Name: Ice-Cap: Ein Verfahren zur Züchtung von Arabidopsis Und Tomatenpflanzen in 96-well-Platten für High-Throughput-Genotypisierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Erfahren Sie die Ice-Cap-Methode zur Hochdurchsatz-Genotypisierung von Arabidopsis- und Tomatenpflanzen in 96-Well-Platten. Diese Technik ermöglicht die effiziente Isolierung von Wurzelgewebe für DNA-Extraktion.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Science Foundation (Grant-Nummer MCB-0447750) gefördert.

<ol><li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+%28Ice-Cap+2.0%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li>
<li>Krysan, P. I. ce-cap <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li>
<li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li>
<li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li>
<li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li>
<li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li>
<li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iTILLING%3A+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li>
<li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING%3A+practical+single-nucleotide+mutation+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li>
<li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li>
<li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+%28TILLING%29+for+plant+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Ice-Cap hier vorgestellte Methode ermöglicht ein Wissenschaftler an Gewebeproben von Hunderten oder sogar Tausenden von einzelnen Pflanzen an einem einzigen Tag zu sammeln und effizient zu extrahieren genomischer DNA aus den Proben für den Einsatz in Genotypisierung Reaktionen. Durch die Aufgabe von einzelnen Wissenschaftler die Möglichkeit, Tausende von Setzlingen in einem kurzen Zeitraum Genotyp hat der Ice-Cap-Methode das Potenzial, eine Reihe von genetischen Experimenten, die sonst nicht sinnvoll sein, führen Sie erleichtern würde. Einige Beispiele sind unten angegeben. <ol><li> Genetic Mapping. Fine-Skala genetische Kartierung kann beschleunigt werden, wenn der Forscher in der Lage ist, um eine Rekombination Ereignisse innerhalb eines bestimmten Intervalls entlang der Chromosom 3 identifiziert werden. Wenn dieses Intervall mit einem sehr kurzen genetischen Distanz, dann die Rekombination Veranstaltungen werden relativ selten in der Trennung Mapping Bevölkerung. Aus diesem Grund kann es notwendig sein, um Bildschirm Tausende von einzelnen Pflanzen, um die gewünschte wieder findenrekombinante Individuen. Dieser Prozess könnte wesentlich durch den Einsatz von Ice-Cap beschleunigt werden. Auch im Zeitalter der Genom-weite Re-Sequenzierung, ist es noch notwendig, um direkt zu demonstrieren, dass eine bestimmte Mutation direkt verantwortlich für einen Phänotyp von Interesse ist. In diesen Fällen wird es notwendig sein, die interessierende Mutation weg zu trennen von anderen eng miteinander verknüpft Mutationen um zu beweisen, ein Kandidat Mutation tatsächlich ursächlich. In diesen Situationen würde Ice-Cap bieten eine effiziente Methode für das Brechen Verknüpfung zwischen einem Paar eng miteinander verbunden Mutationen. </li><li> Multi-Mutanten. Es hat sich für die Forscher studieren Arabidopsis, um mutierte Allele von mehreren verschiedenen Loci in einer einzigen Person zu kombinieren, um funktionelle Redundanz 4-6 überwinden gemeinsam. Als Beispiel betrachten wir einen Fall, wo man wünscht, Mutanten-Allele aus vier verschiedenen Loci kombinieren in einer einzigen Pflanze durch genetische Kreuzung. Für dieses