Tracking Hypoxische Signaling in Encapsulated Zellaggregate

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die zelluläre Reaktion auf Hypoxie in PEG-verkapselten Zellaggregaten zu überwachen. Im ersten Schritt werden dispergierte Zellen mit dem Markervirus infiziert und dann auf einem Schüttler kultiviert, um die Bildung von Aggregaten zu ermöglichen. Als nächstes wird der lineare Stift funktionalisiert und der PEG DM Rimer gereinigt.

Anschließend werden die Zellaggregate in einem PEG DM Hydrogel verkapselt. Schließlich werden die Hydrogele unter verschiedenen Sauerstoffbedingungen kultiviert, während sie fluoreszierend auf das Hypoxie-Markersignal überwacht werden. Letztendlich können der Ort und das Ausmaß der Hypoxie-induzierbaren Faktoraktivität in lebensfähigen verkapselten Aggregaten von Zellen durch einfache Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden.

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen in den Bereichen der Zellverkapselung und der zellbasierten therapeutischen Verabreichung zu beantworten, wie z. B. Wo tritt Hypoxie in 3D-Kulturen auf und wie wirkt sie sich auf das Überleben und die Funktion der Zellen aus? Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf Ansätze der regenerativen Medizin und die Therapie von Hormonmangel wie z.B. Diabetes, da Hypoxie in aggregierten und verkapselten Geweben einen großen Einfluss hat. Es hat sich gezeigt, dass die Aktivität des induzierbaren Faktors 1 mit einer stark reduzierten Insulinsekretion aus Betazellen korreliert, was zu Versuchen motiviert, primäre Ösen zu dissoziieren und sie in Pseudo-Ösen zu reformieren.

Zuschlagstoffe mit reduziertem Durchmesser. Unser Marker kann die Aktivität eines induzierbaren Hypoxiefaktors mit einem Aggregat auf zellulärer Ebene innerhalb eines gelösten Verkapselungsmaterials anzeigen. PEG wurde aufgrund seiner günstigen Übertragungseigenschaften, seiner Zytokompatibilität und der Leichtigkeit, mit der es funktionell modifiziert werden kann, als Kapselmaterial ausgewählt.

Nachdem Sie zwei Gramm PEG in einem 40-Milliliter-Glasfläschchen bei etwa 308 Mikrolitern Meth, Acryl und Anhydrid gewogen haben, verschließen Sie das Fläschchen locker mit einer Hartplastikkappe. Stellen Sie das Fläschchen zwei Minuten lang in einer haushaltsüblichen Mikrowelle auf hoher Stufe in die Mikrowelle. Tragen Sie dann hitzebeständige Handschuhe, wirbeln Sie das Fläschchen gründlich durch und erhitzen Sie die Lösung weitere fünf Minuten lang auf hoher Stufe in der Mikrowelle.

Lassen Sie das Fläschchen kurz so weit abkühlen, dass es angefasst werden kann, und öffnen Sie dann den Deckel, während Sie das Fläschchen schwenken. Mischen Sie langsam Methylenchlorid ein und wirbeln Sie die Probe nach Bedarf, bis die Lösung klar und homogen erscheint. Als nächstes fügen Sie die Lösung tropfenweise zu 200 Millilitern gerührtem kaltem Dathylether hinzu, um das PEG dm auszufällen.

Anschließend wird das PEG DM durch Vakuumfiltration aufgefangen und trocknen gelassen. Sobald das PEG DM getrocknet ist, lösen Sie es in etwa 100 bis 150 Millilitern deionisiertem Wasser auf. Dialysieren Sie dann die Lösung fünf Tage lang in Dialyseschläuchen mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 1000 Dalton nach der Dialyse gegen deionisiertes Wasser.

Die Lösung in geeignete Behälter füllen und über Nacht bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Anschließend wird die Lösung vier Tage lang lyophilisiert, um ein gereinigtes weißes PEG-DM-Pulver zu erzeugen, das die Zellen von der Oberfläche des behandelten Kulturkolbens freisetzt. Aspirieren Sie zuerst das Medium, spülen Sie die Zellen mit 37 Grad CELs Kalzium, magnesiumfreiem HBSS, und aspirieren Sie das HBSS.

Fügen Sie nun zwei Milliliter 37-Grad-Celsius-Trips und EDTA-Lösung hinzu und lassen Sie die Zellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Dann wird die Seite des Kolbens fest geschüttelt, um die Zellen bei acht Millilitern mit 37 Grad Celsius auf mittlerer Stufe des Kolbens freizuschlagen, und die Zellsuspension kräftig auf und ab pipettiert. Achten Sie darauf, keine Blasen einzuführen.

Nachdem Sie die Zelllösung in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt haben, zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, um die Gesamtzahl der zu infizierenden Zellen zu bestimmen. Fügen Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension hinzu, um 400.000 Zellen pro Vertiefung in die Vertiefungen einer Suspensionskulturplatte mit sechs Vertiefungen zu erhalten, aliquotieren Sie 50 Mikroliter HBSS pro Vertiefung der zu infizierenden Zellen in ein 1,8-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie anschließend vorsichtig die richtige Menge der Virussuspension in das vorbereitete HBSS.

