Name: Effiziente rekombinanten Parvovirus Produktion mit Hilfe von Adenovirus-abgeleiteten Systemen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Produktion rekombinanter Parvoviren mit einem neuartigen Adenovirus-5-Hilfsvektor. Diese Methode steigert die Virusausbreitung um mehr als das Zehnfache und reduziert Produktionskosten sowie Zeit erheblich.

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Wir danken dem Team des DKFZ Virus Produktion und Entwicklung ausgeben, insbesondere Marcus Müller, Silvia Münstermann, Barbara Liebetrau, und Mandy Roscher. Diese Studie wurde teilweise durch Zuschüsse aus dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) und der Helmholtz-Gemeinschaft im Rahmen des Deutschen Krebsforschungszentrums / Cancéropôle du Grand-Est gemeinsamen Programm in Applied Tumorvirologie unterstützt.

Beachten Sie, dass ein Labor mit Sicherheitsstufe 2 für die Produktion rekombinanter Parvoviren (recPV) ist erforderlich. Das Protokoll ist in zwei Hauptteile gegliedert. Der erste Teil (Herstellung von recPV durch Transfektion) benötigt, um die minimale Menge an recPVs, die als Inokulum dient im zweiten Teil des Protokolls (Herstellung von recPVs durch Infektion) zu erzeugen. Sobald eine kleine Menge von recPVs erzeugt wird, der erste Teil des Protokolls weggelassen werden kann, und die rekombinanten Parvovirus kann nur durch Infektion Bereitstellen des Gens, das für die Parvovirus-Kapsidproteine ​​durch die Adenovirus-Helferfunktionen (siehe unten) amplifiziert werden. 1. Herstellung von recPVs über Transfektion 1,1 Virale DNA-Transfektion Es ist möglich, jede produzierte DNA-Transfektionsverfahren in diesem Abschnitt des Protokolls entweder auf kationischen Lipiden oder Calciumphosphat basieren. Wir verwenden in der Regel Fugene HD Transfektionsreagenz. Um die Transfektionseffizienz kontrollieren, empfehlen wir die zusätzliche Transfektion Platte mit einem Plasmid, das Enhanced Green Fluorescent Protein (zB pEGFP-N1, Clontech). Die Transfektion wird als effizient und optimal für Virusproduktion, wenn mindestens 50% der Zellpopulation führt EGFP-positive 24 Stunden nach der Transfektion. <ol><li> 1 Tag vor der Transfektion Saatgut 2.000.000 HEK293T-Zellen in einer 10 cm-Platte, zu 50% Konfluenz zellulären am Tag der Transfektion erhalten. Kultivieren von Zellen in 10 ml Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit Zusatz von 10% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100 U pro ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. </li><li> Bereiten Sie Virus-Making-Gemisch (Molverhältnis 01.02.01) in einem 1,5 ml-Tube: <ol class="lalpha"><li> 3 ug recPV Vektor, der das Transgen von Interesse (ei PhH-1-GFP-6). </li><li> 6 ug Vektor pCMV / VP 5 beherbergt die Parvoviruskapsid Gen-Einheit </li><li> 8 ug of Adenovirus-Helferplasmid abgeleiteten pXX6 7. </li></ol></li><li> Verdünnen Sie die Plasmide Mix mit serumfreiem Medium bis zu 850 ul (Endkonzentration von 20 ng / ul). </li><li> In 42,5 ul Fugene HD (2,5:1 Verhältnis ul Fugene: ug DNA). Berühren Sie nicht die Seite der Röhre beim Hinzufügen Fugene auf das Medium. </li><li> Vorsichtig vortexen für 5-10 Sekunden. </li><li> Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten. </li><li> Fügen Sie die Transfektion Mischungen zu den Zellen tropfenweise. Schütteln Sie die Platte vorsichtig zur gleichmäßigen Verteilung der gesamten Mischung. </li></ol> 1,2 Virusproduktion <ol><li> Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C mit 92% Luftfeuchtigkeit und 5% CO 2 für 72 Stunden vor der Ernte. Während dieser Zeit Nachkommen Parvovirus Teilchen von den Parvovirus Plasmide gebildet ist. </li></ol> 1,3 Virusernte <ol><li> In einer Gewebekultur Kapuze, kratzen die Zellen