Projekt wird es notwendig sein, einen zu generierenn Person, heterozygot ist an diesen vier loci als Teil der Kreuzung Schema. Wenn diese Vierfach-heterozygote Sets Saatgut ist die vierfache homozygote voraussichtlich mit einer Rate von einem von 256 in der daraus resultierenden Population von Nachkommen präsentieren. Screening für diesen seltenen Einzelfällen mit herkömmlichen Methoden wäre ziemlich arbeitsintensiv. Im Vergleich dazu würde mit Ice-Cap für dieses Projekt der Wissenschaftler mit einer effizienten Strategie zur Identifizierung der seltenen Vierfach-Homozygoten in einer einzigen Generation bieten. </li><li> iTILLING. Unser Labor kürzlich über einen neuen Ansatz zur Screening auf das Vorhandensein von induzierten Mutationen in Genen von Interesse in Arabidopsis 7. Diese Methode ist eine Variante einer etablierten Technik namens TILLING, dass wird verwendet, um Mutationen in geordneten Populationen von Individuen mit einem chemischen Mutagen 8-10 behandelt zu finden. Wir haben unsere Methode iTILLING genannt, weil es eine individualisierte Version des TILLING, dass ein ind erlaubt istividual Wissenschaftler zu erreichen etwas, das traditionell ein großes Forscherteam um komplette verlangt hat. Ice-Cap ist ein integraler Bestandteil der iTILLING Methode 7, wie unten beschrieben. </li></ol> Die Idee hinter iTILLING ist eine ephemere mutierten Bevölkerung, die im Gegensatz zu den langlebigen Mutanten Bevölkerung für traditionelle TILLING Projekte erstellt steht zu produzieren. Für iTILLING werden die Samen aus einer bulked M2 Bevölkerung in 50 bis 100 Ice Cap Blöcken gesät, und die DNA extrahiert wird mit dem Ice-Cap-Verfahren. Arabidopsis-Keimlinge sind dann bei 4 ° C, während Mutations-Screening erfolgt mit dem Ice-Cap DNA preps. Tomatenjungpflanzen sind bei 12 ° C gelagert. Wenn Sämlinge tragen gewünschten Mutationen identifiziert worden sind, werden sie aus dem Ice-Cap Platten wiederhergestellt und an Boden. iTILLING ist nicht beabsichtigt, eine langfristige mutierten Bevölkerung für eine gesamte Forschung auf dem Bildschirm sorgen. Stattdessen bietet iTILLING eine Strategie, durch dieein Wissenschaftler kann eine benutzerdefinierte mutierten Bevölkerung auf Mutationen in einer Handvoll von Genen schnell Bildschirm, effizient und auf einem relativ niedrigen Kosten. Wir haben Ice-Cap gefunden, um eine effektive Methode für den Anbau und die Genotypisierung Arabidopsis, Tomaten und Reis. Wir erwarten, dass andere Arten von Pflanzen sollte auch zugänglich sein Ice-Cap. Eine Einschränkung auf die Vielfalt der Arten, die von Ice-Cap untergebracht werden kann, ist die Größe der Samen. Nur Pflanzen mit Samen klein genug, um in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte fit ist kompatibel mit Ice-Cap in seiner jetzigen Konfiguration.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> Spex / CertiPrep, Metuchen, NJ </td><td> 2000 Geno / Grinder </td><td> Maschinen zum Schütteln Root-Platten für die DNA-Extraktion </td></tr><tr><td> ABgene Thermo-Sealer </td><td> ABgene USA </td><td> AB-0384 </td><td> Manuelle Heißsiegelmaschine verwendet werden, um Root-Platten vor Gewebeaufschluss </td></tr><tr><td> Zentrifuge ausgestattet mit schwingenden Mikrotiterplattenträger </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra 25R </td><td> Jede Zentrifuge mit schwingenden Microplatte Träger geeignet wären </td></tr><tr><td> MICROFILL Microplate Dispenser </td><td> BioTek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> Automatisierte Flüssigkeitsspender zum Befüllen Mikrotiterplatten </td></tr><tr><td> Bialetti