Tracking Hypoxische Signaling in Encapsulated Zellaggregate

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die zelluläre Antwort auf Hypoxie in PEG-umhüllten Zellaggregaten zu überwachen. Im ersten Schritt werden dispergierte Zellen mit dem Markervirus infiziert und anschließend auf einem Schüttler kultiviert, um die Bildung von Aggregaten zu ermöglichen. Danach wird lineares PEG funktionalisiert und der PEG-DM-Präkursor gereinigt.

Anschließend werden die Zellaggregate in ein PEG-DM-Hydrogel eingekapselt. Abschließend werden die Hydrogele unter verschiedenen Sauerstoffbedingungen kultiviert und gleichzeitig mittels Fluoreszenzüberwachung auf das Signal des Hypoxie-Markers analysiert. Letztendlich kann die Lokalisation und Intensität der hypoxieinduziblen Faktor-Aktivität innerhalb lebensfähiger, eingekapselter Zellaggregate durch einfache Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen in den Bereichen Zellverkapselung und zellbasierte therapeutische Abgabesysteme beantworten, beispielsweise: Wo tritt Hypoxie in 3D-Kulturen auf, und wie beeinflusst sie das Überleben und die Funktion der Zellen? Die Auswirkungen dieser Technik reichen bis in die regenerative Medizin und die Therapie von Hormondefiziten wie beispielsweise Typ-1-Diabetes, da Hypoxie in aggregierten und verkapselten Geweben eine wesentliche Rolle spielt. Es wurde gezeigt, dass die Aktivität des hypoxieinduzierbaren Faktors 1 mit einer stark verminderten Insulinsekretion aus Beta-Zellen korreliert, was Versuche motiviert, primäre Inseln zu dissoziieren und sie zu pseudo-inselnartigen Strukturen umzuformen.

Aggregate mit reduziertem Durchmesser. Unser Marker kann die Aktivität des hypoxieinduziblen Faktors durch Aggregate auf zellulärer Ebene innerhalb beliebigen gelockerten umhüllenden Materials anzeigen. PEG wurde als Kapselmaterial aufgrund seiner günstigen Transfereigenschaften, zytoverträglichen Beschaffenheit und der einfachen Möglichkeit, es funktionell zu modifizieren, gewählt.

Nachdem zwei Gramm PEG in einer 40-Milliliter-Glasflasche abgewogen wurden, etwa 308 Mikroliter Methacrylsäureanhydrid hinzufügen und die Flasche mit einer harten Kunststoffkappe locker verschließen. Die Flasche zwei Minuten lang in einer handelsüblichen Mikrowelle bei voller Leistung erhitzen. Anschließend die Flasche unter Verwendung hitzebeständiger Handschuhe gründlich verwirbeln und die Lösung weitere fünf Minuten bei voller Leistung in der Mikrowelle erhitzen.

Lassen Sie das Vial kurz so weit abkühlen, dass es sicher gehandhabt werden kann, und öffnen Sie es dann unter leichtem Schwenken. Geben Sie langsam Methylenchlorid hinzu und wirbeln Sie die Probe bei Bedarf solange, bis die Lösung klar und homogen erscheint. Fügen Sie die Lösung anschließend tropfenweise zu 200 Milliliter gerührtem kaltem Diethylether hinzu, um das PEG dm auszufällen.

Sammlen Sie anschließend das PEG DM durch Vakuumfiltration und lassen Sie es trocknen. Sobald das PEG DM getrocknet ist, lösen Sie es in etwa 100 bis 150 Milliliter entionisiertem Wasser auf. Dialysieren Sie die Lösung danach fünf Tage lang gegen entionisiertes Wasser in Dialysegefäßen mit einer Molekulargewichts-Cutoff von 1000 Dalton.

