Name: Rotierende Cell Culture Systems für Human Cell Culture: Human Trophoblastzellen als Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Erfahren Sie die dreidimensionale Zellkultur mit rotierenden Systemen für humane Trophoblastzellen. Diese Methode ermöglicht realistischere in-vivo-Bedingungen und verbesserte Differenzierungsmarker im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Kulturen.

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Diese Arbeit wurde von der US National Institutes of Health NIH Zuschusses / NICHD # HD051998 (zum CAM) unterstützt.

1. Collagen Bead Vorbereitung <ol><li> Vor dem Laden EVTs für 3-D Zellkultur, muss man die Cytodex-3 Mikroträger Perlen vorzubereiten: <ol><li> Wiegen Sie die entsprechende Menge an Cytodex-3 Perlen für das Experiment erforderlich. Dieses Protokoll wird für die 10ml RCCS Schiffes angepasst, in dem 0,05 g Perlen benötigt werden. Für eine 50ml RCCS Schiff, entsprechend skalieren. In einem 50 mL autoklavierbar konischen Rohr, Mix 250 mg Cytodex-3 Perlen mit 12ml Dulbecco phosphatgepufferte Lösung (DPBS). Diese Menge reicht für 5 RCCS Schiffe. </li></ol></li><li> Für ausreichende Menge vorhanden ist, in dem konischen Rohr, das Autoklav-Verfahren in Verdunstung führt. Lose Kappe der Röhre und Autoklaven für 10 min bei 110 ° C. </li><li> Nehmen Sie die konische Rohr an der Fertigstellung des Autoklaven-Zyklus und damit die Cytodex-3 Bead-Lösung, um abzukühlen. </li><li> Nach dem konischen Rohr auf Raumtemperatur abgekühlt wurde, verwenden Sie sterile Technik, um das Gesamtvolumen auf 12,5 ml zu bringen mit 1X DPBS. </li><li> Cap und speichern Sie die vorbereiteten Cytodex-3 Kügelchen bei Raumtemperatur. Lassen Sie die vorbereiteten Perlen zu quellen und auf Raumtemperatur abkühlen vor zu bedienen. Die oben genannten Vorbereitung Cytodex-3 Perlen wird für fünf 10ml RCCS Schiffe bieten. Wir haben beobachtet, dass längere Lagerung von Cytodex-3 Kügelchen bei Raumtemperatur wird in verminderter Leistung führen, da das Kollagen nach etwa einem Monat zu destabilisieren wird. Cytodex-3 Perlen liegen in der Größenordnung von 133 bis 215 um. </li></ol> 2. Nährmedienzubereitung <ol><li> Bereiten Sie 1L RCCS optimiert GTSF-2-Medien (in Anlehnung an 22), die von 40% MEM alpha besteht, plus Beilagen und 60% L-15 Leibovitz Medien (in Anlehnung an 22). Zuerst bereiten in einem Gesamtvolumen von MEM alpha ergänzt mit 400 ml: 21,2 mm Natriumbicarbonat 0,06% Pepton 0,7 Fructose 1.4mm Galactose 5.6mm Glucose 1% HEPES 1% L-Glutamin 0,5% ITS 10% FBS </li><li> Zur Vorbereitung einer Stammlösung von ITS, in 5 ml sterile angesäuert H 2 O durch Zugabe von Eisessig (ca. 0,05 ml) vorbereitet auflösen. Swirl zu lösen, mit 45ml sterilem Wasser zu folgen. </li><li> Abwiegen genug L-15 Leibovitz Pulver für 600 ml Medium durch Lösen in Gewebe-culture grade H 2 O. </li><li> Bringen Sie das Gesamtvolumen der Zellkulturmedium auf 1L mit L-15 Leibovitz-Medium. Filter-sterilisiert und bei 4 ° C im Dunkeln. Add 1% Penicillin-Streptomycin individuell auf jedes Aliquot des verwendeten Mediums. </li><li> Viele Medien Formulierungen außer GTSF-2-Medien wurden erfolgreich in die RCCS getestet. Einzelne Laboratorien müssen für sich selbst entscheiden, welches Medium eignet sich optimal für das Experiment durchgeführt wird. </li></ol> 3. Cells und Bead Incubation <ol><li> Propagieren der EVTs um ~ 80% Konfluenz, trypsinize und zählen nach anerkannten Zellkultur Praktiken. </li><li> Suspend 1x10 6 EVTs in 4 ml warmemed Medien. </li><li> Vorsichtig mischen vorbereitet Cytodex-3 Perlen. Mit sterile Techniken, entfernen Sie 2,5 ml der vorbereiteten Beads mit einer breiten Spitze, 10 