Effiziente rekombinanten Parvovirus Produktion mit Hilfe von Adenovirus-abgeleiteten Systemen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, rekombinante Parvoviren, oder rec PVS, in hohen Titer zu erzeugen, wobei gleichzeitig ihre Qualität erhalten bleibt und die Produktionszeiten sowie -kosten reduziert werden. Dies wird erreicht, indem zunächst ein anfänglicher rec-PV-Virusstamm durch Transfektion von HEC 2 93 T-Zellen mit rec-PV-Plasmiden zusammen mit einem aus Adenovirus Typ 5 stammenden Vektor hergestellt wird. Da die Einführung ad-Genom-Elemente in die HEC 2 9 3 T-Zellen die Produktion von rec PVS um mehr als das Zehnfache erhöht.

Im Vergleich zu bestehenden Protokollen wurde ein neuartiger AD-VP-Hilfsvektor erzeugt, der die genomischen adenoviralen Elemente enthält, die notwendig sind, um die Produktion rekombinanter Parvoviren zu verbessern, sowie die Parvovirus-VP-Gen-Einheit. Der nächste Schritt besteht darin, diesen neuartigen AD-VP-Hilfsvektor gemäß Standardprotokollen herzustellen und zu reinigen.

Der letzte Schritt dieses Verfahrens besteht darin, die rekombinanten PVS durch gleichzeitige Infektion von NB324K-Zellen mit dem rekombinanten PV und ADP-Viren zu amplifizieren. Die Effizienz der Produktion rekombinanter PVs wird durch diese Strategie um mehr als das 100-Fache gesteigert, wodurch sie ausschließlich angewendet werden kann, sobald eine geringe Menge rekombinanter PVS durch Transfektion erzeugt wurde. Abschließend erfolgt die Titration der hergestellten Viruspräparationen entweder mittels quantitativer Echtzeit-PCR oder eines Transduktionsassays.

Zusätzlich wird ein Plaque-Assay durchgeführt, um zu bestätigen, dass während des Produktionsprozesses keine unerwünschten replikationskompetenten Viren entstanden sind. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der klassischen Herstellung rekombinanter Parvoviren über Plasmide in aktiven und behandelten Zellen besteht darin, dass nach der Erzeugung der anfänglichen Vorräte rekombinanter Parvoviren mit Adenovirus-VP-Helfervirus die Produktion vollständig auf Virusinfektionen beruht. Dies ermöglicht die Verwendung von NBK-Zellen, die gute Produzenten von Parvoviren sind, jedoch nicht transfectierbar sind.

Auf diese Weise ist es möglich, die rekombinanten per Viren zu amplifizieren und die infektiöse Virusausbeute um mehr als das 100-Fache zu steigern, wodurch sich die Produktionszeit und die Kosten verringern. Den Ablauf demonstriert Barbara Loic, Leiterin der Virusproduktionsabteilung, die gemeinsam mit uns dieses neuartige Protokoll entwickelt hat. Wir hoffen, dass Ihnen dieses Video gefällt, und wünschen Ihnen viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

Die Herstellung von rekombinantem Parvovirus oder rek PV mittels Transfektion ist erforderlich, um die minimale Menge an rek PVS zu erzeugen, die als Inokulum für die anschließende Produktion von rek PVS durch Infektion dient. Für die Herstellung von rek PVS am Tag vor der Transfektionsansaat ist ein Labor der Sicherheitsstufe zwei erforderlich. 2 Millionen HEC 2 9 3 T-Zellen in einer 10 cm-Platte werden verwendet, um eine 50%ige zelluläre Konfluenz zu erreichen.

Am Tag der Transfektion die Zellen in 10 Milliliter DMEM kultivieren, ergänzt mit 10 % FBS, L-Glutamin, Penicillin und Streptomycin, und über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid und 92 % Luftfeuchtigkeit inkubieren. Am Tag der Transfektion eine Virusproduktionsmischung in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen vorbereiten. Die folgenden Reagenzien im molaren Verhältnis von eins zu zwei zu eins hinzufügen: drei Mikrogramm des rec-PV-Vektors, der das gewünschte Transgen enthält.