Geben Sie die Lösung in geeignete Behälter und gefrieren Sie sie über Nacht bei minus 80 Grad Celsius ein. Anschließend lyophilisieren Sie die Lösung vier Tage lang, um ein gereinigtes weißes PEG-DM-Pulver zu erhalten, um die Zellen von der behandelten Kulturschalenoberfläche zu lösen. Aspirieren Sie zuerst das Medium, spülen Sie die Zellen mit kalzium- und magnesiumfreiem HBSS bei 37 Grad Celsius ab und aspirieren Sie den HBSS.

Jetzt zwei Milliliter einer 37 Grad Celsius warmen Lösung aus Trips und EDTA hinzufügen und die Zellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren lassen. Anschließend die Seite des Kolbens kräftig anstoßen, um die Zellen zu lösen, acht Milliliter 37 Grad Celsius warmer Medium zugeben und die Zellsuspension kräftig mehrmals auf- und abpipettieren, wobei darauf geachtet werden sollte, keine Blasen einzuschließen.

Nachdem die Zelllösung in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt wurde, zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers, um die Gesamtzahl der zu infizierenden Zellen zu bestimmen. Geben Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension hinzu, um 400.000 Zellen pro Vertiefung in die Vertiefungen einer sechswelligen Suspensionskulturplatte zu überführen. Aliquotieren Sie 50 Mikroliter HBSS pro Vertiefung mit zu infizierenden Zellen in ein 1,8-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Danach pipettieren Sie vorsichtig die richtige Menge der Virensuspension in das vorbereitete HBSS.

Geben Sie nun das entsprechende Volumen an verdünntem Virus in jede Vertiefung, um die gewünschte MOI zu erreichen, und fügen Sie anschließend Medium zu jeder Vertiefung hinzu, um das Gesamtvolumen auf 1,7 Milliliter aufzufüllen. Stellen Sie schließlich die Platte auf einen Rütteltisch im Inneren des Brutschrankes und stellen Sie den Rütteltisch auf eine niedrige Drehzahl von etwa 100 U/min ein, sodass das Medium sanft in der Vertiefung umgewälzt wird, und lassen Sie die Zellen 24 bis 36 Stunden lang aggregieren. Beginnen Sie damit, die konische Spitze einer ein-Milliliter-Kunststoffspritze abzuschneiden, und stellen Sie sie mit der offenen Seite nach oben in ein Gestell, um einen Behälter zu schaffen, in dem das Hydrogel gebildet wird.

Als Nächstes pipettieren Sie 20 Mikroliter der lichtaktiven PEG-DM-Lösung in das offene Ende der Spritze auf den Kolben, wobei sichergestellt werden muss, dass das Volumen die gesamte Kolbenoberfläche bedeckt. Stellen Sie den Kolben in kleinen Schritten so ein, dass eine ebene Flüssigkeitsoberfläche entsteht. Stellen Sie die Pipette danach zurück in den Halter und positionieren Sie den Halter unter einer UV-Lampe für etwa acht Minuten, um die Vernetzung des Hydrogels zu ermöglichen.

Pipettieren Sie während dieser Zeit das Volumen, das die gewünschte Anzahl an Zellen und Aggregaten enthält, in ein 1,8-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Verschließen Sie das Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen und Aggregate fünf Minuten lang bei 130 ×g. Entfernen Sie anschließend mit einer Mikropipette vorsichtig den Überstand, ohne den Zellpellet an der Spitze des Röhrchens zu stören.

Wenn sich die Medienoberfläche dem Pellet nähert, verwenden Sie eine feinere 10-Mikroliter-Pipettenspitze, um die Zellaggregate gleichmäßig in der Gel-Vorläuferlösung zu verteilen, wobei sichergestellt werden muss, dass sie vollständig eingeschlossen sind. Dies ist der schwierigste Teil dieses Verfahrens. Gehen Sie bei der Durchführung dieses Schritts vorsichtig vor, um das Pellet sanft aufzulösen und zu übertragen.