ml serologische Pipette und Transfer zu einem nicht verwendeten 15 ml konische Röhrchen. Beachten Sie, dass es möglicherweise einen kleinen Verlust von Beads werden, da sie Wert auf die Pipette. </li><li> Lassen Sie die Cytodex-3 Perlen auf dem Boden des Röhrchens zu begleichen. Nach der Sedimentation, verwenden Sie eine Pipette, um die oberste Schicht der DPBS ohne die Cytodex-3 Perlen zu entfernen. </li><li> Mischen Sie die 1x10 6 hergestellt EVTs in Medien mit dem vorbereiteten Cytodex-3 Perlen. </li><li> Inkubieren Sie die Zell-Bead-Mischung bei Raumtemperatur für 30 min. Von Zeit zu Zeit vorsichtig mischen. Inkubieren für weitere 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2. Von Zeit zu Zeit vorsichtig mischen. </li></ol> 4. Das Laden der RWV <ol><li> In einer laminaren Strömung Schrank, entfernen Sie einen 10 mL RCCS aus der Verpackung und legen Sie sie in einem sterilen, 6-well Mikrotiterplatte für Stabilität. Siehe Abbildung 1 für eine markierte Diagramm des RC AbbildungCS. </li><li> Entfernen Sie den großen Stopfen aus dem Hafen. </li><li> Bringen Sie das Gesamtvolumen der Inkubation Zell-Bead-Mischung auf 10 ml mit erwärmten Medien. </li><li> Laden Sie die Zelle / Bead-Mischung in die RCCS durch den großen Hafen. Die RCCS sollte gekippt werden im 45 ° Winkel (großer Hafen up) beim Laden um die Entfernung des möglichen Luftblasen zu unterstützen. Prevent Aufbau von Überdruck durch Befüllen des Behälters langsam und stetig. </li><li> Ersetzen Sie den Stopfen in den großen Hafen. </li><li> Entfernen Sie den Kolben aus dem 3-ml-Spritzen und Ort der leeren Spritzen auf die kleinen Häfen. Add 1-3 ml Medium zu jeder Spritze. Langsam öffnen sich die beiden Ventile. Ersetzen Sie die Spritze Kolben auf die Spritzen sanft. Fügen Sie Medien aus einer Spritze, bis alle Luft aus dem Innenraum entfernt werden. </li><li> Nehmen Sie den RCCS und klopfen Sie leicht die Seite beim Drehen sie vor Ihnen, um Luftblasen zu überprüfen. Wenn es irgendwelche Blasen sind, müssen Sie sie aus der Kammer, wie Luftblasen unter Bildung o störenf Zellaggregate und stellen Scherkräfte. Entfernen Sie Luftblasen durch Drehen des RCCS bis die Blasen unter dem kleinen Hafen sind. Dann vorsichtig nach unten auf die Spritze auf der gegenüberliegenden Seite, um die Luftblasen in den Hafen und aus der Kammer zu erzwingen. </li><li> Schließen einer Seite Port. Drücken Sie vorsichtig auf die andere Spritze Kolben eine kleine Menge von positivem Druck in den Behälter, die Blasen verhindert die Bildung von einzuführen. Close zweite Ventil. </li><li> Laden Sie die RCCS auf den Rotor. Starten Sie die Rotation bei 19rpm in einem 37 ° C CO 2-Inkubator. </li></ol> 5. Ändern der Medien <ol><li> Ändern Sie die Medien jeden zweiten Tag für die ersten drei Tage, dann jeden Tag danach. </li><li> Schalten Sie den Rotor und entfernen Sie die RCCS. Ziehen Sie den Kolben bis zu einigen Sog erzeugen, entfernen Sie die Spritze aus jedem kleinen Hafen und Ort der RCCS auf einem Winkel, so dass die Perlen Gegenteil von dem großen Hafen zu begleichen. </li><li> Nachdem die Perlen alle niedergelassen haben, öffnen Sie eine der kleinen Ventile undermöglichen die Medien fließen aus dem RCCS und in einen Abfallbehälter. Nehmen Sie 2 / 3 der Medien auf diese Weise. Achten Sie darauf, nicht stören die Perlen und nicht verwerfen Aggregate. </li><li> Schließen Sie das kleine Ventil und öffnen Sie den großen Hafen. Add Medien wieder in die RCCS durch den großen Hafen. Ersetzen Sie den Stopfen in den großen Hafen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 4,6 bis 4,9. </li><li> Da die Aggregate an Größe zunehmen, müssen Sie die Drehzahl