken Sie die Wunde mit Gaze und Tegaderm gegen Schmerzen. Verabreichen Sie Grippe, Nixon und Oxymorphon subkutan nach Bedarf. Brechen Sie die Anästhesie ab und bringen Sie das Schwein in den nächsten sieben Tagen in seinen Käfig zurück, wenn es erwacht.

Verabreichen Sie Atri alle 24 Stunden als Antibiotikaprophylaxe und stellen Sie sicher, dass das vor der Operation aufgetragene Fentanylpflaster insgesamt drei Tage lang haftet. Nach drei Tagen wurden die sitzenden Titanrohrimplantate entfernt und die Innenflächen untersucht. Unterhalb einer Anregungswellenlänge von 550 Nanometern wurde in einer anderen Röhre eine konfluente Schicht aus fluoreszenzmarkierten Zellen gefunden.

Die Schnittzellen wurden zusätzlich mit einem Adhäsionsmarker für Thrombozyten-Endothelzellen gefärbt, um die Zellgrenzen sichtbar zu machen. Bei diesem Verfahren können die unterschiedlichsten Beizen verwendet werden. Im Gegensatz dazu verschließt ein Tubenimplantat aus blankem Titan die prothrombotische Umgebung mit niedrigem Anteil der Vena cava inferior vollständig.

Wie in den Bildern A und C dargestellt, ist das zellsitzende Titanrohr in Bild B zu sehen und blieb frei von Gerinnseln. EPC treten nach durchschnittlich sieben Tagen in Kultur auf Während der Durchführung des chirurgischen Eingriffs ist es sehr wichtig, die IVC sowohl sorgfältig als auch schonend zu skelettieren, da selbst der kleinste Riss in der IVC oder ihren Seitenästen zur Ausblutung des Schweins führen kann. Nach diesem Verfahren können andere Materialien, die mit Blut in Berührung kommen, schnell endothelial liegen, um eine Thrombose zu verhindern.

Endotheliale vaskuläre Stents mit unseren EPCs ahmen beispielsweise die native Auskleidung der Blutgefäßwand nach und können eine erneute Stenose und Thrombose des Stents nach seiner Entwicklung verhindern. Unsere Quick-See-Technologie ermöglicht es, intravaskuläre Geräte innerhalb von Minuten im Operationssaal oder im Katheterlabor mit patienteneigenen blutabgeleiteten endothelialen Vorläuferzellen auszukleiden. Daher verlängerte Exvivo-Kultur.

Die Zeit am Gerät selbst wird vermieden und die Technologie wird praktisch für die Umsetzung in die klinische Praxis.