Marke17x11 Zoll Handelsregister großen Backblech </td><td> Ziel Kaufhaus </td><td> www.bialetti.com </td><td> Diese spezifische Backblech hat die ideale Tiefe für Ice-Cap </td></tr><tr><td> Custom Made Metallgestell </td><td> Eisenwarengeschäft </td><td></td><td> Siehe Text für vollständige Beschreibung </td></tr><tr><td> 33 Liter Kunststoff-Aufbewahrungsbox </td><td> Ziel Kaufhaus </td><td> Sterilite Marke </td><td> Für Ice-Cap-Brunnen. Kunststoff-Aufbewahrungsbox groß genug, um die 17x11 Zoll Backblech halten </td></tr><tr><td> 30 Gallonen pro Stunde Wasserspielpumpen </td><td> Sunterra </td><td> 104506 </td><td> Kleine Tauchpumpe Brunnen Pumpe unter Garten-Versorgung-Läden </td></tr><tr><td> Schlauch für Brunnen-Pumpe </td><td> Jedes Labor EVU </td><td></td><td> Hose mit Brunnen Pumpe </td></tr><tr><td> Plastic Clamp </td><td> Eisenwarengeschäft </td><td></td><td> Clamp-Schlauch zu halten CookieBlatt </td></tr><tr><td> Klare Kunststoffdeckel von Falcon Microtest flachem Boden 96-well Platten aus Polystyrol </td><td> BD Falcon www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td> Klare Kunststoff Abdeckungen für Ice-Cap Sämling Plates </td></tr><tr><td> 3M Micropore chirurgischen Band </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch Durchmesser Edelstahlkugeln </td><td> Hartford Technologies, Rocky Hill, CT </td><td> 034 bis 006-1K </td><td> Wird verwendet, um Wurzelgewebe nach der Ernte zerstören </td></tr><tr><td> 3-Zoll-Elastic Haarbänder </td><td> Lokale Lebensmittelgeschäft </td><td></td><td> Wird verwendet, um Root-Platte zu Platte zu sichern Sämling </td></tr><tr><td> 4 mm Durchmesser Holzspieße </td><td> Lokale Lebensmittelgeschäft </td><td></td><td> Diese Spieße werden in der Regel verwendet, um kabobs vorbereiten </td></tr><tr><td> Fisher Scientific Nunc Marke 1-mL Filterplatten ohne Fritte </td><td> Fisher Scientific </td><td> 278012 </td><td> 96-well Platten Sämling mit Löchern im Boden. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-242 </td><td> 96-well Platten Wurzel </td></tr><tr><td> Agar - Zellkultur getestet </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Morpholinethansulfonsäure (MES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Murashige und Skoog (MS) basalen Salzmischung </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-5524 </td><td></td></tr><tr><td> Easy Peel Wärme Dichtfolie </td><td> ABgene USA </td><td> AB-0745 </td><td> Heißsiegelfolie zur Abdichtung Root-Platten vor Gewebeaufschluss </td></tr><tr><td> Ente Marke Extra Wide Tape, 3,00 &quot;x 54,6 m </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> Artikel-Nr. 21242139 </td><td> Klebebandzum Abdichten von Mikroplatten mit DNA-Extrakten für die Lagerung </td></tr><tr><td> Siegelwalze </td><td> Bio-Rad </td><td> MSR-0001 </td><td> Hand gehalten Rollwerkzeug zum Pressen Dichtband auf Mikrotiterplatten </td></tr><tr><td> 96-Loch-Metall Thermoblock </td><td> Cole-Parmer </td><td> 36400-66 </td><td> Wird verwendet, um die Root-Platten für die Gewebe-Ernte eingefroren </td></tr><tr><td> Whatman Filterpapier </td><td> Whatman International </td><td> 1002 090 </td><td> Wird für die Oberfläche Sterilisation Samen </td></tr><tr><td> Einweg-Pasteur Pipette </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 bis 678-6A </td><td> 5 ¾ &quot;Einweg-Pasteur-Pipette für die Übertragung von Samen Sämling Platte verwendet </td></tr><tr><td> Pyrex Backform (20 cm x 30 cm) </td><td> Ziel Kaufhaus </td><td></td><td> Wird verwendet, um einem Trockeneis / Ethanol-Bad zu bauen. </td></tr></tbody></table>

