Name: Visualizing Proteine und Makromolekulare Komplexe von Negative Stain EM: von Grid Vorbereitung auf Image Acquisition (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Lernen Sie die Negativfärbung-Elektronenmikroskopie für die Visualisierung von Proteinen und makromolekularen Komplexen. Diese Methode ermöglicht Routineanalysen zur Strukturaufklärung in der Strukturbiologie.

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Elektronenmikroskopie Arbeit bei Cheng Labor wird zum Teil durch Zuschüsse aus NIH (1R01GM082893, 1R01GM098672, 1S10RR026814-01 und P50GM082250 (zu A. Frankel)), und einen Zuschuss von UCSF Programm der Durchbruch Biomedical Research, Opportunity Award und New Technology Award zu unterstützen.

1. Vorbereitung der EM-Gitter für Kohlenstoff-Beschichtung <ol><li> Füllen Sie einen großen Becherglas mit destilliertem Wasser. </li><li> Verwenden Sie eine Glaspipette auf einen einzigen Tropfen Kollodium (~ 20 &amp;mgr; l, 2% in Amylacetat, Electron Microscopy Sciences, PA, USA) auf der Oberfläche des Wassertropfens. Collodion wird sich ausbreiten, um eine dünne Kunststoffschicht auf der Wasser / Luft-Oberfläche bilden; Hinweis: Eine erste Tropfen Collodium kann verwendet werden, um die Wasseroberfläche von einer Staubpartikel klar sein. Nach dem Entfernen der Folie von den ersten Tropfen, wird die Wasseroberfläche frei von Staub. </li><li> Legen EM-Gitter, 400 oder 200 mesh Gilder Cu Netze von Ted Pella Inc. (USA), einer nach dem anderen auf die Kunststoffschicht schwimmt auf der Wasseroberfläche gekauft; wir in der Regel Platz 50 ~ 100 Netze in einer dichten Packung Muster, mit der glänzenden Seite der Startaufstellung nach unten in die Kunststoffschicht (Abb. 1A). Hinweis: 400 mesh Gitter sind gut für die Routine negativen Fleck EM-Gitter, während 200 mesh Gitter sind gut für das Sammeln kippen Paar Bilder. </li><li> Schneiden Sie einen Kuchence von Papier mit den Abmessungen etwas größer als der Bereich, in dem Gitter auf der Kunststoff-Schicht aufgebracht werden. Legen Sie das Papier vorsichtig auf der Oberseite des Gitters (Abb. 1B), und warten, bis das Papier wird komplett nass (Abb. 1C). Hinweis: Verschiedene Arten von Papier haben unterschiedliche Wasseraufnahme Raten. Es ist wichtig, dass das Papier nimmt kein Wasser zu schnell. Zum Beispiel, ist eine regelmäßige Filterpapier nicht gut für diesen Zweck, da es Wasser aufnimmt zu schnell und macht eine Menge von Falten. Die Carbon-Folie von zerknittertes Papier gemacht ist nicht flach, und somit nicht gut für das Sammeln kippen Paar Bilder für zufällige konische Neigung 3D-Rekonstruktion. Man muss verschiedene Papiere Test, eine geeignete zu finden. In unserem Labor haben wir mit Papieren aus Notizblöcke aus lokalen Lebensmittelgeschäft gekauft. Manchmal ist das Zeitungspapier war auch als geeignet erwiesen. Eine weitere Möglichkeit ist die relative dicke Reispapier für chinesische / japanische Kalligraphie verwendet wird. </li><li> Schnell machen Einschnitte auf der Kunststoff-Folie rund um und in der NäheDie eingeweichte Papier. Unmittelbar danach, verwenden Sie eine Zange zu holen das Papier mit der Stromnetze zwischen den Kunststoff-Folie und Papier eingeklemmt. Legen Sie das Papier in einer Petrischale mit dem Gitter nach oben für die Lufttrocknung (Abb. 1D); Hinweis: Es ist wichtig, damit das Papier an der Luft trocknen. Trocknung zu schnell erzeugt viele Falten im Papier. </li></ol> 2. Carbon-Beschichtung Gitter <ol><li> Die Kohlenstoff-Beschichtungsanlage in unserem Labor verwendet eine Cressington 208C High Vacuum Turbo Carbon-Coater (Ted Pella). Unser System ist mit einem Cressington