erhöhen, um sie in der Schwebe zu halten jederzeit, idealerweise in einem kleinen Kreislauf Muster mit optimaler Geschwindigkeit. Generell erhöht die Geschwindigkeit zwischen 0,3 bis 0,7 min nach jeder Fütterung, wenn die Aggregate zusehends beginnen. </li></ol> 6. Sammeln propagierten Cells <ol><li> Entfernen Sie die RCCS aus dem Rotor. Entfernen Sie die Spritze aus jedem kleinen Hafen und Ort der RCCS auf einem Winkel, so dass die Perlen Gegenteil von dem großen Hafen niederlassen kann. </li><li> Nachdem die Perlen alle niedergelassen haben, öffnen Sie eine der kleinen Ventile und lassen Sie die Medien heraus zu fließender RCCS und in einen Abfallbehälter. Nehmen Sie 1 / 3 der Medien auf diese Weise. </li><li> Schließen Sie das kleine Ventil und öffnen Sie den großen Hafen. Vorsichtig schwenken das Schiff, um die Aggregate wieder in Lösung zu zerstreuen. Leere flüssige Mischung in ein steriles 50 ml konischen Röhrchen. Lassen Sie die gesammelten Aggregate in den konischen Rohr, bevor Sie Überstand gründlich waschen Kulturgefäß zur Wiederaufnahme der Aggregate zu maximieren begleichen. Die Aggregate können für nachfolgende Tests sofort verwendet werden, z. B. Durchflusszytometrie, Invasionsassays, Immunfluoreszenz und andere. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für EVT-ähnlichen Zellen (SGHPL-4 Trophoblasten-Zelllinie) in der RCCS auf Cytodex-3 Perlen gewachsen ist in Abbildung 2 dargestellt. Das EVT-like-Zelllinie zeigt Vorsprünge entfernt von den wichtigsten Cluster und verbundenen benachbarten Clustern. Viele der Beads sind vollständig mit Zellen bedeckt propagieren. Einmal aus dem RCCS und pla entferntTed auf einer extrazellulären Matrix, die EVT-like 3-D gewachsenen Zellen aggressiv in und / oder zu migrieren (Abbildung 3). RT-PCR Daten bestätigen die erhöhte Expression von MMPs in 3-D-Aggregate gesehen zu traditionellen Zellkultur Monoschichten (Abbildung 4) entgegen. Interessanterweise sind Gene nicht mit Invasion assoziiert auch in der RCCS hochreguliert (Tabelle 1) und kann bei der Abgrenzung dieser Gebiete als immun Interaktionen mit eindringenden Trophoblasten-Zellen zu unterstützen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Cartoon Darstellung der Rotating Cell Culture System (RCCS). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Phasenkontrast-Aufnahme von einem Vertreter Aggregat nach 5 Tagen Wachstum in einem RCCS. Die Pfeile zeigen die eindringenden Zellen und * bezeichnet das Cytodex-3 Mikroträger Perlen. <imgalt src='"/' files></imgalt> Abbildung 3. RCCS Grown Aggregate wurden in Fibringele eingebettet. Invasion durch die Fibrin-Gel wurde so früh wie (A) 24 Stunden nach der Fibrin Einbettung beobachtet und (B) über 48 Stunden fortgesetzt. Die Pfeile zeigen die eindringenden Zellen und * bezeichnet das Cytodex-3 Mikroträger-Beads (Adaptiert mit Erlaubnis aus Lit.. 7). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Vergleichende Gelatine Zymogramm von Mono-und RCCS propagiert SGHPL-4 EVT-ähnliche Zellen. Pro-und aktiven Formen von MMP-2 und MMP-9 wurden von den RCCS gewachsen Trophoblastzellen (Übernommen mit freundlicher Genehmigung aus Lit.. 7) ausgeschieden. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/3367/3367table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 1"> Tabelle 1. Zusammenfassung der Microarray-Ergebnisse aus SGHPL-4-Zellen in einem RCCS gewachsen (Übernommen mit freundlicher Genehmigung aus Lit.. 7). <ol class="lalpha"><linormierte normalisierend monlayer gen-wert: fache induktion in der wurde wie folgt berechnet.><li> Zeigt an, Gene, die unterhalb der Nachweisgrenze in Monoschichten wurden. </li></linormierte></ol>