ice-cap: ein verfahren zur züchtung von arabidopsis und tomatenpflanzen in 96-well-platten für high-throughput-genotypisierung

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Es wird immer für den Anlagenbau Wissenschaftler gemeinsam Projekte, die die Genotypisierung einer großen Zahl von Anlagen erfordern entwickeln. Der erste Schritt in eine Genotypisierung Projektes ist es, eine Gewebeprobe aus einzelnen Pflanzen zu sammeln. Der traditionelle Ansatz, um diese Aufgabe ist es, Probe Pflanzen one-at-a-time. Will man Genotyp Hunderte oder Tausende von Einzelpersonen, aber mit dieser Strategie führt zu einer deutlichen Engpass bei der Genotypisierung Pipeline. Die Ice-Cap-Methode, die wir hier beschreiben, ist ein High-Throughput-Lösung für diese Herausforderung, indem ein Wissenschaftler, um Gewebe aus mehreren tausend Sämlinge an einem einzigen Tag 1,2 sammeln. Dieses Maß an Durchsatz wird durch die Tatsache, dass Gewebe aus Pflanzen ist 96-at-a-time geerntet, sondern als ein-at-a-time. Die Ice-Cap-Verfahren stellt eine integrierte Plattform für die Durchführung Sämlingwachstum-, Gewebe-Ernte, und die DNA-Extraktion. Die Grundlage für die Ice-Cap ist das Wachstum der seedlings in einem gestapelten Paar von 96-Well-Platten. Die Brunnen der oberen Platte enthalten Stecker von Agar Nährmedien, auf denen einzelne Sämlinge keimen. Die Wurzeln wachsen nach unten durch den Agar-Medien, beenden Sie das obere Platte durch ein Loch, und gelangen in eine untere Platte mit Wasser. Zur Ernte Gewebe zur DNA-Extraktion, das Wasser in der unteren Platte, die Wurzel Gewebe schnell eingefroren, solange die Keimlinge in der oberen Platte bei Raumtemperatur bleiben. Die obere Platte wird dann von der unteren Platte, geschält Nachgeben einer Platte mit 96 root Gewebeproben in Eis und eine Platte mit 96 lebensfähige Sämlinge eingefroren. Die Technik trägt den Namen &quot;Ice-Cap&quot;, weil es Eis verwendet, um die Wurzel Gewebe zu erfassen. Der 96-Well-Platte mit den Setzlingen kann dann in Folie verpackt und auf niedriger Temperatur. Dieser Prozess setzt ein weiteres Wachstum der Sämlinge, aber keinen Einfluss auf ihre Lebensfähigkeit. Nach Analyse des Genotyps abgeschlossen ist, können Sämlinge mit den gewünschten Genotyp aus dem 96-Loch-p übertragen werdenspät, um Boden für die weitere Vermehrung. Wir haben den Nutzen des Ice-Cap-Verfahren mit Arabidopsis thaliana, Tomaten und Reis Sämlinge unter Beweis gestellt. Wir erwarten, dass die Methode sollte auch für andere Arten von Pflanzen mit Samen klein genug, um in die Vertiefungen von 96-Well-Platten passen.

Die Ice-Cap-Verfahren erlaubt es, Pflanzen in 96-Well-Platten und zerstörungsfrei Ernte Wurzelgewebe von jedem Sämling wachsen. DNA von dieser Wurzel Gewebe extrahiert werden können für die Genotypisierung Reaktionen eingesetzt werden. Wir haben festgestellt, dass Ice-Cap gut für<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;, Tomaten und Reis Sämlinge.