Schichtdicke Monitor, der die Dicke des beschichteten Kohlenstoff-Film basiert auf dem Prinzip, dass die Schwingungsfrequenz eines Quarz von der Masse eines abgeschiedenen Films auf seiner Oberfläche verändert Maßnahmen ausgestattet. Die beschriebenen Protokoll hier nicht erforderlich eine Stärke zu überwachen, da sie oft nicht in jedem Labor zur Verfügung. </li><li> Schärfen eines Kohlestab mit einem Spitzer (Ted Pella) und laden Kohlestäbe in Kohlenstoffbeschichtung machine (Abb. 2A). Zwei Stäbe, mit einer scharfen Spitze und das andere mit einem flachen Ende gegeneinander gestellt. </li><li> Anlegen von Vakuum Fett auf die Hälfte der mattierten Fläche von einem Glasträger und legen Sie sie neben dem Gitter (Abb. 2B). Nur die Hälfte der mattierten Fläche der Glasplatte sollte mit Vakuumfett abgedeckt werden. Hinweis: Die mit Vakuumfett wird sich nicht ändern Farbe nach Carbon-Beschichtung. Der Kontrast zwischen den angrenzenden Gebieten mit und ohne Vakuum Fett liefert eine Abschätzung der Dicke des beschichteten Kohlenstoff. </li><li> Legen Sie das Papier mit Gittern auf der Bühne des Kohlenstoff-Beschichtung Maschine. Legen Sie den Objektträger neben dem Gitter (Abb. 2C). Hinweis: Man kann auch zuerst übertragen Gitter mit der Kunststoff-Folie auf einen Glasträger beschichtet vor der Beschichtung, bei vielen Netzen fallen aus dem Papier. </li><li> Pump die Vakuumkammer und warten, bis das Vakuum erreicht ein Niveau von 10 -5 Torr. Hinweis: Beschichtung mit geringer Unterdruck erzeugt oft viele Funken, was zu vielen großen Kohlenstoff-Teilchen aufdas Netz. </li><li> Erhöhen Sie die aktuelle sehr langsam. Die scharfe Spitze der Kohlestab wird zuerst rot und dann weiß wie der Strom steigt. Schauen Sie nicht die hohe Helligkeit Spitze direkt mit dem bloßen Auge. Stoppen steigendem Strom, wenn die Beschichtung beginnt. Die Glasplatte wird Farbe von weiß zu grau ändern und dann dunkelgrau Licht. Die Dunkelheit der Folien korreliert die Dicke der Kohleschicht beschichtet. Schalten Sie den Strom aus der Beschichtung zu stoppen, wenn gewünschte Dicke erreicht ist (Abb. 2D). Anmerkung: 1) Nach wiederholten Kohlenstoff Beschichtungsverfahren beschichtet Kohlenstoff aus dem Inneren der Glasglocke konnte dunkler die Farbe. Dies macht den beschichteten Kohlenstoff-Film dicker erscheinen als es tatsächlich ist. 2) Eines geschärft Kohlestab kann für mehrere Beschichtung verwendet werden. Die Schärfe der Spitze allmählich nach jeder Beschichtung reduziert. Der maximale Strom wird durch die Schärfe der Kohlestab beeinflusst. Ein frisch gespitzten Stab mit kleinerem Durchmesser erfordert eine relativ niedrigereStrom zu Kohlendioxid verdampfen. Später Beschichtung erfordern etwas höheren Strom. </li><li> Vent der Vakuumkammer und entfernen Roste für die spätere Verwendung. Hinweis 1. Die genauere Methode zur Steuerung der Kohlenstoff Dicke wird durch die Verwendung einer Schichtstärke zu überwachen. Oder man kann qualitativ kalibrieren Farbe gegen die genaue Dicke des Monitors gemessen. Ein nützliches Kohlenstoff Dicke für diese Technik liegt zwischen 3 und 7 nm. </li></ol> Dies ist eine einfache und schnelle Methode, um eine große Menge an Kohlenstoff beschichtete Netze vorzubereiten, in der Regel ~ 100 Netze pro Präparat. Die Gitter enthalten eine dünne Kunststoffschicht, die in der Regel keinen Einfluss auf die Qualität der negativ gefärbten Bild. Allerdings sind Netze in diesem Verfahren hergestellte nicht geeignet für cryoEM. Diese Schicht aus Kunststoff kann durch Einweichen der Netze in Chloroform für mehrere Stunden entfernt werden. 