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Kultur hier vorgestellte Technik bietet den Ermittlern sehr invasiv EVT-ähnliche Zellen. Es wurde nun erkannt, dass ein Verlust der Differenzierung in Monoschichten durch die Hemmung der zellulären Reaktionen auf chemische und molekulare Signale in drei Dimensionen (apikalen, basalen und lateralen Zelloberflächen) 10,13 auftritt. Diese Technik spiegelt Eigenschaften in utero auf eindringende EVT-Zellen festgestellt. Da das Verfahren ahmt konventionelle Monolayer Zellkultur Zeitkinetik, bietet abe...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Cytodex Mikroträger Perlen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3275 </td><td></td></tr><tr><td> Rotierende Cell Culture System (RCCS) </td><td> Synthecon </td><td> RCCS-D </td><td> Inklusive Rotorgrundkörper, Stromversorgung, 4 Einweg RCCS Einheiten </td></tr><tr><td> RCCS Einweg-Units </td><td> Synthecon </td><td> Kontakt Synthecon </td><td></td></tr><tr><td> 3ml Luer-Lock Spritze </td><td> BD </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 10ml breit Spitze serologischen Pipetten </td><td> BD </td><td> 357504 </td><td></td></tr><tr><td> MEM Alpha </td><td> Invitrogen </td><td> 12561-072 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz L-15-Medium, Pulver </td><td> Invitrogen </td><td> 41300-039 </td><td></td></tr><tr><td> H 2 O, Endotoxin frei </td><td> Fischer </td><td> MT-25 bis 055-CM </td><td></td></tr><tr><td> Natriumbikarbonat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-7795 </td><td></td></tr><tr><td> Pepton </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1420-100 </td><td></td></tr><tr><td> Fructose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F3510-100 </td><td></td></tr><tr><td> Galactose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5388-100 </td><td></td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528-250 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Insulin-Transferrin-Natriumselenit (ITS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1884 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10437 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