Ice-Cap: Ein Verfahren zur Züchtung von Arabidopsis Und Tomatenpflanzen in 96-well-Platten für High-Throughput-Genotypisierung

Es wird für Pflanzenwissenschaftler immer üblicher, Projekte zu entwickeln, die eine Genotypisierung einer großen Anzahl von Pflanzen erfordern. Der erste Schritt bei jeder Genotypisierung ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, Wurzelgewebeproben von in 96-Loch-Platten gezogenen Pflanzenkeimlingen zur DNA-Extraktion und Genotypisierung zu isolieren. Dies wird erreicht, indem Keimlinge zunächst in speziellen 96-Loch-Platten mit Agar-Wachstumsmedium, die an der Unterseite jedes Wells über Löcher verfügen, keimen gelassen werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Keimlingsplatte auf eine Standard-96-Loch-Platte, die mit Wasser gefüllt ist, aufzustapeln.Nachdem die Wurzeln in die untere 96-Well-Platte hineingewachsen sind, werden die gestapelten Platten in einen Gefrierblock gegeben, um das Wasser in der unteren Platte einzufrieren. Im letzten Schritt wird die obere Platte von der unteren Platte abgezogen, wodurch die Wurzeln abgebrochen werden und in der unteren Platte eingefroren bleiben. Letztendlich können die resultierenden Wurzelgewebeproben verwendet werden, um DNA-Proben von jeder einzelnen Pflanze zur Genotyp-Analyse zu gewinnen.Der Hauptvorteil von Ice-Cap im Vergleich zu alternativen Methoden liegt darin, dass man DNA von mehreren tausend Pflanzen an einem einzigen Tag isolieren kann. Diese Produktivität ist möglich, weil bei Ice-Cap 96 Pflanzen gleichzeitig bearbeitet werden, anstatt wie traditionell üblich jeweils eine einzige Pflanze. Beispiele für die Anwendung von Ice-Cap sind die Untersuchung großer Pflanzenpopulationen zur Identifizierung seltener Rekombinanten zwischen eng verknüpften IDE, die Erzeugung von Pflanzen, die eine große Anzahl verschiedener kartierter Mutationen tragen, sowie die Durchführung der markergestützten Selektion bei Nutzpflanzenarten.Grundsätzlich kann jedes Experiment, bei dem Kosten für die Genotypisierung und große Anzahlen einzelner Pflanzen anfallen, potenziell von dem IceCap-Gefäß profitieren. Wir haben IceCap ursprünglich für die Verwendung bei der Kaninchenabszessprobe entwickelt, hatten aber auch Erfolg damit bei der Gewinnung von Gewebe von Reis- und Tomatensämlingen. Wir erwarten, dass IceCap ebenfalls bei anderen Arten wirksam sein wird, solange ihre Samen klein genug sind, um in eine 96er-Well-Platte zu passen.Wickeln Sie die Sämlingsplatten zunächst in Folie ein und autoklavieren Sie sie gleichzeitig. Nach Beendigung des Autoklavierzyklus die durchsichtigen Kunststoffdeckel der Sämlingsplatten in 95 % Ethanol eintauchen und Sämlingsplatten sowie Deckel gründlich in einer laminaren Flusswerkbank trocknen lassen. Sobald die Platten vollständig trocken sind, am Boden jeder Sämlingsplatte Packband anbringen und mit einem Roller fest verschließen.Verwenden Sie anschließend einen Microfill-Mikroplatten-Dispenser oder einen Mehrkanalpipettierer, um 450 µL geschmolzenes Nährmedium in die Vertiefungen jeder Keimlingsplatte abzugeben. Decken Sie die Platten mit Kunststoffdeckeln ab und lassen Sie das Nährmedium bei Raumtemperatur erstarren. Streuen Sie trockene Samen auf Watman-Filterpapier und bedecken Sie jedes Samenkorn gründlich mit 95 % Ethanol.Danach die Samen vollständig an der Luft trocknen lassen. Anschließend die Samen auf die Keimlingsplatten übertragen, indem man zunächst das flammversiegelte Ende einer modifizierten Glaspipette auf die Oberfläche des Agarmediums aufsetzt. Dadurch wird die Pipettenspitze angefeuchtet, sodass ein einzelnes Samenkorn leicht aufgenommen und auf die Agaroberfläche übertragen werden kann.Wenn sich in jedem Loch ein Samen befindet, decken Sie jede Keimlingsplatte mit einem durchsichtigen Plastikdeckel ab und verschließen Sie sie mit Micropore-Chirurgenband. Wickeln Sie die gestapelten