in ihrem Medium absaugen und überführt die Suspension von der Platte in einen 15ml Kunststoffröhrchen. </li><li> Das Röhrchen bei 250 × g für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen 95% des Überstandes. </li><li> Vortex das Rohr leicht, um das Pellet in dem verbleibenden Überstand (etwa 0,5 ml) resuspendiert. </li><li> Frieren Sie das Rohr bei -80 ° C Es ist möglich, die Produktionskosten zu diesem Zeitpunkt zu stoppen oder mit dem Protokoll weiter. </li><li> Tauen Sie das Fahrwerk und bringen Sie es bei Raumtemperatur. </li><li> Frieren Sie die Suspension in einem Bad aus flüssigem Stickstoff und Auftauen in warmes Wasser bei 37 ° C Beide Röhrchen kräftig für 15 Sekunden und wiederholen Sie die Frost-Tau-Zyklus noch zweimal. </li><li> Zentrifugieren bei 16.000 × g für 15 min bei 4 ° C </li><li> Sammeln Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen. Das Rohr in diesem Stadium enthält das rohe Virus-Präparat. </li><li> Fahren Sie mit dem Virus-Titration (siehe unten). Für die Durchführung recPV das GFP-Gen, sollte eine typische Produktion zu geben 1-3 × 10 7 viralen infektiösen Einheiten entsprechend etwa 1 -3 x 10 10 viralen Genoms, die Teilchen. </li></ol> 1,4 Virus Lagerung <ol><li> Für eine langfristige Lagerung einfrieren das Röhrchen mit dem rohen Extrakt Virus bei -80 ° C Es ist möglich, rohen Viruspräparation Extrakte als Inokulum in den zweiten Teil des Protokolls verwendet. </li></ol> 2. Herstellung von recPVs über Infektion Vor Beginn der Produktion über recPV Infektion, zu produzieren und zu reinigen Adenovirus 5 Tragen des Parvovirus VP-Gen (Ad-VP-Helfer, beschrieben in 5) nach Standard-Protokoll 8. Es ist auch notwendig, eine minimale Menge an recPVs das Transgen trägt von Interesse (zB, hergestellt durch Transfektion wie oben beschrieben) aufweisen. Im Folgenden beschreiben wir die Produktion in recPV 175 cm 2-Kolben (T175)-Format. Die weitere Verstärkung des Virusstocks auf diese Weise hergestellt werden in 10 mehrschichtigen CellSTACK Kulturkammern (Corning) durchgeführt werdenmit geringfügigen Anpassungen des Protokolls vorgeschlagen. 2,1 Infektion <ol><li> 1 Tag vor der Infektion, Platte 10 Millionen Zellen in einem NB324K T175-Kolben auf 60-80% Konfluenz zellulären am Tag der Infektion erhalten. Planen einen zweiten Kolben mit der gleichen Anzahl von Zellen als Kontrolle (nicht-infizierten Zellen). Jede T175 sollte 20 ml Minimum Essential Medium (MEM) als Endvolumen, mit 5% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100U pro ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin ergänzt wurden. </li><li> Am nächsten Morgen vorzubereiten Virus Gemisch in einem 2 ml-Kunststoffröhrchen Röhre, bestehend aus: <ol class="lalpha"><li> Ad-VP-Helfer-5 bei Multiplizität der Infektion (MOI, infektiösen Einheiten / Zelle) = 10 (entsprechend 1 × 10 8 infektiösen Einheiten); </li><li> recPVs bei MOI = 0,5 (entsprechend 5 x 10 6 infektiösen Einheiten). Füllen bis 1,5 ml mit MEM. </li></ol></li><li> Wenden Sie das gesamte Virus Mischung in einem der T175 Kolben. </li><li> Inkubieren Sie dieKolben für 2 Stunden bei 37 ° C, 92% Luftfeuchtigkeit, 5% CO 2 leichtem Schütteln alle 15 min. </li><li> Inkubieren für weitere 20-24 Stunden bei 37 ° C, 92% Luftfeuchtigkeit, 5% CO 2. </li><li> Ersetzen Sie das kulturelle Medium durch frisches Medium. </li></ol> 2,2 Virusproduktion Inkubieren Sie die Kolben bei 37 ° C bei 92% Luftfeuchtigkeit und 5% CO 2 für 48 Stunden. Als Hinweis auf eine effiziente virale Produktion, klare Anzeichen von Zytotoxizität in den Kolben mit viral infizierte Zellen beobachtet werden, beginnend von 36-48 Stunden nach der Infektion. 