Nun das Zellpellet vorsichtig in 20 Mikrolitern der photoaktiven PEG-DM-Lösung resuspendieren. Mit einer Pipettenspitze mit großem Durchmesser die Zellsuspension in die Spritze über dem vernetzten Hydrogel-Abschnitt geben und die Spritze anschließend acht Minuten lang zusätzlich UV-Licht aussetzen, um die Herstellung des Hydrogels abzuschließen. Am Ende sollten die Zellen vollständig innerhalb des zylindrischen Hydrogels eingeschlossen sein.

Fügen Sie abschließend ein Milliliter HBSS in ein Loch einer 24-Loch-Platte und ein Milliliter Medium in ein anderes Loch hinzu. Spülen Sie dann das Hydrogel durch Ausstoßen aus der Spritze in das HBSS, um das Gel kurz zu waschen. Überführen Sie das Gel in das Medium und kultivieren Sie die Platte unter den gewünschten Bedingungen.

Zu jedem Zeitpunkt der Kultur können die Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht werden, um den Beginn der hypoxischen Signalgebung zu verfolgen. Dazu wird die 24-Well-Platte auf die Mikroskopbühne gestellt und das mit Hydrogel beschichtete Well unter dem Objektiv zentriert. Das Signal ist spezifisch genug, um einzelne signalmittlerische Zellen zu identifizieren, jedoch kann die Auflösung unzureichend sein, um die intrazelluläre Lokalisation des Signals zu bestimmen. In signalmittlerischen Zellen wird das Signal typischerweise gleichmäßig im gesamten Zytoplasma beobachtet.

Diese Abbildung zeigt ein repräsentatives Beispiel für Minx-Aggregate, die in einem PEG-Hydrogel innerhalb der Gelzelle eingeschlossen sind. Die Aggregate sollten vollständig in der Matrix eingeschlossen und homogen verteilt sein, um einen besseren Nährstofftransport zu ermöglichen, wie hier zu sehen. Beachten Sie, wie das vernetzte Gel durchgehend fest ist und die Form des Gefäßes annimmt, in dem die Reaktion durchgeführt wurde.

In dieser Abbildung ist eine repräsentative fluoreszierende Hypoxie-Signalgebung in aggregierten Min6-Zellen in einem PEG-DM-Hydrogel dargestellt, die eingekapselt und anschließend 44 Stunden bei 20 % Sauerstoff inkubiert wurden. Die links abgebildeten Zellen zeigen keine Hypoxie-Signalgebung, während Zellen, die eingekapselt und dann 44 Stunden bei 2 % Sauerstoff inkubiert wurden, wie rechts dargestellt, ein klares, ubiquitäres Hypoxie-Signal aufweisen. Diese Hypoxie-Signalgebung kann ebenfalls in anderen Zelltypen verfolgt werden.

Diese Abbildung zeigt repräsentative hypoxische Signalgebung in eingeschlossenen mesenchymalen Stammzell-Aggregaten. Wie in der linken Abbildung zu sehen, ist das fluoreszierende Signal nach 12 Stunden bei 2 % Sauerstoff nicht nachweisbar, danach wird es – wie in der mittleren Abbildung ersichtlich – nach 24 Stunden bei 2 % Sauerstoff deutlicher und schließlich – wie auf der rechten Seite dargestellt – nach 96 Stunden bei 2 % Sauerstoff stark exprimiert, nachdem dieses Verfahren durchgeführt wurde.

Andere Methoden wie ELISA, die Analyse sekretierter Proteine und Zellviabilitätsassays können durchgeführt werden, um die Hypoxie-Signalgebung mit dem Zellphänotyp zu korrelieren. Durch diese Weiterentwicklung könnte diese Technik für Forscher in den Bereichen Gewebeengineering und zellbasierte Therapeutikadistribution den Weg ebnen, Überlebensfunktionen und Differenzierung von Zellen innerhalb von Gerüsten und Einschlussmaterialien zu untersuchen.