Visualizing Proteine und Makromolekulare Komplexe von Negative Stain EM: von Grid Vorbereitung auf Image Acquisition
December 22nd, 2011
Visualizing Protein-Proben von negativen Fleck-Elektronenmikroskopie (EM) hat sich zu einem beliebten Strukturanalyse Methode. Es ist für die quantitative Struktur-Analyse nützlich, wie zum Beispiel die Berechnung einer 3D-Rekonstruktion der Moleküle untersucht, und auch für qualitative Prüfung der Qualität von Protein-Präparationen. In diesem Artikel präsentieren wir detaillierte Protokolle für die Vorbereitung der EM-Gitter, Färbung der Probe und die Visualisierung der Probe in einem Elektronenmikroskop. Unerfahrene Benutzer können diese Protokolle einfach zu folgen und zu nutzen Negativfärbung EM als Routine-Test, zusätzlich zu anderen biochemischen Assays für die Bewertung ihrer Protein-Proben.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, gereinigte Proteinproben durch Negativ-Färbeelektronenmikroskopie sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Elektronenmikroskopiegitter vorbereitet werden, die die Probe stützen. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die negative Fleckenlösung herzustellen.
Anschließend wird die Probe auf das Elektronenmikroskopiegitter aufgebracht und negativ gefärbt. Zuletzt wird das EM-Gitter in ein Elektronenmikroskop geladen und die Bilder werden unter geeigneten optischen Bedingungen aufgenommen. Herkömmliche Hellfeld-DEM-Bilder sind kontrastreich und detailreich und zeigen einzelne Makromoleküle, die über einen strukturlosen Hintergrund verstreut sind.
Die Elektronenmikroskopie mit negativen Färbefarben ist eine einfache Methode, um Ihr Lieblingsprotein zu visualisieren. Es kann als Routine-Assay verwendet werden, um Ihr gereinigtes Protein zu untersuchen, entweder für die Strukturanalyse oder andere biochemische und biophysikalische Assays. Hier zeigen wir, wie man eine negativ gefärbte Probe für die Elektronenmikroskopie vorbereitet.
Dievisuelle Demonstration dieser Methode ist hilfreich, da einige der Schritte aus Textbeschreibungen und Abbildungen schwer zu lernen sind. Beginnen Sie damit, mit einer Glaspipette einen einzelnen Tropfen Kollodium in ein großes Becherglas mit Wasser auf der Wasseroberfläche zu geben. Wenn sich das Kollodium ausbreitet, kann es Staub von der Wasseroberfläche aufnehmen.
Entfernen Sie einen staubigen Film aus Kollodium-Kunststoff und ersetzen Sie ihn durch einen anderen Tropfen. Legen Sie anschließend zwischen 50 und 100 EM-Gitter nacheinander mit der glänzenden Seite nach unten auf die schwimmende Kunststofffolie. Wählen Sie 400 Maschengitter für routinemäßige negative Flecken und 200 Maschengitter aus.
Zum Sammeln von Bildern von Tilt-Paaren. Wählen Sie ein Stück langsam saugfähiges, knitterfreies Papier, das etwas größer ist als die Fläche der Raster. Legen Sie das Papier auf die Gitter und warten Sie, bis das Papier vollständig nass ist.
Das Papier sollte Wasser nicht zu schnell aufnehmen. Wir verwenden Papier von einem billigen Notizblock. Die Gitter werden nun zwischen der Kunststofffolie und dem Papier eingeklemmt.
Lege das Papier mit einer Pinzette in eine Petrischale, um es langsam an der Luft trocknen zu lassen. Vermeiden Sie schnellere Trocknungsmethoden, da diese zu Falten führen können. Bei der in unserem Labor verwendeten Carbon-Beschichtungsmaschine handelt es sich um eine Creston 2 0 8 C Hochvakuum-Turbo-Carbon-Coer.
Ausgestattet mit einem Creston-Schichtdickenmonitor. Der Monitor verwendet eine Quarzwaage, die empfindlich auf Kohlenstoffablagerungen reagiert. Das hier beschriebene Protokoll erfordert jedoch nicht, dass diese Vorrichtung mit dem Schärfen und Laden der Kohlenstoffstäbe in einer Kohlenstoffbeschichtungsmaschine beginnt.
Nächste Schicht, ein Objektträger mit Vakuumfett, wobei die Hälfte der mattierten Fläche unbeschichtet bleibt. Nach der Kohlenstoffbeschichtung werden die gefetteten Bereiche des Objektträgers verwendet, um die Dicke der Kohlenstoffschicht abzuschätzen. Legen Sie das Papier mit den Gittern auf den Tisch unter die Glocke der Carbon-Beschichtungsmaschine. Positionieren Sie das gefettete Glas.