2,3 Virusernte <ol><li> In einer Gewebekultur Kapuze, absaugen und überweisen Sie den Mediumüberstand aus dem Kolben in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1,5 ml PBS. </li><li> Trypsinieren die Zellen mit 1,5 ml 0,25% EDTA-Trysin. Fügen Sie die Zellsuspension zum Medium entfernt. </li><li> Zentrifugation der Zellen und der Überstand bei 5.000 × g für 5 min bei Raumtemperaturtur. </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> 1 ml TE-Puffer (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,7) auf das Zellpellet und vorsichtig vortexen das Rohr, um die Zellen zu resuspendieren. </li><li> Frieren Sie die Zellsuspension in einem Bad aus flüssigem Stickstoff und Auftauen in warmes Wasser bei 37 ° C Vortex das Rohr kräftig für 15 Sekunden und wiederholen Sie den Frost-Tau-Zyklus dreimal. </li><li> Behandeln der Zellsuspension mit 50 U / ml Benzonase Nuclease für 30 min bei 37 ° C, um die Zelle genomische und nicht-viraler DNAs verpackten verdauen. </li><li> Das Röhrchen bei 5.000 × g für 20 min bei 4 ° C </li><li> Sammeln Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen. Der Überstand auf dieser Stufe enthält das rohe Virus-Präparat. Typische Ausbeuten von recPV-GFP hergestellt nach diesem Protokoll sollte im Bereich von 1-10 x 10 8 viralen infektiösen Einheiten sein. </li></ol> 2,4 Virus Lagerung <ol><li> Bei kurzfristiger Lagerung (maximal 2 Monate), Store-Virus bei 4 ° C </li><li> Für LONg Langzeitlagerung (länger als 2 Monate), Filiale Virus bei -80 ° C </li></ol> 3. RecPV Reinigung <ol><li> Für die Reinigung von recPVs aus den Rohlysaten, empfehlen wir, einen diskontinuierlichen Gradienten Iodixanol nach Zolotukhin et al laufen. 9. Wir empfehlen die Verwendung von mindestens 5 ml rohe virale Extrakt (gewonnen aus der Produktion in fünf T175-Flaschen) für eine effiziente Reinigung Virus. </li></ol> 4. Rekombinanten Parvovirus-Titration <ol><li> Führen recPV Titration wie in El-Andaloussi et al. 5 </li></ol> 5. Qualitätskontrollen <ol><li> Verwendung des Protokolls in El-Andaloussi et al. 5 beschrieben auf das Vorhandensein von unerwünschten replikationskompetenten Viren (NA) für die Durchführung Parvovirus Plaque-Assay in NB324K Indikator-Zellen zu überprüfen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für recPVs production durch Transfektion in Gegenwart oder Abwesenheit von Adenovirus genomische Elemente in 3 gezeigt. Die Zellen wurden mit pCMV / VP (Plasmid, welches das Gen für den VP-Parvovirus-Kapsidproteine) zusammen mit PhH-1-GFP (a recPV beherbergen das GFP-Gen) oder PHH-1-Luciferase (a recPV beherbergen die Glühwürmchen-Luciferase-Gen) transfiziert , mit (+ pXX6) oder ohne (-pXX6) die pXX6 Plasmid (welche das Adenovirus-E2A-, E4 (orf6) und VA-RNA-Gene). Gleiche Volumen von Zellextrakten wurden verwendet, um Zellen und NB324K GFP-Transduktion oder Luciferase-Assays durchgeführt wurden wie in El-Andaloussi et al. 5. Eine deutliche Zunahme der recPVs Produktion wurde in Gegenwart von pXX6 mit zunehmender Produktion von 0,3 GFP transductional Einheiten (TU) / Zelle, erhalten nach herkömmlichen Protokollen auf ca. 5 TU / Zelle erhalten nach unserer Methode (Abb. 3a, b). Ein signifikanter Anstieg (etwa 24-fach) recPV Produktiam wurde auch im Falle von PHH-1-Luciferase (3C) beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass das genetische Material in pXX6 enthalten können Parvovirus Produktion zu steigern ist. Ein repräsentatives Beispiel für recPVs Produktion über Infektion wird in Abbildung 4 dargestellt. NB324K Zellen wurden mit verschiedenen recPVs (wie in der Abbildung angegeben) und Ad-VP-Helfer (beherbergt das Gen, das für die PV-VP Kapsidproteine) co-infiziert. Ad-VP-Helfer weiter verbessert recPV Erzeugung bis zu&gt; 70 TU pro ausgesäte Zelle (4A), ohne das Auftreten von unerwünschten replikationsfähige virale Partikel (4B). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Vektoren auf Basis von autonomen Parvoviren. (A) Oben: Das Transgen ersetzt einen Teil der VP-kodierenden Gene und steht unter der Kontrolle der viralen Promotor P38. Die Gene für NS1 / 2 sind neugewartet und die Expression durch den viralen Promotor gesteuert P4. Die Vektor-Genom durch die parvoviralen ITRs, die cis-wirkende Elemente, die für die Replikation und Verpackung des rekombinanten Genom benötigt werden, enthalten flankiert. Unten: Ein Plasmid, das die VP-Gen unter entweder einem heterologen (zB CMV.) Oder autologe (zB P38.) Promotor (Px), wird in trans während der rekombinanten Produktion Parvovirus zugeführt, um für die Unterbrechung der strukturellen Gene ausgleichen in dem rekombinanten Genom. ITR, Inverted Terminal Repeat. Abbildung aus 4 angepasst. (B) Schematische Darstellung des klassischen Protokoll für die Herstellung von recPVs verwendet. HEK293T-Zellen transient mit viraler DNA (Vektor und Helferplasmiden) und nach drei Tagen transfiziert werden die Zellen gesammelt und Viren geerntet. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Herstellung von mit der recPVsHilfe des Ad-VP. (A) Schematische Karten von recPV und Ad-VP Genome. Die recPV enthält eine heterologe Transgen, die in der VP Region ersetzt. Die Ad-VP birgt das Parvovirus VP-Gen. (B) Schematische Darstellung des Protokolls in diesem Manuskript beschrieben. NB324K Zellen werden mit recPV und Ad-VP-Viren infiziert. Nach drei Tagen werden die Zellen geerntet und recPV Teilchen aus dem Zellysat gewonnen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Die Stimulation der Produktion von recPV Adenovirus-basierte Plasmide pXX6. HEK293T-Zellen in 10-cm-Schalen ausgesät wurden mit pCMV / VP in Kombination mit PhH-1-GFP (A und B) oder PHH-1-Luciferase (C) transfiziert, um recPVs erzeugen. Gleichzeitig wurden die Zellen mit den Adenovirus-abgeleiteten Helferplasmiden pXX6 oder nicht, wie angegeben co-transfiziert. Drei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und durch drei Gefrier-und Auftau-Zyklen lysiert. Gleiche Volumina von CRUDE-Virus Extrakte wurden angewandt, um Indikatorzellen NBK, und Transduktion Assays wurden durchgeführt. (A) Repräsentative Aufnahmen, welche GFP-positiven Zellen im konfluenten Monolayer NB324K. (B) Quantifizierung der GFP-Transduktion Transduktion in Assays (TE) pro seeded Zelle exprimiert . (C) Quantifizierung der Luciferase-Aktivität als die relativen Luciferase-Einheiten (RLU) ausgedrückt. Die Luciferase-Assay wurde wie in El-Andaloussi et al. 5. Säulen repräsentieren Mittelwerte aus drei Wiederholungen mit Standardabweichung Bars. Anzahl auf der + pXX6 Spalte in (B und C) zeigt die fachen Anstieg der recPV Virustiter, in Gegenwart von pXX6 versus ohne erhalten. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Die Stimulation der Produktion recPV mittels rekombinanter Ad-VP Helfervirus. (A) NB324K Zellen waren InfektionenTed mit gereinigtem Ad-VP Helfer-Virus bei einer MOI von 10 (Ad-X-Einheit / Zelle, titriert mit Adeno-X Rapid-Titer Kit), und dann Superinfektion mit einer der folgenden rekombinanten Parvovirus-Chi-HH-1-EGFP 11 (0,1 TU / cell) oder H-1-GFP (0,5 TU / cell) 5. Einen Tag nach der Infektion wurde das Medium gewechselt und zwei Tage später wurden die Zellen gesammelt und lysiert über drei Gefrier-und-Tau-Zyklen. Rohzellextrakte wurden verwendet, um Virustiter durch Transduktion Assay zu bestimmen nach El-Andaloussi et al. 5. TU, Transduktion Einheit. (B) virale Chargen in der Gegenwart oder Abwesenheit von Ad-VP hergestellt wurden auf ihren Gehalt von Replikations-kompetenten Viruspartikel (NA) durch Plaque-Assay auf NB324K Indikator-Zellen analysiert.