rotierende cell culture systems für human cell culture: human trophoblastzellen als modell

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Das Feld der menschlichen Trophoblasten Forschung erleichtert das Verständnis der komplexen Umgebung während Plazentation gegründet. Aufgrund der Natur dieser Studien ist die menschliche In-vivo-Experimente unmöglich. Eine Kombination aus primären Kulturen, Explantation Kulturen und Trophoblasten Zelllinien 1-Unterstützung unser Verständnis der Invasion der Gebärmutterwand 2 und Umbau des Uterus Spiralarterien 3,4 von extravillösen Trophoblastzellen (EVTs), die für die erfolgreiche Etablierung einer Schwangerschaft erforderlich ist. Trotz der Fülle an Wissen aus solchen Modellen entnommen, ist es akzeptiert, dass in vitro Zellkultur-Modellen mit EVT-like-Zelllinien Display zellulären Eigenschaften verändert, wenn ihre in vivo Pendants 5,6 verglichen. Cells in den rotierenden Zellkultursystem (RCCS) kultiviert Display morphologische, phänotypische und funktionelle Eigenschaften von EVT-like-Zelllinien, die mehr genau imitieren Differenzierung in utero EVTs mit einer erhöhten Expression von Genen vermitteln Invasion (zB Matrix-Metalloproteinasen (MMPs)) und Trophoblast Differenzierung 7,8,9. The Saint Georges Hospital Plazenta-Zelllinie-4 (SGHPL-4) (freundlicherweise von Dr. Guy Whitley und Dr. Judith Cartwright gespendet) ist ein EVT-like-Zelllinie, die für die Prüfung in der RCCS verwendet wurde. Das Design des RCCS Kulturgefäß basiert auf dem Prinzip, dass Organe und Gewebe in einer dreidimensionalen (3-D-Umgebung) Funktion. Aufgrund der dynamischen Kulturbedingungen in dem Behälter, einschließlich der Bedingungen der physiologisch relevanten Scher-, Zellen in drei Dimensionen gewachsen bilden Aggregate auf Basis natürlicher zellulärer Affinitäten und differenzieren sich in organotypischen Gewebe-like Baugruppen 10,11,12. Die Wartung einer Flüssigkeit Bahn bietet eine Low-Shear, turbulenzarme Umgebung ähnlich Bedingungen in vivo gefunden. Sedimentation der kultivierten Zellen durch Anpassung der Drehung entgegenGeschwindigkeit des RCCS, um eine konstante freien Fall der Zellen zu gewährleisten. Der Gasaustausch erfolgt durch eine durchlässige hydrophobe Membran auf der Rückseite des Bioreaktors befinden. Wie ihre Eltern Gewebe in vivo sind RCCS-gewachsenen Zellen in der Lage, chemische und molekulare Gradienten in drei Dimensionen (dh an ihrem apikalen, basalen und seitlichen Flächen) zu reagieren, weil sie auf der Oberfläche des porösen Mikroträger Perlen gezüchtet werden. Wenn als zweidimensionale Monolagen auf versiegelten Oberflächen wie Kunststoff gewachsen sind die Zellen dieser wichtigen Kommunikationsmittel, über die basale Fläche entzogen. Folglich ist die räumliche Beschränkungen durch die Umwelt stark beeinflussen, wie Zellen Sinn und decodieren Signale aus dem umgebenden Mikroumgebung, was darauf schließen lässt eine wichtige Rolle für die 3-D Milieu 13. Wir haben die RCCS verwendet werden, um biologisch sinnvolle 3-D Modelle der verschiedenen menschlichen epithelialen Geweben 7,14,15,16 Ingenieur. Tatsächlich haben viele frühere Berichte DMonstrated, dass Zellen in der RCCS kultiviert werden können physiologisch relevanten Phänotypen, die nicht mit anderen Modellen 10,17-21 möglich zu übernehmen. Zusammenfassend stellt Kultur in der RCCS eine einfache, reproduzierbare, High-Throughput-Plattform, die eine große Anzahl von differenzierten Zellen, die zugänglich für eine Vielzahl von experimentellen Manipulationen bietet. In dem folgenden Protokoll, mit EVTs als ein Beispiel, wir eine klare Beschreibung der erforderlichen Schritte, um dreidimensional Kultur adhärenter Zellen in der RCCS.

Traditional, zweidimensionalen Zellkultur-Techniken oft in veränderten Eigenschaften in Bezug auf die Differenzierung Marker, Zytokine und Wachstumsfaktoren führen. Dreidimensionale Zellkulturen in den rotierenden Zellkultursystem (RCCS) wiederherstellt Expression vieler dieser Faktoren, wie hier mit einem extravillösen Trophoblasten-Zelllinie gezeigt.

Rotierende Cell Culture Systems für Human Cell Culture: Human Trophoblastzellen als Modell

Das Forschungsgebiet der humanen Trophoblasten trägt dazu bei, die komplexe Umgebung zu verstehen, die während der Plazentation entsteht. Aufgrund der Beschaffenheit dieser ...