3. Vorbereitung Uranyl Formiatlösung (0,75%) für negative Färbung EM. Das detaillierte Protokoll wurdebeschrieben bisher 5 <ol><li> Abwiegen 37,5 mg des Uranyl-formiat in ein kleines Becherglas; </li><li> 5 ml kochendem Wasser und rühren Sie für 5 Minuten im Dunkeln; </li><li> Add 10 &amp;mgr; l 5 M NaOH, weiter rühren 5 Minuten; </li><li> Filtern Sie die Lösung mit einer Spritze Filter (Fisherbrand, 13mm Spritzenfilter, 0,2 um, Nylon unsteril, Katalog-Nummer 09-720-5), und speichern Sie die filtrierte Lösung in einer 8ml Falcon-Röhrchen mit Alufolie bedeckt; Hinweis. Uranyl Formate Pulver kann von Electron Microscopy Sciences (Hatfield, PA), Bestellnummer 22451 bezogen werden. Uranyl Formiatlösung ist lichtempfindlich und sollte weg von direktem Licht gehalten werden, zum Beispiel durch das Abdecken der Falcon-Röhrchen mit Alufolie abdecken. Eine frisch hergestellte Lösung hat eine hellgelbe Farbe (Abb. 3A). Stain-Lösung kann auf der Bank für 1-2 Wochen aufbewahrt werden, bevor es ausfällt beginnt. Uranyl Formiat sauer mit einem pH ~ 4. Hinzufügen NaOH erhöht den pH-Wert, aber das Hinzufügen zu schnelloder im Überschuss kann dazu führen, den Fleck zu fällen. Neben der Erzeugung von Kontrast, Uranyl-formiat behebt auch das Protein Probe. Da die Fixierung Rate ist so schnell, den niedrigen pH-Regel keinen Einfluss auf die gesamte Proteinkonformationen oder Protein-Komplexbildung 7. </li></ol> 4. Protokoll für die Vorbereitung Negativfärbung EM Gitter. Dieses Protokoll wurde im Detail beschrieben bisher 5 <ol><li> Glimmentladung Kohlenstoff beschichtet Raster, mit PELCO easiGlow GlowDischarge System (Ted Pella Inc., USA). Die aktuelle Verwendung 15 mA und Gitter sind Leuchten für 30 Sekunden. Beachten Sie entladen. Glow-entladen Netze kurz nach Glühen Entladen verwendet werden sollte. Wir verwenden oft die Netze in weniger als 2 Stunden nach der Glimmentladung. </li><li> Legen Sie zwei 20 &amp;mgr; l Tropfen destilliertes Wasser und zwei 25 &amp;mgr; l Tropfen Uranyl Formiatlösung auf einem Stück Parafilm (Abb. 3B). </li><li> Halten Sie ein glow-entladen Gitter mit Reverse-force anti-Kapillare Pinzette mit dem Autobon-beschichteten Seite nach oben zeigt. Hinweis: Es ist notwendig, um anti-Kapillare Pinzette verwenden. Andernfalls wird flüssige Probe vom Gitter durch die Kapillarkraft zwischen der Zange angesaugt werden. </li><li> Übernehmen 2μl Protein Probe auf die glow-entladen Netz, und warten Sie 30 Sekunden. Hinweis: Die Wartezeit und die Länge der Glimmentladung Einfluss auf die Konzentration von Proteinen in das Gitter adsorbiert. Sehr verdünnte Proben erfordern längere Adsorptionszeiten. Allerdings kann eine längere Adsorption Änderung der Konzentration des Puffers, da Wasserdampf. Um eine ordnungsgemäße Partikelverteilung in Grid erfordert etwas Versuch und Irrtum-Methode. </li><li> Blot aus der Probe mit Filterpapier. </li><li> Berühren Sie das Grid Oberfläche eines Wassertropfens und dann anschließend das Wasser abtupfen mit Filterpapier. Wiederholen Sie mit dem 2. Tropfen Wasser. </li><li> Berühren Sie das Grid Oberfläche, um die ersten Tropfen Fleck kurz. Blot Sie den Fleck Lösung mit Filterpapier. </li><li> Berühren Sie das Grid Oberfläche auf den zweiten Tropfen Fleck für 20 Sekunden. Blot off Färbelösung mit Filterpapier. </li><li> Trocknen Sie die Gitter mit einem Vakuum. Hinweis: Man kann auch verlassen Gitter auf der Bank oder in einer chemischen Haube an der Luft trocknen. Der Vorteil der Vakuum trocken ist, dass man die Netze in der EM sofort zu beobachten. Die möglichen Artefakt durch schnelle Trocknung erzeugt ungleichmäßige Flecken. </li></ol> 5. Transmissions-Elektronenmikroskop <ol><li> Das Mikroskop