Stretching kurze DNA-Sequenzen mit Constant Force Axial Optische Pinzetten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, kurze DNA-Moleküle mit einer Länge von 100 Nanometern mithilfe konstanter, gut kalibrierter optischer Kräfte zu manipulieren. Dies wird erreicht, indem die DNA an einem Ende an eine Deckglasoberfläche und am anderen Ende an eine Polystyrol-Mikrokugel befestigt wird. Anschließend werden die optischen Fallen justiert und kalibriert.

Dann wird die DNA durch eine Kombination aus Gradientenkräften und Streukräften, die auf die Mikrokugel wirken, von der Oberfläche weggestreckt. Schließlich wird die DNA verlängert, indem die Kugel im linearen Bereich des Potentials eingefangen wird. Das Protokoll wurde verwendet, um die mechanischen Eigenschaften von DNA und die Kinetik der DNA-Protein-Bindung zu untersuchen, und hat darüber hinaus dazu beigetragen, die Bedeutung von Randbedingungen für die Elastizität kurzer DNA-Konstrukte aufzuklären.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Ausrichtung und Kalibrierung der optischen Pinzetten mit konstanter Kraft schwierig und komplex ist. Die optischen Pinzetten umfassen einen Strahl eines 1064 Nanometer-Lasers, der in zwei orthogonal polarisierte Strahlen aufgeteilt wird. Einer wird zur Manipulation des Biomoleküls verwendet, der andere dient Kalibrierungszwecken.

Die Intensität des Manipulationsstrahls wird durch einen akusto-optischen Ablenker oder einen OD gesteuert. Anschließend werden die Strahlen mit einem weiteren polarisierenden Strahlteiler kombiniert. Die Strahlen werden durch ein planapochromatisches 60×-1,4-Ölimmersions-Objektiv eng auf die Probezelle fokussiert. Dieser Tweezer-Aufbau ist mit einem selbstgebauten Hellfeldmikroskop kombiniert, das Beleuchtung von einer Halogenlampe bereitstellt, die durch einen Kondensor auf die Probenkammer fokussiert wird.

Das Hellfeldbild wird durch einen dichroitischen Spiegel vom Laserlicht getrennt und anschließend auf zwei CCD-Kameras abgebildet. Eine CCD-Kamera dient als primäre Methode zur Datenerfassung und wird softwaregesteuert ausgelöst, um präzise Abtastraten zu erzielen. Die andere CCD-Kamera wird verwendet, um ein einzelnes festgeklebtes Referenzmikrosphäre abzubilden, deren Position als Rückkopplungsregelung dient, um Drift im Mikroskop auszugleichen.

Die Probe wird grob über einen XY-Tisch in Bezug auf das Objektiv positioniert und anschließend präzise über einen eingebetteten dreidimensionalen Piso-Tisch ausgerichtet. Das vorwärts gestreute und transmittierte Laserlicht wird vom Hellfeldkondensor gesammelt und auf einen Photodetektor fokussiert, um die Größe der Kügelchen zu kalibrieren, eine Probenkammer mit einer dispergierten Lösung von 800 Nanometer durchmessenden Polystyrolmikrokügelchen, die in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt sind, zu beladen. 10 bis 15 Minuten ruhen lassen und anschließend vorsichtig mit Puffer durchspülen.

Um überschüssige Mikrokügelchen zu entfernen, lokalisieren Sie ein zufällig an dem Deckglas haftendes Mikrokügelchen und justieren Sie die Höhe der Probenkammer, bis sich das Mikrokügelchen etwa einen Mikrometer unterhalb der Fokusebene befindet. Um ein defokussiertes Bild zur Bestimmung der scheinbaren Bildgröße mittels LabVIEW zu erzeugen, finden Sie zunächst mithilfe der geometrischen Mustervergleichsfunktion den Mittelpunkt des Mikrokügelchens. Erzeugen Sie anschließend ein radiales Intensitätsprofil des Mikrokügelchens durch Mittelung über 360 Grad.

Passt an das Zentrum jedes Querschnitts das radiale Profil an, das einem weißen Ring in jedem der Hellfeldbilder entspricht, mithilfe einer quadratischen Funktion an. Um ein Helligkeitsmaximum zu finden, kann der Abstand zwischen diesem Maximum und dem Zentrum als Maß für die scheinbare Größe der Kugel unter Verwendung des kalibrierten Piso-Stages verwendet werden, um die axiale Position der Mikrokugel schrittweise zu erhöhen und mit der CCD-Kamera bei jeder axialen Position ein Bild aufzunehmen. Wiederholen Sie die Bildanalyse für jedes aufeinanderfolgende Bild, um die scheinbare Größe der Mikrokugel mit ihrer axialen Position zu korrelieren.