Schieben Sie neben die Gitter. Pumpen Sie die Vakuumkammer auf mindestens 10 Mikrotouren, da sonst Funkenbildung viele große Partikel im Gitter erzeugt. Erhöhen Sie nun den Strom ganz langsam.
Die scharfe Spitze des Carbonstabes wird extrem hell. Beobachten Sie es nicht mit bloßem Auge, wenn die Beschichtung beginnt, der Objektträger verfärbt sich in ein dunkles Grau, wenn sich die Kohlenstoffschicht aufbaut, schneiden Sie den Strom bei der gewünschten Kohlenstoffdicke ab und berücksichtigen Sie die Transparenz der Glocke. Sobald die Dunkelheit des Objektträgers auf die Kohlenstoffdicke kalibriert ist, ist diese Methode genauso genau wie der teurere Schichtdickenmonitor.
Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, entlüften Sie die Vakuumkammer und entfernen Sie beschichtete Gitter für die spätere Verwendung. Die dünne Kunststoffschicht beeinträchtigt die Qualität des negativ gefärbten Bildes nicht, kann aber entfernt werden, indem die Gitter mehrere Stunden lang in Chloroform eingeweicht werden, bevor Sie fortfahren. Stellen Sie eine frische Urin-L-Formiat-Lösung her oder verwenden Sie eine Lösung, die weniger als zwei Wochen im Dunkeln gelagert wurde.
Eine gute frische Lösung hat eine gelbe Farbe, einen pH-Wert von etwa vier und läuft sehr sauber ohne Ausfällungen. Beginnen Sie damit, ein handelsübliches System zum Leuchten zu verwenden. Entleeren Sie die kohlenstoffbeschichteten Gitter.
Als nächstes zwei 20-Mikroliter-Tropfen destilliertes Wasser und 2 25-Mikroliter-Tropfen frische Urinalformiat-Lösung auf ein Stück Perfil geben. Halten Sie mit einer Anti-Kapillar-Pinzette mit umgekehrter Kraft ein glühendes Gitter mit der kohlenstoffbeschichteten Seite nach oben. Entscheidend ist, dass diese Pinzetten keine Flüssigkeit aus den Gittern absaugen.
Geben Sie nun zwei Mikroliter Proteinprobe auf das Gitter und warten Sie, bis die Proteine in das Gitter aufgenommen werden. Dies dauert in der Regel 30 Sekunden, aber sehr verdünnte Proben benötigen mehr Zeit, was sich auf die Pufferkonzentrationen auswirken kann. Wenn Sie fertig sind, tupfen Sie die Proteinprobe mit Filterpapier ab.
Waschen Sie dann den Rost zweimal, indem Sie seine Oberfläche kurz mit einem Tropfen Wasser berühren und innerhalb weniger Sekunden trocken tupfen. Nachdem das Wasser das Gitter kurz zu einem Tropfen Fleck berührt und schnell trocken getupft hat. Lassen Sie das Gitter mit der gleichen Technik 20 Sekunden lang mit einem zweiten Tropfen Fleck in Kontakt kommen.
Trocknen Sie schließlich das Gitter auf dem Laborabzug an der Luft oder vorzugsweise in einem Vakuum vor der EM-Sitzung, überprüfen Sie die Ausrichtung des EM-Mikroskops und laden Sie eine perfektionierte Ausrichtungsdatei, falls verfügbar, um sie in einen nahezu perfekten Zustand zu versetzen. Laden Sie nun das EM-Gitter auf einen Standard-Probenhalter mit einfacher Neigung. Setzen Sie anschließend den Halter in die Bühne ein.
Warten Sie dann, bis der Pumpzyklus abgeschlossen ist, und setzen Sie den Halter in die Säule ein. Beginnen Sie nun mit der Suche nach einer Probenfläche mit guter Färbung. Fokussieren Sie manuell mit der Methode des minimalen Kontrasts oder mit einer CC-, D-Kamera und der Berechnung der Live-Vier.
Ihr Leistungsspektrum. Stellen Sie dann den Tiefenfokus nach Bedarf ein, in der Regel auf minus 1,5 Mikrometer. Die Fleckenkonzentration kann im Raster variieren, suchen Sie also nach Proteinen mit weißem Kontrast.