Sechs Mikrogramm des Vektors P-C-M-V-V-P, der die Parvovirus-Kapsid-Gen-Einheit trägt, und acht Mikrogramm des aus Adenovirus stammenden Helfer-Plasmids. Pxx sechs verdünnen Sie die Plasmidmischung mit serumfreiem Medium auf insgesamt 850 Mikroliter, um eine Endkonzentration von 20 Nanogramm pro Mikroliter zu erreichen. Als Nächstes geben Sie 42,5 Mikroliter FU-Gene-HD-Transfektionsreagenz im Verhältnis 2,5 zu eins (FU-Gene-Reagenz zu DNA) hinzu.

Vorsicht: Lassen Sie das Reagenz des FU-Gens nicht die Wand des Reaktionsrohrs berühren; wirbeln Sie es sanft fünf bis zehn Sekunden lang. Inkubieren Sie danach das Transfektionsgemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie die Transfektionslösung tropfenweise zu den Zellen hinzu. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Lösung gleichmäßig zu verteilen.

Die Platte 72 Stunden bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid und 92 % Luftfeuchtigkeit inkubieren. In dieser Zeit bilden sich aus den Parvovirus-Plasmiden Nachkommen-Parvoviruspartikel, die zur Virenisolation genutzt werden. Zunächst die Zellen zusammen mit ihrem Medium abschaben, anschließend die Suspension absaugen und von der Platte in ein 15-Milliliter-Kunststoffröhrchen überführen.

Zentrifugieren Sie das Gefäß bei 250 G für fünf Minuten. Entfernen Sie bei Raumtemperatur 95 % des Überstands, wobei etwa 0,5 Milliliter zurückbleiben. Vortexen Sie das Gefäß vorsichtig, um das Pellet in dem verbleibenden Überstand erneut aufzuschwemmen, und überführen Sie es in ein 1,5-Milliliter-Einweggefäß.

Gefrieren Sie die Suspension in flüssigem Stickstoff und tauen Sie sie anschließend in warmem Wasser bei 37 Grad Celsius auf. Vortexen Sie das Gefäß kräftig für 15 Sekunden. Wiederholen Sie den Gefrier-Tau-Zyklus noch zweimal.

Zentrifugieren Sie das Gefäß bei 16.000 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und sammeln Sie den Überstand in einem frischen Gefäß. Der Überstand enthält zu diesem Zeitpunkt den rohen Virus-Extrakt, der als Inokulum zur Herstellung rekombinanter PVS durch Infektion verwendet werden kann. Leistungssteigerung des Virus.

Replikationen hängen von zellulären Faktoren ab, die in proliferierenden Zellen exprimiert werden. Daher ist es wichtig, dass die für die Herstellung des rekombinanten Pflanzenvirus verwendeten Zellen in einem optimalen Zustand sind und in der richtigen Dichte ausgesät werden, wie in diesem Protokoll gezeigt. Am Tag vor der Infektion 10 Millionen MB drei 20 4K-Zellen in einem T 1 75-Fläschchen aussäen, um am folgenden Tag eine Zellkonfluenz von 60 bis 80 % zu erreichen.

Bereiten Sie einen zweiten Kolben mit der gleichen Zellanzahl als Kontrolle vor. Jeder T 1 75-Kolben sollte morgens am Tag der Infektion ein Endvolumen von 20 Milliliter MEM enthalten, ergänzt mit 5% FBS, L-Glutamin, Penicillin und Streptomycin. Bereiten Sie eine Virusmischung in einem zweimilliliter-Plastikröhrchen vor.

Fügen Sie diese Reagenzien hinzu. Fügen Sie VP-Hilfsstoff hinzu. Fügen Sie eine Multiplizität der Infektion von 10 rec PVS bei einem MOI von 0,5 und MEM auf 1,5 Milliliter hinzu.

Tragen Sie die gesamte Virusmischung auf einen der T 1 75-Flaschen auf. Inkubieren Sie die Flasche zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 92 % Luftfeuchtigkeit und 5 % Kohlendioxid, wobei alle 15 Minuten vorsichtig geschüttelt wird. Inkubieren Sie anschließend weitere 20 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius, 92 % Luftfeuchtigkeit und 5 % Kohlendioxid.