Dieses Verfahren nutzt ein dreidimensionales Zellkultursystem, um die in-vivo-Zellkinetik nachzuahmen. Beginnen Sie mit der Inkubation der Zellen mit Kollagen-ENC-beschichteten Kügelchen. Anschließend werden die Zellen und Kügelchen in ein rotierendes Zellkultursystem gegeben und dreidimensionale Zellaggregate in einer Umgebung mit geringer Scherbelastung und geringer Turbulenz vermehrt.Schließlich die Zellen für die Verwendung in nachgeschalteten Anwendungen im Vergleich zur Genexpression und zellulären Differenzierung von Zellen, die in einer typischen Monoschicht kultiviert wurden, gewinnen. Die resultierenden 3D-Kulturen zeigen Zellkinetik und Verhalten, die jenen im In-vivo-Zustand eng ähneln.Wir haben den RCCS verwendet, um biologisch relevante 3D-Modelle verschiedener menschlicher epithelialer Gewebe zu entwickeln. Dr. Jessica Warner, ehemalige Doktorandin in der Arbeitsgruppe meines Kooperationspartners Dr. Sydney Morris, wird nun dieses Verfahren mit EVT-Zellen demonstrieren. In einem 50-Milliliter-Kegelrohr 250 Milligramm Mikroträger der Beads Cyto Dex Three in 12 Milliliter DPBS autoklavieren. Die vorbereiteten Beads dürfen aufquellen und auf Raumtemperatur abkühlen.Dann unter sterilen Bedingungen das Gesamtvolumen auf 12,5 Milliliter auffüllen. Mit DPBS eine 80 % konfluente Kultur von extrafetalen Trophoblastzellen gewinnen. Die vorbereiteten Cyto-Dex-3-Kügelchen vorsichtig durch Trypsin-Digestion mischen und mit einer weiten Spitze 2,5 Milliliter mit einer 10-Milliliter-Serologiepipette in ein 15-Milliliter-Konischgefäß überführen.Nachdem sich die Cyto Dex Drei-Kügelchen am Boden des Reagenzglases abgesetzt haben, pipettieren Sie die obere Schicht des DPBS ab, ohne die Cyto Dex Drei-Kügelchen zu stören. Mischen Sie die EVT-Zellen mit den Cyto Dex Drei-Kügelchen.Ansatz bei Raumtemperatur 30 Minuten unter periodischem Mischen inkubieren, gefolgt von 30 Minuten im Zellkultur-Inkubator mit gelegentlichem Mischen. Eine 10-Milliliter-RCCS in eine sterile sechsgängige Kulturplatte stellen und den großen Stopfen entfernen. Anschließend erwärmtes GTSF-two-Medium zugeben, um das Gesamtvolumen der Zellperlenmischung auf 10 Milliliter aufzufüllen, und über die große Öffnung in die RCCS einführen.Setzen Sie den großen Stopfen wieder ein und schließen Sie die kleinen Öffnungen. Danach platzieren Sie drei Milliliter-Spritzen an den beiden kleinen Anschlüssen und füllen Sie jedes Spritzen mit Medium.Öffnen Sie langsam die beiden Ventile und ersetzen Sie die Spritzenkolben. Fügen Sie vorsichtig Medium aus einer Spritze hinzu, bis alle Luftblasen aus der Innenkammer verdrängt sind. Nehmen Sie den RCCS auf und klopfen Sie vorsichtig an die Seite, während Sie ihn drehen, um auf Blasen zu prüfen.Entfernen Sie verbleibende Blasen, indem Sie den RCCS drehen, bis sich die Blasen unter der kleinen Öffnung befinden. Drücken Sie dann vorsichtig auf den Spritzenkolben auf der gegenüberliegenden Seite, um die Blasen in die Öffnung und aus der Kammer herauszudrücken. Schließen Sie vorsichtig eine Seitenöffnung und drücken Sie weiterhin leicht auf den anderen Spritzenkolben, um einen geringen positiven Druck im Gefäß aufzubauen, und schließen Sie gleichzeitig