Platten mit Aluminiumfolie ein und lagern Sie sie vier Tage lang bei vier Grad Celsius, um die Samen zu stratifizieren und die Keimung zu synchronisieren. Nach vier Tagen stellen Sie die Keimlingsplatten vier weitere Tage lang unter fluoreszierendes Licht bei 18 bis 20 Grad Celsius.Um die Keimung einzuleiten, bauen Sie den Eisdeckelbrunnen in einem Regal im Pflanzenwachstumsraum so auf, dass die Oberfläche des Eisdeckelbrunnens direktem Leuchtstofflicht ausgesetzt ist. Zum Aufbau zuerst das spezielle Gestell in eine Kunststoffaufbewahrungsbox stellen und anschließend ein Backblech darauflegen.Stellen Sie mithilfe der Höheneinstellmuttern die Waagerechte des Backblechs ein. Platzieren Sie dann eine Tauchpumpe in der Aufbewahrungsbox und verbinden Sie den Auslassschlauch der Pumpe mit der Seite des Backblechs, indem Sie eine federbelastete Schelle verwenden. Füllen Sie anschließend den Eisbrunnen mit einer Mischung aus drei Teilen destilliertem Wasser und einem Teil Leitungswasser. Wasser sollte hinzugefügt werden, bis die Tauchpumpe einige Zentimeter unterhalb des Wasserstands liegt. Markieren Sie den endgültigen Wasserstand im Kunststoffbehälter mit Laborband und einem Markierstift. Bereiten Sie die Wurzelplatten vor, indem Sie eine Edelstahlkugel in jedes Loch einer 96-Loch-Wurzelplatte geben.Dann pipettieren Sie 340 Mikroliter einer Mischung aus drei Teilen destilliertem Wasser und einem Teil Leitungswasser in jedes Loch der Wurzelplatte. Entfernen Sie die Klebefolie von der Unterseite der Keimlingsplatten und nehmen Sie die durchsichtigen Plastikdeckel ab.Platzieren Sie jede Sämlingsplatte in einer Wurzelplatte, die eine Metallkugel und Wasser enthält, und befestigen Sie die beiden Platten mit zwei Gummibändern. Anschließend stellen Sie die gestapelten Platten in den Eisdeckelbrunnen. Die gepaarten Platten sollten 10 bis 14 Tage im Eisdeckelbrunnen verbleiben.Während dieser Zeit den Wasserstand im Ice-Cap-Fontäne durch Nachfüllen mit destilliertem Wasser konstant halten. Sobald bei den meisten Sämlingen Wurzelgewebe die Wurzelplatten durchdrungen hat, die Platten aus der Ice-Cap-Fontäne entfernen, um die Ernte von Wurzelgewebe vorzubereiten. Nachdem die Platten aus der Ice-Cap-Fontäne entfernt wurden, drei Holzspieße zwischen die Vertiefungen der gestapelten Sämlings- und Wurzelplatten einführen.Die Spieße heben die Zapfen der Sämlingsplatten aus den Vertiefungen der Wurzelplatten heraus. Lassen Sie die gestapelten Ice-Cap-Platten mit eingesetzten Holzspießen über Nacht unter Licht stehen. Diese Inkubation ermöglicht eine leichte Verdunstung der Flüssigkeit in den Wurzelplatten, was die anschließenden Schritte des Einfrierens und der Plattenabtrennung erleichtert.Am Tag der Gewebegewinnung bereiten Sie ein Gefriermittel vor. Stellen Sie einen 96-Loch-Metall-Wärmeblock in eine Pyrex-Schale mit einer Mischung aus Trockeneis und 95 %igem Ethanol. Lassen Sie den Wärmeblock etwa 20 Minuten lang auf Temperatur anpassen.Stellen Sie die gestapelten Eiskappenplatten mit Holzspießen auf den gekühlten Wärmeklotz und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang. Während dieser Zeit gefriert das Wasser in der Wurzelplatte vollständig. Nehmen Sie die gestapelten Eiskappenplatten aus dem Gefriermittelbad und stellen Sie sie bei Raumtemperatur auf die Laborbank; entfernen Sie die Gummibänder und die Holzspieße aus den gestapelten Platten.Drücken Sie fest auf die Oberseite der Sämlingsplatte, um die Platten zu trennen. Dann trennen Sie vorsichtig die Wurzelplatte und die Sämlingsplatte voneinander ab. Lassen Sie das Wasser in den Wurzelplatten bei Raumtemperatur auftauen.Andernfalls kann das Auftauen beschleunigt werden, indem die Wurzelplatten in einem Wärmeblock inkubiert werden. Stellen Sie eine Temperatur von 25 Grad Celsius ein, während die Wurzelplatten auftauen. Die Keimlingsplatten können für die Lagerung vorbereitet