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Wir haben gezeigt, dass recPV Produktion durch die Anwesenheit von adenoviralen Genom-Elemente erhöht werden kann. Wir haben die recPV Ausbeuten von mehr als 10-fach (0,3 bis 5 TU / Zelle) erhöht, indem Adenovirus genomische Element über Transfektion und durch mehr als 100-fach Co-Infizieren der Zellen mit Ad-VP-Helfer in Kombination mit dem in recPV Vergleich zu herkömmlichen Protokollen. Die hier beschriebene Protokoll kann durch die Bestimmung der am besten geeigneten Zeitpunkt für die Lieferung der Adenovirus-Genom-...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Sigma </td><td> M4655 </td></tr><tr><td> Fötale Rinderserum </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Fugene </td><td> Roche </td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300062 </td></tr><tr><td> Benzonase Nuclease </td><td> Sigma </td><td> E8263 </td></tr><tr><td> Adeno-X Schnelle Titer Kit </td><td> Clontech </td><td> 632250 </td></tr></tbody></table>

effiziente rekombinanten parvovirus produktion mit hilfe von adenovirus-abgeleiteten systemen

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Nagetier-Parvoviren (PV) wie Ratten H-1PV und MVM, sind kleine ikosaedrische, einzelsträngige, DNA-Viren. Das Genom enthält zwei Promotoren P4 und P38, die die Expression von nicht-strukturellen (NS1 und NS2) und Kapsid-Proteine ​​(VP1 und VP2), die jeweils 1 zu regulieren. Sie ziehen hohe Zinsen als Antikrebsmittel für ihre onkolytischen und oncosuppressive Fähigkeiten, aber dabei nicht-pathogen für den Menschen 2. NS1 ist das zentrale viraler Cytotoxizität 3. Zur weiteren Verbesserung ihrer natürlichen antineoplastischen Aktivitäten wurden Derivate von diesen Vektoren durch Ersetzen des Gens, das für die Kapsidproteine ​​mit einem therapeutischen Transgens (zB ein zytotoxisches Polypeptid, Cytokin, Chemokin, Tumorsuppressor-Gen usw.) 4 erzeugt wurde. Die rekombinanten Parvoviren (recPVs) Vektor behält die NS1 / 2 kodierenden Sequenzen und die PV-Genom Telomere, die notwendig für die virale DNA-Amplifikation und Verpackung sind. Herstellung vonrecPVs nur, wenn die Produzentenzellen (in der Regel HEK293T), durch Co-Transfektion der Zellen mit einem zweiten Vektor (pCMV-VP) Exprimieren des Gens, das für die VP-Proteine ​​(Abb. 1) 4. Die recPV Vektoren auf diese Weise erzeugt werden, sind Replikation defekt. Obwohl recPVs erwies sich verbesserte oncotoxic Aktivitäten in Bezug auf die elterliche Viren, von denen sie erzeugt worden sein besitzen, bleibt ihre Produktion eine große Herausforderung und stark behindert die Verwendung dieser Mittel im Anti-Krebs-klinische Anwendungen. Wir fanden, dass die Einführung eines Ad-5-abgeleiteten Vektor, der das E2a, E4 (orf6) und die VA-RNA-Gene (zB pXX6 Plasmid) in HEK293T verbessert die Herstellung von recPVs um mehr als 10-fach im Vergleich zu anderen Protokolle verwendet. Basierend auf dieser Erkenntnis, haben wir eine neue Ad-VP-Helfer, dass die genomische adenoviralen Elemente notwendig, recPVs Produktion zu verbessern sowie die parvovir enthält gebautuns VP-Einheit 5-Gen. Die Verwendung von Ad-VP-Helfer-, ermöglicht die Herstellung von rec-PV unter Verwendung eines Protokolls, die vollständig von den viralen Infektion Schritte (im Gegensatz zu Plasmid-Transfektion gegenüberliegenden), die Ermöglichung der Verwendung von Zelllinien, die schwer zu transfizieren (zB NB324K) ( Abb.. 2). Wir stellen eine Methode verbessert das groß die Menge des produzierten rekombinanten Virus, wodurch sowohl die Produktionszeiten und-kosten, ohne dass die Qualität des Endproduktes 5. Darüber hinaus ist die großtechnische Herstellung von recPV (in Suspension Zellen und Bioreaktoren) nun denkbar.