das zweite Ventil, während Druck aufrechterhalten wird.Schließlich die RCCS auf den Rotor aufsetzen. Die Rotation mit 19 U/min im Zellkulturinkubator beginnen, um optimale Kulturbedingungen zu gewährleisten. Das Medium alle zwei Tage während der ersten drei Tage und danach täglich erneuern.Schalten Sie zuerst den Rotor aus und entfernen Sie den RCCS. Ziehen Sie die Kolben nach oben, um einen leichten Unterdruck zu erzeugen. Entfernen Sie die Spritzen von jedem kleinen Anschluss, stellen Sie den RCCS schräg und lassen Sie die Kügelchen auf der dem großen Anschluss gegenüberliegenden Seite absetzen.Öffnen Sie nun eines der kleinen Ventile, um zwei Drittel des Kulturmediums aus dem RCCS in einen Abfallbehälter abzulassen, ohne die Perlen zu stören. Schließen Sie das kleine Ventil, öffnen Sie dann die große Öffnung. Geben Sie frisches Kulturmedium in den RCCS, setzen Sie den Stopfen wieder auf, entfernen Sie alle Luftblasen, wie zuvor gezeigt, und stellen Sie die Kultur auf den Rotator im Inkubator.Sobald die Aggregate zu wachsen beginnen, sichtbar die Rotationsgeschwindigkeit erhöhen, um sicherzustellen, dass die Zellen in Suspension bleiben. Um die Zellen zu gewinnen, lösen Sie den RCCS vom Rotor.Entsorgen Sie die Spritzen von jedem kleinen Anschluss und stellen Sie den RCCS schräg, um die Kügelchen auf die dem großen Anschluss gegenüberliegende Seite zu lenken. Nachdem sich alle Kügelchen abgesetzt haben, öffnen Sie eines der kleinen Ventile und lassen ein Drittel des Mediums in einen Abfallbehälter ab. Schließen Sie das kleine Ventil und öffnen Sie den großen Anschluss.Swirlen Sie das Gefäß vorsichtig, um die Aggregate wieder in Lösung zu verteilen, und überführen Sie die Zellen in ein steriles kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Nachdem Sie die gesammelten Aggregate im kegelförmigen Röhrchen absinken lassen, verwenden Sie den Überstand, um das Kulturgefäß erneut gründlich zu spülen, um die Rückgewinnung der Aggregate zu maximieren. Aliquotieren Sie die Aggregate mithilfe einer Pipettenspitze mit großem Durchmesser unmittelbar für nachgeschaltete funktionelle Assays. Die S-G-H-P-L-Vier-Trophoblasten-Zelllinie ist ein Beispiel für extra villöse Trophoblasten-ähnliche Zellen. Bei einem typischen Aggregat, das in einem RCCS auf Cyto X drei gezüchtet wird, sind viele Perlen vollständig mit proliferierenden Zellen bedeckt. Beachten Sie die Fortsätze, die sich von dem Hauptcluster weg erstrecken und mit benachbarten Clustern verbinden.Nach der Entnahme aus dem RCCS und der Ausplattierung auf einer extrazellulären Matrix dringen die wie 3D gezüchteten EVT-ähnlichen Zellen aggressiv ein und/oder migrieren. Tatsächlich bestätigen die R-T-P-C-R-Daten die erhöhte Expression von MMPs, die in 3D-Aggregaten im Vergleich zu herkömmlichen Zellkultur-Monolayern beobachtet wird. Interessanterweise werden im RCCS auch Gene, die nicht mit Invasion assoziiert sind, hochreguliert.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie genau wissen, wie Sie den RCCS mit Ihrer Zelllinie, primären Zellen oder sogar Stammzellen verwenden können, um dreidimensionale Zellkulturen zu erzeugen, die die Zellkinetik in vivo genauer nachahmen.