Nach 20 bis 24 Stunden ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches Medium und inkubieren Sie den Kolben unter denselben Bedingungen weitere 48 Stunden als Hinweis auf eine effiziente virale Produktion. Im Kolben mit virusinfizierten Zellen sollten deutliche Anzeichen einer Zytotoxizität beobachtet werden. Beginnend 36 bis 48 Stunden nach der Infektion nach 48 Stunden saugen Sie das überstehende Medium ab und überführen es in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1,5 mL PBS. Versetzen Sie die Zellen mit Trypsin für drei bis fünf Minuten, und geben Sie dann die Zellsuspension zum entfernten Medium. Zentrifugieren Sie die Zellen und das Überstand bei 5.000 ×g für fünf Minuten bei Raumtemperatur, verwerfen Sie den Überstand und geben Sie 1 mL TE-Puffer zum Zellenpellet hinzu. Vortexen Sie das Gefäß vorsichtig, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen. Anschließend gefrieren Sie die Zellsuspension in einem flüssigen Stickstoffbad ein und tauen Sie im warmen Wasser bei 37 Grad Celsius auf.

Vortexen Sie das Reagenzglas kräftig 15 Sekunden lang. Wiederholen Sie den Gefrier-Tau-Zyklus dreimal. Behandeln Sie die Zellsuspension anschließend 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit Ben-Nase-Nuklease, um genomische Zell-DNA und nicht verpackte virale DNA abzubauen.

Nach 30 Minuten das Gefäß bei 5.000 G während 20 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Abschließend den Überstand in ein frisches Gefäß sammeln. Der Überstand enthält an dieser Stelle einen rohen Virusextrakt.

Typische Ausbeuten an rekombinantem PV-GFP, das nach diesem Protokoll hergestellt wurde, sollten im Bereich von ein- bis zehnmal 10 hoch 8 infektiösen Virus-Einheiten liegen. Ein Beispiel für die Stimulierung der Produktion von rekombinantem PV durch ein auf Adenovirus basierendes Plasmid ist hier dargestellt. Rohe Virextrakte enthalten PHH eins GFP aufrechtes PV, das das GFP-Gen trägt, mit oder ohne.

Das auf Adenovirus basierende PXX-Plasmid wurde auf NBK-Indikatorzellen angewendet, wie in diesen Mikrografien zu sehen ist. In Gegenwart von PXX sechs befinden sich mehr GFP-positive Zellen. Bei Durchführung von GFP-Transduktionsassays wurde ein deutlicher Anstieg der rekombinanten PV-Produktion in Gegenwart von Pxx sechs erzielt. Die Produktion stieg von 0,3 GFP-Transduktionseinheiten oder TU pro Zelle, die mit herkömmlichen Protokollen erhalten wurden, auf etwa fünf TU pro Zelle, die mit diesem Protokoll erzielt wurden.

Die Ergebnisse aus dem GFP-Transduktionsassay zeigen, dass die in PXX6 enthaltenen Adenovirus-Gene E2a, E4 und VA-RNA die Produktion von Parvoviren verstärken können. Diese nächste Abbildung zeigt ein repräsentatives Beispiel für die Herstellung rekombinanter Parvoviren mittels Infektion. NB324K-Zellen wurden mit gereinigtem ADP-Hilfsvirus infiziert und anschließend mit einem von zwei rekombinanten Parvoviren überlagert infiziert.

Rohe Zellextrakte wurden verwendet, um die Virustiter mittels eines Transduktionsassays zu bestimmen, der zeigte, dass der AD-VP-Helfer die Produktion rekombinanter PV um mehr als 70 T pro Zelle weiter steigerte. Schließlich wurden virale Partien, die in Gegenwart oder Abwesenheit von ADP hergestellt wurden, hinsichtlich ihres Gehalts an replikationskompetenten viralen Partikeln durch einen Plaque-Assay an MB-3204K-Indikatorzellen analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass der ADP-Helfer die Produktion rekombinanter PV erhöht, ohne die Häufigkeit unerwünschter replikationskompetenter viraler Partikel nach der Entwicklung zu steigern.

Mithilfe dieser Technik können Wissenschaftler im Bereich der Krebs- und Gentherapie die Produktion rekombinanter Viren in größerem Maßstab erhöhen. Mit Bioreaktoren können Varianten in den Mengen erzeugt werden, die in einem klinischen Umfeld benötigt werden.