in dieser Demonstration wird ein Tecnai T12 (FEI Company) mit einem Gatan 4K x 4K CCD-Kamera ausgestattet. </li><li> Kurz überprüfen Sie die Ausrichtung des Mikroskops vor dem Einsetzen Probe; Hinweis: Dies ist nur erforderlich, einmal pro EM-Sitzung. In einem Modell Mikroskop können nahezu perfekte Ausrichtung einer älteren Version gespeichert werden. Lädt eine solche Ausrichtung Datei sollte dem Mikroskop Ausrichtung auf eine nahezu perfekte Zustand wiederherzustellen. </li><li> Laden Sie die EM Gitter im Singleframe kippen Standard Probenhalter. </li><li> Legen Halter in CompuStage der T12. Warten Sie auf den Pumpzyklus in Anspruch nehmen. </li><li> Setzen Sie den Halter in die Spalte. &lt;/ Li&gt; </li><li> Fokus Probe und eine gewünschte Unschärfe, in der Regel-1.5um. Hinweis: Die Fokussierung kann entweder manuell durch Fokussierung mit dem minimalen Kontrast-Methode oder mittels CCD-Kamera Live-Bilder erfassen und berechnen leben Fourier Leistungsspektrum erreicht werden. </li><li> Rekord ein Bild mit CCD-Kamera; </li><li> In Bilder von negativ angefärbten Proteine ​​Proben, sind Proteine, oft mit Weiß-Kontrast, also weiß Dichte gegen einen dunkleren Hintergrund zu sehen. Beachten Sie, dass während der Protein-Konzentrationen in verschiedenen Bereichen des gleichen Raster sind in der Regel sehr ähnlich, man muss unterschiedliche Färbung in verschiedenen Bereichen des gleichen Raster zu beobachten. Manche Gebiete haben könnte ungleichmäßige Färbung oder sogar positive Färbung (Protein erscheint dunkel auf hellem Hintergrund), während einige andere Gebiete perfekte Fleck haben. Es ist oft notwendig, das Netz Suche auf einem guten Bereich für die Bildgebung zu finden. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Beispiele für typische gute Bilder von negativ stainiert Proben, Pferd Ferritin (Abbildung 4A), Fab (4B), Archaea 20S Proteasom (Abb. 4C) und Nukleosomen (Abb. 4D), gezeigt werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Vorbereitung von Kohlenstoff Roste für negative Färbung EM. A) Plazierung EM-Gitter one-by-one in einer geschlossenen Verpackung Muster auf der Oberfläche von Kollodium Film. B) Platzierung ein Stück Papier etwas größer als die Fläche der Netze. C) Warten Sie, bis das Papier wird komplett nass. D) Nehmen Sie das Papier zusammen mit den Gittern für Luft-Trocknung. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. . Coating EM-Gitter mit Kohlenstoff-A)-Setup des Kohlenstoffs Verdampfer: Legen Sie die beiden Kohlenstoff-Stäbchen in der Beschichtungsanlage, mit einem Stab (links) geschärft zu einem Punkt Spitze. Die andere Stange (rechts) hat eine flache Oberfläche und kommen in Kontakt mit dem Punkt Spitze des einen in die entgegengesetzte side. B) Legen Sie eine kleine Menge Vakuumfett in einer Seite eines gefördert Glasträger. Der Bereich innerhalb des schwarzen Rahmens ist Vakuumfett. C) Setup der Netze für die Beschichtung. Die Glasträger werden verwendet, um das Papier in Position zu halten. Die Pfeilspitze zeigt den Bereich mit Vakuum-Fett. D) Nach der Beschichtung wird die Farbe der Folie mit Vakuum-Fett bedeckt nicht die Farbe. Der Kontrast zeigt die Dicke des beschichteten Kohlenstoff. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Veranschaulichung der negativen Färbung. A) Frisch zubereitete (links) Uranyl Formiatlösung ist transparent, ohne Anzeichen von Niederschlägen. Nach 1 bis 2 Wochen Niederschläge beginnen, der sich in der unteren in die Boden des Röhrchens. B) Legen Sie zwei Tropfen (~ 25 &amp;mgr; l) aus destilliertem Wasser und zwei Tropfen Uranyl Formiatlösung in einem Stück Parafilm. Verwenden Sie ein Paar anti-Kapillare Pinzette, um einen Schein entlassen Kohlenstoff-beschichteten EM-Gitter mit Kohlenstoff Seite haltenup. Ein Tropfen der Probe (~ 2μl) ist in das Gitter gelegt. C) Nach einer Wartezeit von 30 Sekunden, trocknen Sie die Lösung mit einem Filterpapier. D) Flip Startplatz auf die Probe Seite des Gitters mit dem ersten Tropfen Wasser zu berühren. Wiederholen Sie den Schritt C und D, um den Prozess der Färbung abzuschließen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Beispiele für EM-Bilder von negativ gefärbten Protein-Proben. A) Pferd Ferritin, B) Fragment des Antigen-Bindung (Fab), C) Archaea 20S Proteasom und D) Nukleosomen. Alle Bilder wurden mit der gleichen Vergrößerung aufgenommen. Der Maßstab ist 20nm.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Negative Fleck EM ist ein leistungsstarkes Tool, mit dem 3D-Strukturen von gereinigtem Protein-Proben, wie z. B. die Verwendung zufälliger konische Neigung 8-Methode, die das Sammeln ein Paar Bilder mit einem von der Probe gekippt, um 60 ° und einer aus der gleichen Gegend erfordert Studie kann aber ungekippten, um 3D-Rekonstruktionen von makromolekularen Komplexen zu berechnen. Darüber hinaus, negative Färbung EM kann noch viele andere Anwendungen, wie zB Screening für zweidimensionale (2D) Kristalle von Membranproteinen 9, Visualisierung Protein-Komplexe in verschiedenen Konformationen 10, oder einfach nur zur Visualisierung von Homogenität und / oder Heterogenität von gereinigten Proteinen Probe so Bereitstellung von Rückmeldungen zum Proteinreinigung Verfahren zu verbessern, usw. Es kann ein leistungsfähiges Test für Biochemiker werden. In diesem Artikel haben wir die Protokolle von der Vorbereitung der Kohlenstoff-beschichteten Gitter zu sammeln Bilder von negativ angefärbten Protein-Proben in einem Elektronenmikroskop. Wie hier dargestellt,das Verfahren ist relativ einfach und leicht zu folgen. Wenn Sie versuchen, 3D-Rekonstruktionen der Probe durch zufällige konische Neigung Methode beobachtet zu berechnen, ist es notwendig, kippen Paar Bilder zu erwerben. Allerdings, wenn die Durchführung Einzelpartikelanalyse ist der Zweck, werden mehrere ungekippten Bilder ausreichen. In beiden Fällen ist eine weitere Bildverarbeitung erforderlich, und dies würde den Rahmen dieses video Artikel. Wie bei jeder Methode gibt es Änderungen an den Protokollen. Uranyl-formiat funktioniert sehr gut als eine negative Färbung Reagenz in den meisten Fällen. Uranylacetat ist eine weitere häufig eingesetzte Negativfärbung Reagenz. Es funktioniert sehr ähnlich wie Uranyl Formiat, aber mit einer größeren Korngröße und, in vielen Fällen einen geringeren Kontrast als Uranyl-Formiat. Der Vorteil der Verwendung Uranylacetat ist, dass die Lösung länger als Uranyl-formiat dauert. Man braucht nicht zu einer frischen Lösung vorzubereiten alle ein bis zwei Wochen. Beide Uranyl Formiat und Acetat sind sauer. Ein offensichtliches Problem ist, dass dieniedrigen pH-Wert können Veränderungen im Protein zu untersuchende Probe zu induzieren. Beide Flecken Lösungen funktionieren auch als Protein Fixiermittel. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass sowohl fix Protein-Proben schnell 7. Diese schnelle Fixierung macht die niedrigen pH-Wert weniger wichtig. Während des Prozesses der Färbung, fest ein Protein Probe wird vor dem niedrigen pH-Änderungen hervorrufen kann. Dennoch können andere negative Färbung Reagenzien, wie Ammoniummolybdat und Phosphorwolframsäure, bessere Ergebnisse für die Färbung Proben bei niedrigen pH-Wert ist ein für 7. Beide Ammoniummolybdat und Phosphorwolframsäure einen etwa neutralen pH-Wert, sondern der Kontrast der Protein-Proben von diesen Flecken erzeugt wird, in der Regel schlechter als Uranyl-Formiat.