Vermeiden Sie Bereiche mit ungleichmäßiger oder positiver Färbung, in denen der Proteinkontrast schwarz wird. Verwenden des skizzierten Ansatzes zur Herstellung von Gittern und zur Visualisierung negativ gefärbter Proben. Zu Demonstrationszwecken wurden mehrere bekannte Proteine abgebildet.
Achten Sie auf ihre Details und den scharfen Kontrast. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proben von negativ gefärbten Makromolekülen für die Betrachtung in einem Elektronenmikroskop erzeugt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa vier Stunden durchgeführt werden.
Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die 3D-Rekonstruktion durchgeführt werden, um molekulare Strukturen besser zu verstehen.
Übersicht
Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für die Visualisierung gereinigter Proteinproben mittels negativer Färbe-Elektronenmikroskopie (EM) vor. Die Methode ist für Anfänger zugänglich und dient als Routine-Assay für die strukturelle Analyse von Proteinen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Strukturbiologie
- Elektronenmikroskopie
- Proteinanalyse
Hintergrund
- Negative Färbe-EM ist eine weit verbreitete Technik zur Visualisierung von Proteinen.
- Sie ermöglicht sowohl qualitative als auch quantitative strukturelle Analyse.
- Protokolle zur Probenvorbereitung und -visualisierung sind für eine erfolgreiche Anwendung unerlässlich.
- Diese Methode kann das Verständnis von Proteinstrukturen verbessern.
Zweck der Studie
- Um einen umfassenden Leitfaden zur Herstellung von EM-Rastern und zur Färbung von Proben bereitzustellen.
- Um die Visualisierung von Proteinen mittels negativer Färbe-EM zu demonstrieren.
- Um die routinemäßige Anwendung dieser Methode in der Proteinanalyse zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Elektronenmikroskopie-Rastern.
- Auftragung der negativen Färbelösung auf Proteinproben.
- Visualisierung der Proben in einem Elektronenmikroskop.
- Aufnahme von Bildern unter optimalen Bedingungen.
Hauptergebnisse
- Hochkontrastierte Bilder von Proteinen wurden erhalten.
- Detaillierte Protokolle wurden erfolgreich demonstriert.
- Visuelle Hilfsmittel verbesserten das Verständnis komplexer Schritte.
- Die Ergebnisse unterstützen die Verwendung der negativen Färbe-EM für die routinemäßige Proteinanalyse.
Schlussfolgerungen
- Negative Färbe-EM ist eine effektive Methode zur Proteinvisualisierung.
- Die bereitgestellten Protokolle können von Anfängern leicht befolgt werden.
- Diese Technik kann andere biochemische Assays ergänzen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Negative stain electron microscopy (EM) provides rapid, high-contrast visualization of purified proteins and macromolecular complexes, enabling early-stage assessment of sample quality and assembly state. This technique supports critical go/no-go decisions in discovery pipelines by confirming sample homogeneity and complex formation before resource-intensive downstream studies. Its accessibility and reproducibility make it a foundational tool for structural biology teams in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of protein complexes to confirm assembly and integrity.
- Supports rapid assessment of sample homogeneity, reducing ambiguity in target validation.
- Facilitates early detection of aggregation or degradation, de-risking downstream workflows.
- Provides visual evidence to support mechanistic hypotheses in target selection.
Screening & Assay Development
- Validates the quality of protein preparations prior to high-throughput screening or assay development.
- Ensures reproducibility and standardization of sample inputs for quantitative assays.
- Enables scalable preparation of validated EM grids for repeated use in screening campaigns.
- Supports reliable evaluation of compound effects on protein structure or assembly.
Translational & Preclinical Research
- Confirms structural integrity of therapeutic candidates prior to preclinical studies.
- Aligns visual data with biochemical and biophysical assays for translational continuity.
- Reduces risk of advancing structurally compromised candidates into preclinical models.
- Provides foundational data for subsequent 3D reconstruction and mechanistic studies.
Pipeline & Workflow Integration
Negative stain EM is positioned at the interface of protein purification and structural or functional characterization, bridging early discovery and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing protein complexes and assemblies.
- Screening: Confirms sample quality and reproducibility for downstream assays.
- Analytics: Provides high-contrast images for quantitative assessment of sample homogeneity and aggregation.
- Translational Research: Ensures structural fidelity of candidates entering preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, routine assay adaptable across diverse protein targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in sample quality and target validation.
- Operational Value: Delivers rapid, reproducible, and scalable visualization workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EM grid preparation and instrument operation.
- Needs access to electron microscopy infrastructure and staining reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducible sample preparation and imaging.
- Adaptable to a wide range of protein sizes and complex types.
- Limited to surface visualization; not suitable for high-resolution internal structure analysis.