werden.Dazu den unteren Teil der Keimlingsplatte mit Klebeband versiegeln. Anschließend einen durchsichtigen Plastikdeckel auf die Keimlingsplatte legen und mit Micropore-Klebeband fixieren.Stapeln Sie die Sämlingsplatten übereinander, umwickeln Sie sie mit einer Aluminiumfolie und stellen Sie die Arabidopsis-Sämlinge bei vier Grad Celsius ab. Die Sämlinge können bei diesen Temperaturen mehrere Wochen lang gelagert werden, ohne dass die Keimfähigkeit beeinträchtigt wird. Stellen Sie sicher, dass das Wasser in den Wurzelplatten vollständig aufgetaut ist.Bevor Sie den DNA-Extraktionsprozess durchführen, überprüfen Sie zunächst die Platten, um festzustellen, ob in einigen Vertiefungen deutlich weniger Wasser vorhanden ist als im Durchschnitt, und pipettieren Sie destilliertes Wasser in die Vertiefungen, die zusätzliches Wasser benötigen. Anschließend pipettieren Sie 25 Mikroliter einer 500 Millimolar TRIS, 50 Millimolar EDTA-Lösung in jede Vertiefung der Wurzelplatte. Versiegeln Sie danach die Vertiefungen der Wurzelplatten mithilfe einer thermischen Versiegelungsfolie und einer Wärmeversiegelungsmaschine.Stellen Sie die verschlossenen Wurzelplatten mit dem verschlossenen Ende nach unten auf die Geno-Grinder-Maschine. Schütteln Sie die Platten drei Minuten und dreißig Sekunden lang bei 1.350 Hub pro Minute im Geno-Grinder. Überführen Sie die Platten in eine Zentrifuge mit Mikroplattenhaltern und zentrifugieren Sie sie zehn Minuten lang bei 3.500 U/min bei vier Grad Celsius, um das pulverisierte Wurzelgewebe zu pelletieren.Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 20 Mikroliter Überstand aus jedem Well der Wurzelplatte in eine neue 96-Well-Platte, die in jedem Well 80 Mikroliter Milli-Q-Wasser enthält. Dieser verdünnte Extrakt enthält genomische DNA, die gemäß Standardprotokollen direkt in der Genotypisierungs-PCR-Reaktion verwendet werden kann. Sobald der Genotyp jedes Sämlings identifiziert wurde, nehmen Sie die Sämlingsplatten aus der Kältespeicherung und bereiten Sie Töpfe mit wassergesättigter Bodenmischung vor, indem Sie Druckluft und einen Gummischlauch verwenden. Geben Sie sanften Luftdruck auf das kleine Loch im Well der Sämlingsplatte, um den Agar-Plug und den Sämling aus der Platte herauszudrücken, sodass sie auf die Laborbank fallen.Stechen Sie ein kleines Loch in den Boden, das etwa so groß wie der Agar-Plug ist. Legen Sie dann den Agar-Plug in das Loch und drücken Sie feuchten Boden fest um den Plug, um die Keimpflanze im Boden zu fixieren. Stellen Sie die umgepflanzten Keimpflanzen unter Licht bei 18 bis 22 Grad Celsius.Bedecken Sie jeden Topf zwei Tage lang nach der Umpflanzung mit einem Plastikdeckel. Entfernen Sie anschließend den Deckel und kultivieren Sie die Pflanze unter Standardwachstumsbedingungen. Diese Abbildung zeigt Arabidopsis-Keimlinge, die zwei Wochen lang in der Ice-Cap-Fountain kultiviert wurden und zur Gewebegewinnung bereitstehen.Jedes der beiden Löcher enthält eine Arabidopsis-Keimling. Diese Seitenansicht der gleichen beiden Löcher der Wurzelplatte zeigt die Wurzeln, die sich um die innere Oberfläche der Löcher winden. Eine beherrscht. Diese Technik kann verwendet werden, um bis zu 40 Icecap-Platten an einem achtstündigen Tag zu verarbeiten.Dadurch kann ein Wissenschaftler an einem einzigen Tag DNA-Präparationen von über 3.800 einzelnen Sämlingen herstellen. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Kulturplatten unverzüglich in den Eisbadbrunnen zu überführen, sobald die Sämlinge keimen. Überprüfen Sie die Platten täglich, um den richtigen Zeitpunkt für die Übertragung nicht zu verpassen. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Dieses Papier beschreibt zwei Methoden zur Quantifizierung von Abwehrreaktionen in Arabidopsis thaliana nach der Exposition gegenüber Immunentfernern: der vorübergehende oxidative Ausbruch und die Hemmung des Sämlingwachstums.