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Collodion </td><td> Electron Microscopy Sciences, PA, USA </td><td> 12620-30 </td><td> 30ml, 2% in Amylacetat </td></tr><tr><td> Gilder Cu Netze </td><td> Ted Pella Inc., USA </td><td> G400/G200 </td><td> 400/200 mesh </td></tr><tr><td> Cressington 208C High Vacuum Turbo Carbon-Coater </td><td> Ted Pella Inc., USA </td><td> 9260 </td><td></td></tr><tr><td> Doppel wies Carbon Stab </td><td> Ted Pella Inc., USA </td><td> 58 </td><td></td></tr><tr><td> Uranyl-formiat </td><td> Electron Microscopy Sciences, PA, USA </td><td> 16984-59-1 </td><td> 99,9% Reinheit </td></tr><tr><td> PELCO easiGlow GlowDischarge System </td><td> Ted Pella Inc., USA </td><td> 91000 </td><td> Kaufen Sie bei der örtlichen Apotheke </td></tr><tr><td> Whatman Nr. 1 Filterpapier </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-805E </td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing proteine ​​und makromolekulare komplexe von negative stain em: von grid vorbereitung auf image acquisition

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Einzelne Partikel-Elektronenmikroskopie (EM), der sowohl negative als auch gebeizt oder gefroren hydratisierten biologischen Proben, hat sich zu einem vielseitigen Werkzeug in der Strukturbiologie 1. In den letzten Jahren hat diese Methode großen Erfolg in Studium Strukturen von Proteinen und makromolekularen Komplexen 2, 3 erreicht. Verglichen mit Elektronen Kryomikroskopie (cryoEM), in dem gefrorenen hydratisierten Protein-Proben in einer dünnen Schicht aus glasigem Eis 4 eingebettet sind, ist negative Färbung eine einfachere Probenvorbereitung Methode, bei der Protein-Proben in einer dünnen Schicht aus getrocknetem Schwermetallsalz eingebettet sind zu erhöhen Probe Gegensatz 5. Die verbesserten Kontrast des negativen Fleck EM ermöglicht die Untersuchung von relativ kleinen biologischen Proben. Neben der Bestimmung von dreidimensionalen (3D) Struktur der gereinigten Proteine ​​oder Proteinkomplexe 6, kann diese Methode für viel breiter genutzt werden. Zum Beispiel, negative Färbung EM problemlos eingesetzt werden kann, um zu visualisieren gereinigtProtein-Proben, um Informationen wie Homogenität / Heterogenität der Probe, die Bildung von Protein-Komplexe und große Baugruppen, oder einfach, um die Qualität eines Proteins Vorbereitung zu bewerten. In diesem Video-Artikel präsentieren wir ein vollständiges Protokoll für den Einsatz eines EM negativ gefärbten Protein Probe zu beobachten, von der Vorbereitung Kohlenstoff beschichtete Netze für negative Färbung EM auf den Erwerb Bilder von negativ gefärbten Probe in einem Elektronenmikroskop bei 120 kV Beschleunigungsspannung betrieben. Diese Protokolle haben in unserem Labor routinemäßig und lassen sich leicht um unerfahrene Anwender zu beachten.

Visualizing Protein-Proben von negativen Fleck-Elektronenmikroskopie (EM) hat sich zu einem beliebten Strukturanalyse Methode. Es ist für die quantitative Struktur-Analyse nützlich, wie zum Beispiel die Berechnung einer 3D-Rekonstruktion der Moleküle untersucht, und auch für qualitative Prüfung der Qualität von Protein-Präparationen. In diesem Artikel präsentieren wir detaillierte Protokolle für die Vorbereitung der EM-Gitter, Färbung der Probe und die Visualisierung der Probe in einem Elektronenmikroskop. Unerfahrene Benutzer können diese Protokolle einfach zu folgen und zu nutzen Negativfärbung EM als Routine-Test, zusätzlich zu anderen biochemischen Assays für die Bewertung ihrer Protein-Proben.