Geben Sie nun das entsprechende Volumen des verdünnten Virus in jede Vertiefung, um das gewünschte MOI zu erreichen, und fügen Sie dann Medium zu jeder Vertiefung hinzu, um das Gesamtvolumen auf 1,7 Milliliter zu erhöhen. Stellen Sie zum Schluss die Platte auf einen Orbitalschüttler Stellen Sie den Shaker im Inkubator auf eine niedrige Einstellung von etwa 100 U/min, damit das Medium sanft um die Vertiefung herum gespült wird und die Zellen 24 bis 36 Stunden lang aggregieren können. Beginne damit, die spitz zulaufende Spitze von einer Ein-Milliliter-Plastikspritze abzuschneiden und sie geöffnet in ein Gestell zu legen, um ein Gefäß zu schaffen, in dem das Hydrogel gebildet wird.

Pipettieren Sie anschließend 20 Mikroliter photoaktive PEG DM-Lösung in das offene Ende der Spritze auf den Kolben und stellen Sie sicher, dass das Volumen die gesamte Oberfläche des Kolbens bedeckt. Stellen Sie den Kolben in kleinen Schritten ein, um eine flache Flüssigkeitsoberfläche zu erhalten. Setzen Sie nun die Pipette wieder in das Gestell ein und positionieren Sie das Gestell etwa acht Minuten lang unter einer UV-Lampe, um eine Hydrogel-Vernetzung zu ermöglichen.

Während dieser Zeit wird das Pipettenvolumen mit der gewünschten Anzahl von Zellen und Aggregaten in ein 1,8-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert. Verschließen Sie das Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen und Aggregate fünf Minuten lang bei 130 g. Entfernen Sie dann mit einer Mikropipette vorsichtig den Überstand, ohne das Zellpellet an der Spitze des Röhrchens zu stören.

Wenn sich der Medienkopf dem Pellet nähert, verwenden Sie eine feinere 10-Mikroliter-Pipettenspitze, um die Zellaggregate gleichmäßig in der Gelvorläuferlösung zu verteilen und gleichzeitig sicherzustellen, dass sie vollständig eingekapselt sind. Das ist der kniffligste Teil dieses Verfahrens. Achten Sie bei diesem Schritt darauf, das Pellet vorsichtig zu schleifen und zu übertragen.

Nun resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 20 Mikrolitern der photoaktiven PEG DM-Lösung. Setzen Sie die Spritze mit einer Weithalspipettenspitze und geben Sie die Zellsuspension in die Spritze auf den vernetzten Hydrogelteil, indem Sie die Spritze weiteren acht Minuten UV-Licht aussetzen, um den Aufbau des Hydrogels abzuschließen. Wenn sie fertig sind, sollten die Zellen vollständig in das zylindrische Hydrogel eingekapselt sein.

Geben Sie schließlich einen Milliliter HBSS in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte und einen Milliliter Medium in eine andere. Nun, dann werfen Sie das Hydrogel aus der Spritze in das HBSS aus, um das Gel kurz zu waschen. Übertragen Sie das Gel auf das Medium und kultivieren Sie die Platte unter den gewünschten Bedingungen.

Zu jedem Zeitpunkt der Kultur können die Zellen mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie abgebildet werden, um die Initiierung des hypoxischen Signalplatzes, der 24-Well-Platte, auf den Mikroskoptisch zu verfolgen, wobei die Vertiefung mit dem Hydrogel unter dem Objektiv zentriert wird. Das Signal ist spezifisch genug, um einzelne Signalzellen zu identifizieren, aber die Auflösung kann für die Bestimmung der intrazellulären Signallokalisierung unzureichend sein. In Signalzellen wird das Signal typischerweise gleichmäßig im gesamten Zytoplasma beobachtet.

Diese Abbildung zeigt ein repräsentatives Beispiel für Minx-Aggregate, die in einem PEG-Hydrogel innerhalb der Gelzelle verkapselt sind. Die Aggregate sollten vollständig in der Matrix eingeschlossen und homogen verteilt sein, um einen besseren Nährstofftransport zu ermöglichen, wie hier zu sehen. Beachten Sie, dass das Vernetzungsgel durchgehend fest ist und die Form des Gefäßes annimmt, in dem die Reaktion durchgeführt wurde.

In dieser Abbildung sind repräsentative fluoreszierende Hypoxie-Signale in aggregierten mindestens sechs Zellen in einem PEG DM-Hydrogel zu sehen, die verkapselt und dann 44 Stunden lang bei 20 % Sauerstoff inkubiert wurden. Die links abgebildeten Zellen zeigen keine Hypoxie-Signalgebung, während Zellen, die verkapselt wurden, 44 Stunden lang in 2 % Sauerstoff inkubiert wurden. Wie auf dem rechten Display abgebildet, kann eine klare ubiquitäre Signalhypoxie auch in anderen Zelltypen verfolgt werden.

Diese Abbildung zeigt eine repräsentative hypoxische Signaltransduktion in verkapselten mesenchymalen Stammzellaggregaten. Wie in der Abbildung ganz links zu sehen, ist das Fluoreszenzsignal nach 12 Stunden bei 2 % Sauerstoff nicht nachweisbar, dann ist es, wie in der mittleren Abbildung zu sehen, nach 24 Stunden und 2 % Sauerstoff deutlicher. Und schließlich, wie rechts zu sehen, wird nach 96 Stunden und 2%Sauerstoff nach diesem Verfahren stark exprimiert.

Andere Methoden wie Eliza, die Analyse sekretierter Proteine und Zellviabilitätsassays können durchgeführt werden, um die hypoxische Signalübertragung mit dem Zellphänotyp zu korrelieren. Mit dieser Entwicklung könnte diese Technik Forschern in den Bereichen Tissue Engineering und zellbasierte therapeutische Verabreichung den Weg ebnen, um die Überlebensfunktion und Differenzierung von Zellen in Gerüsten und Verkapselungsmaterialien zu erforschen.