Die axiale Auflösung, die mit dieser Methode erzielt wird, beträgt etwa 1,4 Nanometer, um das optische Potential des Manipulationsstrahls abzubilden. Beginnen Sie damit, den Manipulationsstrahl und den Kalibrierstrahl zu kollinearisieren, wobei der Manipulationsstrahl ausgeschaltet ist. Halten Sie eine freie Mikrokugel im deutlich steiferen Fangstrahl des Kalibrierstrahls fest. Schalten Sie nun den Manipulationsstrahl ein.

Da der Strahl viel schwächer ist als der Kalibrierstrahl, wird die axiale Position der Mikrokugel leicht gestört. Die sich ergebende Änderung der axialen Position kann aus den defokussierten Hellfeldaufnahmen gemessen werden, wie bereits beschrieben. Verschieben Sie den axialen Fokus und tragen Sie erneut die Verschiebung Delta X gegen die axiale Position des Fokus des Kalibrierstrahls auf.

Die axiale Position, die der größten Auslenkung der Mikrokugel entspricht, bestimmt das Zentrum des linearen Bereichs der optischen Falle. Um eine DNA-Probe zu dehnen, montieren Sie die Kammer mit an der Oberfläche verankerten DNA-Molekülen und platzieren Sie unter Beobachtung des Hellfeldbildes den Fokus des Manipulationsstrahls durch Justieren des Teleskops leicht oberhalb der ungedehnten Mikrokugeln. Anschließend justieren Sie die Position des Stages, bis eine der Mikrokugeln eingefangen ist. Positionieren Sie die Mikrokugel grob in der Mitte der XY-Ebene der optischen Falle, erzeugen Sie eine Serie von Rechteckwellen in LabView und senden Sie diese an die AOD, um den Laserstrahl wiederholt ein- und auszuschalten.

Beobachten Sie die Mikrokugel, während die Falle wiederholt ein- und ausgeschaltet wird. Achten Sie darauf, ob der Laser eine bevorzugte Bewegungsrichtung der Mikrokugel verursacht, während Sie die Position der Mikrokugel iterativ in X- und Y-Richtung justieren. Durch die Steuerung des PISO-Stage sollte die zufällige Bewegung der Mikrokugel in der X-Y-Ebene isotrop werden, obwohl sie merklich eingeschränkt ist, wenn der Laser eingeschaltet ist.

Als Nächstes richten Sie die Perle in Z-Richtung aus. Pulsieren Sie erneut den Laserstrahl ein- und ausgeschaltet, während Sie diesmal gleichzeitig die axiale Verschiebung der Mikrokugeln in Echtzeit messen.

Zentrieren Sie den Tisch innerhalb des linearen Bereichs, also dem Punkt, an dem die Z-Verschiebung am größten ist, um die DNA-Rampe zu dehnen, indem Sie ein Spannungssignal von null Volt bis 0,5 Volt in Schritten von 0,025 Volt an die A OD senden. Nehmen Sie 400 Bilder mit 100 Bildern pro Sekunde auf und mitteln Sie diese, um die axiale Verschiebung zu erhalten. Zeichnen Sie abschließend die Kraft-Dehnungs-Kurven auf und passen Sie sie an ein modifiziertes Wurm-ähnliches-Kette-Modell an.

Hier gezeigte Kraft-Dehnungs-Kurven für 2D-NA-Sequenzen mit 298 Basenpaaren und 247 Basenpaaren für kurze DNA-Abschnitte. Das herkömmliche Wurm-artige-Kette-Modell (WLC-Modell) erklärt den Kraft-Dehnungs-Zusammenhang nicht vollständig, da auf diesen Längenskalen endliche Größeneffekte und die Dehnung bei Nullkraft aufgrund von Randbedingungen berücksichtigt werden müssen. Die Kraft-Dehnungs-Messungen müssen daher mit einem modifizierten WLC-Modell angepasst werden, das eine effektive Biegestarrheit und eine Dehnung bei Nullkraft als Anpassungsparameter enthält, wie in den ergänzenden Materialien näher beschrieben.

Für große Konturlängen von D-S-D-N-A ist die effektive Persistenzlänge einfach die nominelle Persistenzlänge von etwa 50 Nanometern, und die Extensionslänge bei Nullkraft kann bei den modifizierten WLC-Anpassungen vernachlässigt werden. Die effektiven Persistenzlängen betragen 35 Nanometer für die 1.298 Basenpaare lange DNA und 25 Nanometer für die 247 Basenpaare lange DNA nach ihrer Entwicklung. Diese Methode ebnete den Weg für eine Vielzahl nano-mechanischer Messungen an DNA und DNA-Protein-Komplexen, einschließlich einer Untersuchung der Kinetik der Bildung und Auflösung regulatorischer proteinvermittelter DNA-Schleifen.