Visualizing Proteine ​​und Makromolekulare Komplexe von Negative Stain EM: von Grid Vorbereitung auf Image Acquisition

Die Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie (EM), sowohl von negativ gefärbten als auch von gefriergetrockneten bzw. kryokonservierten biologischen Proben, hat sich zu einem vielseitigen Werkzeug in der strukturellen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, gereinigte Proteinproben mittels Elektronenmikroskopie mit negativer Kontrastfärbung sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Elektronenmikroskopie-Gitter vorbereitet werden, die die Probe tragen sollen. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in der Herstellung der Lösung für die negative Kontrastfärbung.Anschließend wird die Probe auf das Elektronenmikroskopie-Gitter aufgebracht und negativ gefärbt. Abschließend wird das EM-Gitter in ein Elektronenmikroskop eingebracht, und Bilder werden unter geeigneten optischen Bedingungen aufgenommen. Konventionelle Hellfeld- und DEM-Aufnahmen weisen einen hohen Kontrast und scharfe Details auf und zeigen einzelne Makromoleküle, die über einen strukturlosen Hintergrund verstreut sind.Die Negativkontrast-Elektronenmikroskopie ist eine einfache Methode, um Ihr Lieblingsprotein sichtbar zu machen. Sie kann als routinemäßiger Test verwendet werden, um Ihr gereinigtes Protein entweder für strukturelle Analysen oder andere biochemische und biophysikalische Untersuchungen zu überprüfen. Hier zeigen wir, wie man eine negativ kontrastierte Probe für die Elektronenmikroskopie vorbereitet.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist hilfreich, da einige Schritte schwer allein anhand von Textbeschreibungen und Abbildungen zu erlernen sind. Beginnen Sie damit, mit einer Glaspipette einen einzelnen Tropfen Collodium auf die Wasseroberfläche in einem großen Becher mit Wasser aufzutragen. Während sich das Collodium ausbreitet, kann es Staub von der Wasseroberfläche einfangen.Entfernen und ersetzen Sie einen staubigen Collodion-Kunststofffilm durch einen weiteren Tropfen. Legen Sie anschließend zwischen 50 und 100 EM-Gitter einzeln mit der glänzenden Seite nach unten auf den schwimmenden Kunststofffilm. Wählen Sie 400er-Maschen-Gitter für die routinemäßige Negativfärbung und 200er-Maschen-Gitter.Zum Sammeln von Kipp-Paar-Bildern. Wählen Sie ein Stück Papier mit geringer Saugfähigkeit und ohne Falten, das etwas größer ist als der Bereich der Gitter. Legen Sie das Papier auf die Gitter und warten Sie, bis das Papier vollständig durchnässt ist.Das Papier sollte Wasser nicht zu schnell absorbieren. Wir verwenden Papier aus einem preiswerten Notizblock. Die Gitter liegen nun zwischen der Kunststofffolie und dem Papier. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Papier in eine Petrischale zu legen und langsam an der Luft trocknen zu lassen. Vermeiden Sie schnellere Trocknungsmethoden, da diese zu Falten führen können. Die Kohlenstoffbeschichtungsanlage, die in unserem Labor verwendet wird, ist eine Creston 2 0 8 C Hochvakuum-Turbo-Kohlenstoffbeschichtungsanlage.Ausgestattet mit einem Creston-Dickenmessgerät für Filme. Das Messgerät nutzt eine Quarzwaage, die empfindlich gegenüber Kohlenstoffablagerungen ist. Das hier beschriebene Protokoll erfordert dieses Gerät jedoch nicht. Beginnen Sie damit, die Kohlenstoffstäbe in einer Kohlenstoffbeschichtungsmaschine zu spitzen und zu laden.Nächste Beschichtung: Eine Objektträger mit Vakuumfett beschichten, wobei die Hälfte des mattierten Bereichs unbeschichtet bleibt. Nach der Kohlenstoffbeschichtung werden die mit Fett behandelten Bereiche des Objektträgers verwendet, um die Dicke der Kohlenstoffschicht abzuschätzen. Legen Sie das Papier mit den Gittern auf den Halter unter der Vakuumglocke der Kohlenstoffbeschichtungsanlage. Positionieren Sie den beschmierten Glasobjektträger.Schieben Sie neben die Gitter. Pumpen Sie die Vakuumkammer auf mindestens 10 Mikrotorr auf, da sonst Funkenbildung viele große Partikel im Gitter erzeugt. Erhöhen Sie nun den Strom sehr langsam.Die scharfe Spitze der Kohlenstoffstange wird äußerst hell leuchten. Beobachten Sie sie nicht mit bloßem Auge, sobald die Beschichtung beginnt. Der Objektträger verfärbt sich dunkelgrau, während sich die Kohlenstoffschicht aufbaut. Unterbrechen Sie den Strom bei der gewünschten Kohlenstoffschichtdicke und berücksichtigen Sie dabei die Durchsichtigkeit des Glasglockengehäuses. Sobald die Dunkelheit des Objektträgers auf die Dicke der Kohlenstoffschicht kalibriert ist, ist diese Methode genauso genau wie der kostspieligere Schichtdickenmonitor.Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, entlüften Sie die Vakuumkammer und nehmen Sie die beschichteten Gitter für die spätere Verwendung heraus. Die dünne Kunststoffschicht beeinträchtigt nicht die Qualität des negativ gefärbten Bildes, kann jedoch durch Einweichen der Gitter in Chloroform über mehrere Stunden vor dem Fortfahren entfernt werden. Stellen Sie eine frische Uranylformiat-Lösung her oder verwenden Sie eine Lösung, die weniger als zwei Wochen im Dunkeln aufbewahrt wurde.Eine gute, frische Lösung hat eine gelbe Farbe, einen pH-Wert von etwa vier und läuft sehr klar ohne Niederschläge. Beginnen Sie damit, ein handelsübliches System zum Leuchten zu bringen. Entladen Sie die mit Kohlenstoff beschichteten Gitter.Als Nächstes zwei 20-Mikroliter-Tropfen destilliertes Wasser und zwei 25-Mikroliter-Tropfen frische Urinalformat-Lösung auf ein Stück Perfil geben. Mit einer reversen kapillaren Pinzette eine entladene, mit Kohlenstoff beschichtete Netzseite nach oben haltend festhalten. Wichtig ist, dass diese Pinzette keine Flüssigkeit von den Netzen absaugt.Tragen Sie nun zwei Mikroliter der Proteinstichprobe auf das Raster auf und warten Sie, bis die Proteine in das Raster eingedrungen sind. Dies dauert typischerweise 30 Sekunden, jedoch benötigen sehr verdünnte Proben mehr Zeit, was die Pufferkonzentrationen beeinflussen kann. Danach entfernen Sie die Proteinstichprobe mit Filterpapier ab. Anschließend den Träger zweimal waschen, indem man seine Oberfläche kurz mit einem Wassertropfen in Berührung bringt und innerhalb weniger Sekunden trocken tupft. Nachdem das Wasser den Träger kurz berührt hat, diesen mit einem Tropfen Färbemittel in Kontakt bringen und schnell trocken tupfen. Mit derselben Technik den Träger anschließend 20 Sekunden lang mit einem zweiten Tropfen Färbemittel in Berührung halten. Trocknen Sie das Raster abschließend an der Bankabzugshaube luftdurchlässig oder vorzugsweise im Vakuum vor der EM-Session. Überprüfen Sie die Ausrichtung des EM-Mikroskops, indem Sie eine optimierte Ausrichtungsdatei laden, sofern verfügbar; dies sollte es nahezu perfekt ausrichten. Laden Sie nun das EM-Raster auf einen Standardprobenträger mit Einzelkippvorrichtung. Danach setzen Sie den Träger in die Probehalterung ein.Warten Sie dann, bis der Pumpzyklus abgeschlossen ist, und setzen Sie den Halter in die Säule ein. Suchen Sie nun manuell nach einer Probenstelle mit guter Färbung, indem Sie entweder die Methode des minimalen Kontrasts verwenden oder eine CC, D-Kamera nutzen und den Live-Vierer berechnen.Ihr Leistungsspektrum. Stellen Sie dann den Tiefenfokus nach Bedarf ein, üblicherweise auf negative 1,5 Mikrometer. Die Färbekonzentration kann über das Gitter variieren, daher suchen Sie nach Proteinen mit weißem Kontrast.Vermeiden Sie Bereiche mit ungleichmäßiger Färbung oder positiver Färbung, bei denen der Protein-Kontrast schwarz wird. Unter Verwendung des beschriebenen Ansatzes zur Herstellung von Gittern und zur Visualisierung negativ gefärbter Proben wurden mehrere bekannte Proteine zu Demonstrationszwecken abgebildet.Achten Sie auf ihre Detailgenauigkeit und den scharfen Kontrast. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie gut verstehen, wie man Proben negativ gefärbter Makromoleküle zur Beobachtung im Elektronenmikroskop herstellt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in etwa vier Stunden durchgeführt werden.Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die 3D-Rekonstruktion durchgeführt werden, um molekulare Strukturen besser zu verstehen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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