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Biotechnik

In diesem Video zeigen wir die Isolierung der Maus Blastozysten und die Ableitung der Trophoblast-Stammzellen aus Blastozysten. Wir beschreiben auch Bedingungen für die Wartung der Stammzell-Eigenschaft sowie die Induktion der Differenzierung in Kultur.

Ableitung der Maus Trophoblast Stammzellen aus Blastozysten

In diesem Protokoll beschreiben wir die Zerlegung der Plazenten von der Maus auf die Schwangerschaft d10.5, durch Isolation von Trophoblastzellen mit einem Percoll-Gradienten folgen. Wir demonstrieren dann Verwendung der isolierten Zellen in einem Matrigel Invasionsassay.

Isolation of Primary Maus Trophoblastzellen und Trophoblastinvasion Assay

Dieses Manuskript präsentiert ein einzigartiges in vitro Modell von immungereinigten humanen villösen Zytotrophoblastzellen, die unter Hypoxie/Reoxygenierung kultiviert wurden. Dieses Modell ist geeignet, um die schützende Wirkung vielversprechender Behandlungen wie Melatonin auf Schwangerschaftskomplikationen zu untersuchen, die mit erhöhtem oxidativem Stress und veränderter Plazentafunktion verbunden sind.

Menschliche Primär Trophoblast Zellkulturmodell die schützende Wirkung von Melatonin gegen Hypoxie / Reoxygenierung induzierte Störung zu studieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in voll funktionsfähige und stabile Trophoblasten-Stammzellen durch zehntägige Überexpression von Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2.

Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in Trophoblast Stammzellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur effizienten Erzeugung menschlicher trophoblastischer Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung des knochenmorphogenen Proteins 4 und Inhibitoren der Activin/Nodal-Signalwege. Diese Methode eignet sich für die effiziente Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen und kann große Mengen an Zellen für die genetische Manipulation erzeugen.

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

Hier ist ein Protokoll für die Probenahme der menschlichen Plazenta Zotten Gewebe gefolgt von Isolation der Cytotrophoblasts für die primäre Zellkultur. Behandlung von Trophoblasten mit TNF rekapituliert Entzündung in der übergewichtigen intrauterine Umwelt und ermöglicht die Entdeckung von molekularen Zielstrukturen, geregelt durch eine Entzündung in der Plazenta mit mütterliche Korpulenz.

Eine primäre menschlichen Trophoblast-Modell, die Wirkung der Entzündung mit mütterlichen Fettleibigkeit auf Verordnung der Autophagie in der Plazenta zu studieren

Hier präsentieren wir eine hochverfügbare Protokoll für die Bewertung der Zellbewegung in menschlichen Trophoblast Zellen mit drei in-vitro-Tests: der Scratch-Test, Transwell Invasion Assay und der Zelle Verbreitung Assay.

In-vitro-Tests zur Bewertung der Migration, Invasion und Proliferation von verewigt menschlichen Ersttrimester-Trophoblast Zelllinien

Hier beschreiben wir eine Methode zur Erwärmung verglaster menschlicher Blastozysten, die sie durch die Implantationsphase in vitro kultivieren, sie in einzelne Zellen verdauen und frühe Trophoblastenzellen für weitere Untersuchungen sammeln.

Einzelzellsammlung von Trophoblastenzellen im Peri-Implantationsstadium menschliche Embryonen

Organoide revolutionieren die personalisierte Gewebemodellierung für die Organentwicklung, Wirkstoffforschung und Krankheitsforschung. Die Organoid-Technik schreitet voran und führt zur Herstellung komplizierter synthetischer Gewebe. Ziel ist es, Morphogenese, Assembloid-Technologie und Biomatrizen zu integrieren, um das Tissue Engineering voranzutreiben. Dieses Protokoll hilft bei der Modellierung der Leberorganogenese und der Festlegung von Richtlinien für den Aufbau synthetischer Gewebe.

In-vitro-Kultivierungstechniken zur Modellierung der Leberorganogenese, zum Aufbau von Assembloiden und zum Design synthetischer Gewebe unter Verwendung menschlicher Zelllinien

Das Protokoll zeigt ein neuartiges experimentelles In-vitro-Modell , das die Biologie von zwei Arten von adhärenten Zelllinien mit einem dreidimensionalen (3D)-gedruckten Gerüst rekapitulieren kann. Der Aufbau dieses Modells und die Arbeitsabläufe, von der Zellpräparation über die Zellkultur bis hin zur Analyse und Auswertung, werden beschrieben.

Co-Kulturmodell mit zwei Arten von adhärenten Zelllinien

Dieses Protokoll ermöglicht die Reinigung, Charakterisierung und Kultivierung primärer HLA-G+-extravillöser Trophoblasten (EVT) aus der Decidua basalis und der chorionischen Membran menschlicher Term-Plazentas. Primäre EVT-Kulturen erhalten die Lebensfähigkeit 96 Stunden lang aufrecht, was eine Kokultivierung mit probengematchten mütterlichen Immunzellen sowie eine anschließende zytometrische und molekulare Analyse ihrer Interaktionen ermöglicht.

Reinigung von HLA-G+ -Extravillen-Trophoblasten aus menschlichen Term-Plazentageweben für Phänotypisierung und funktionelle Analyse

Erfahren Sie die dreidimensionale Zellkultur mit rotierenden Systemen für humane Trophoblastzellen. Diese Methode ermöglicht realistischere in-vivo-Bedingungen und verbesserte Differenzierungsmarker im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Kulturen.

Rotierende Cell Culture Systems für Human Cell Culture: Human Trophoblastzellen als Modell

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