Hier beschreiben wir ein Protokoll nur auf Zellinfektion, was die Effizienz von rekombinanten Parvovirus-Produktion um mehr als 100-fach im Vergleich zu anderen Protokolle verwendet verbessert bezogen. Dieses Protokoll basiert auf der Verwendung einer neuartigen Adenovirus-5-basiertes Hilfsprogramm mit dem Parvovirus VP Transkriptionseinheit (Ad-VP).

Effiziente rekombinanten Parvovirus Produktion mit Hilfe von Adenovirus-abgeleiteten Systemen

Parvoviren (PV) von Nagetieren, wie das Ratten-H-1PV und MVM, sind kleine ikosaedrische DNA-Viren mit einzelsträngigem Genom. Ihr Genom umfasst zwei Promotoren, P4 und P38 ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, rekombinante Parvoviren, oder rec PVS, in hohen Titer zu erzeugen, wobei gleichzeitig ihre Qualität erhalten bleibt und die Produktionszeiten sowie -kosten reduziert werden. Dies wird erreicht, indem zunächst ein anfänglicher rec-PV-Virusstamm durch Transfektion von HEC 2 93 T-Zellen mit rec-PV-Plasmiden zusammen mit einem aus Adenovirus Typ 5 stammenden Vektor hergestellt wird. Da die Einführung ad-Genom-Elemente in die HEC 2 9 3 T-Zellen die Produktion von rec PVS um mehr als das Zehnfache erhöht. Im Vergleich zu bestehenden Protokollen wurde ein neuartiger AD-VP-Hilfsvektor erzeugt, der die genomischen adenoviralen Elemente enthält, die notwendig sind, um die Produktion rekombinanter Parvoviren zu verbessern, sowie die Parvovirus-VP-Gen-Einheit. Der nächste Schritt besteht darin, diesen neuartigen AD-VP-Hilfsvektor gemäß Standardprotokollen herzustellen und zu reinigen.Der letzte Schritt dieses Verfahrens besteht darin, die rekombinanten PVS durch gleichzeitige Infektion von NB324K-Zellen mit dem rekombinanten PV und ADP-Viren zu amplifizieren. Die Effizienz der Produktion rekombinanter PVs wird durch diese Strategie um meh

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Ding, J., et al. Herstellung von rAAV9 zur Überexpression oder Genabschaltung in Mausherzen. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Herstellung rekombinanter adeno-assoziierter Viruspartikel mittels Plasmid-Transfektion in Säugetierzellen. Es verdeutlicht die koordinierte Expression der Rep-, Cap- und Hilfsproteine, die die virale Genomreplikation und die Kapsid-Assembly im Zellkern antreiben.

Erzeugung von rekombinanten adeno-assoziierten Viren durch Plasmid-Transfektion

Rettung von rekombinanten Arenaviren von geklonten cDNAs, ein Ansatz, so genannte Reverse Genetik, ermöglicht es den Forschern, die Rolle der spezifischen viralen Genprodukte, sowie den Beitrag ihrer unterschiedlichen spezifischen Domänen und Rückstände zu untersuchen, um viele verschiedene Aspekte der Biologie von Arenavirus . Ebenso Techniken reverser Genetik in FDA-zugelassenen Zelllinien (Vero) für die Impfstoffentwicklung bietet neue Möglichkeiten für die Erzeugung und sichere Impfstoffe...

Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

In den letzten 15 Jahren haben vom caninen Adenovirus Typ 2 (CAV2) abgeleitete Vektoren ihre Wirksamkeit bei der Übertragung von Zellen in vitro und in vivo bewiesen und werden häufig für Impfungen und Gentherapien eingesetzt. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Konstruktion, Herstellung und Reinigung von CAV2-Vektoren, wodurch virale Suspensionen mit hohem Titer entstehen.

Produktion und Aufreinigung von nicht-replikativen Vektoren des caninen Adenovirus Typ 2

Hier, um einen Proof-of-Prinzip zweiwertigen Adenovirus Typ 5 (Ad5) Vektor zu erzeugen präsentieren wir ein Protokoll Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 durch Verwendung des Antigen Capsid-Incorporation Strategie. Dieser Vektor wurde gezeigt qualitative Fitness aufweisen, um die Fähigkeit Ad5-positiven Seren in vitro und die Antigenität als auch die Immunogenität für die zugesetzten Antigene zu entkommen.

Unter Verwendung der Antigen Capsid-Incorporation Strategie für die Förderung der Adenovirus-Serotyp 5-Vectored Vaccine Approaches

Es wird ein Protokoll zur Erzeugung von adenoviralen Vektoren mit hoher Kapazität vorgestellt, bei denen alle viralen kodierenden Sequenzen fehlen. Die Klonierung von Transgenen, die im Vektorgenom enthalten sind, basiert auf Homing-Endonukleasen. Die Virusamplifikation in Produzentenzellen, die als adhärente Zellen und in Suspension gezüchtet werden, beruht auf einem Helfervirus, das virale Gene in trans bereitstellt.

Klonierung und großtechnische Produktion von High-Capacity Adenovirusvektoren Auf der Grundlage des humanen Adenovirus Typ 5

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung und Verstärkung genetisch modifiziert respiratory syncytial Viren (RSV) und eine optimierte Plaque-Assay für RSV. Wir veranschaulichen dieses Protokolls durch die Schaffung von zwei rekombinanter Viren, die Quantifizierung der RSV-Replikation ermöglichen bzw. live-Analyse des RSV Einschlusskörperchen und Einschlusskörperchen-assoziierten Granulat Dynamik.

Erzeugung, Verstärkung und Titration von rekombinanten Respiratory Syncytial Viren

Die Generierung rekombinanter Rotaviren aus Plasmid-DNA ist ein wesentliches Werkzeug für die Untersuchung der Rotavirus-Replikation und Pathogenese sowie für die Entwicklung von Rotavirus-Expressionsvektoren und Impfstoffen. Hierin beschreiben wir einen vereinfachten Reverse-Genetik-Ansatz zur Erzeugung rekombinanter Rotaviren, einschließlich Stämmen, die fluoreszierende Reporterproteine exdrücken.

Vereinfachte Reverse Genetics-Methode zur Wiederherstellung rekombinanter Rotaviren, die Reporterproteine ausdrücken

Dies ist eine Methode, um "scarinant" rekombinante Vaknie-Viren mit Host-Range-Auswahl und visuelle Identifizierung von rekombinanten Viren zu generieren.

Schnelle, nahtlose Generierung von rekombinanten Poxviren mit Host Range und visueller Auswahl

Hier stellen wir ein Protokoll für die Adenovirus-Produktion mit dem pAdEasy-System vor. Die Technologie umfasst die Rekombination der Plasmide pAdTrack und pAdEasy-1, die Adenovirus-Verpackung und -Verstärkung, die Reinigung der adenoviralen Partikel aus Zelllysat und Kulturmedium, die virale Titration und die funktionelle Prüfung des Adenovirus.

Eine effiziente Methode für die Adenovirus-Produktion

Die Fluktuationsrate von Viren in Meer-und Süßwasser-Systeme können durch eine Reduktion und Wiederholung Technik geschätzt werden. Die Daten können die Forscher Raten von Virus-vermittelte mikrobielle Sterblichkeit in aquatischen Systemen zu schließen.

Die Schätzung Virus Produktionsraten in aquatischen Systemen

Erfahren Sie die effiziente Produktion rekombinanter Parvoviren mit einem neuartigen Adenovirus-5-Hilfsvektor. Diese Methode steigert die Virusausbreitung um mehr als das Zehnfache und reduziert Produktionskosten sowie Zeit erheblich.

Effiziente rekombinanten Parvovirus Produktion mit Hilfe von Adenovirus-abgeleiteten Systemen

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