Muster-Triggered Oxidative Burst und Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Der Sämlingsfluttest erleichtert die schnelle Überprüfung von Wildtomaten-Beitritten auf die Resistenz gegen das Pseudomonas syringae Bakterium. Dieser Assay, der in Verbindung mit dem bakteriellen Wachstumstest verwendet wird, kann bei der weiteren Charakterisierung der zugrunde liegenden Resistenz gegen das Bakterium helfen und kann verwendet werden, um Kartierungspopulationen zu untersuchen, um die genetische Grundlage des Widerstands zu bestimmen.

High-Throughput Identifikation der Resistenz gegen Pseudomonas syringae pv. Tomate in Tomaten mit Seedling Flood Assay

Die Übersetzung der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) bietet die Möglichkeit, Entwicklungsprogramme mit minimaler Verarbeitung von Organen und Geweben zu sezieren. Das Protokoll liefert hochwertige RNA aus Zellen, die mit einem grünen fluoreszierenden Protein (GFP)-markierten ribosomalen Untereinheit begezielt sind. Nachgeschaltete Analysewerkzeuge wie qRT-PCR oder RNA-seq zeigen Gewebe- und zelltypspezifische Expressionsprofile auf.

Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

Hier beschreiben wir ein fortschrittliches Werkzeug zur Überwachung der Chlorophyllbiosynthese in den frühen Stadien der Arabidopsis-Keimlingsentetiolierung.   Die neuartige Methodik ermöglicht eine nicht-invasive Echtzeit-Chlorophyll-Fluoreszenz-Bildgebung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

Nicht-invasiver Assay zur Bestimmung der Chlorophyll-Biosynthese-Kinetik in frühen Stadien der Arabidopsis-De-etiolation

Erfahren Sie die Ice-Cap-Methode zur Hochdurchsatz-Genotypisierung von Arabidopsis- und Tomatenpflanzen in 96-Well-Platten. Diese Technik ermöglicht die effiziente Isolierung von Wurzelgewebe für DNA-Extraktion.

Ice-Cap: Ein Verfahren zur Züchtung von Arabidopsis Und Tomatenpflanzen in 96-well-Platten für High-Throughput-Genotypisierung

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