Räumlich-zeitliche Manipulation kleiner GTPase-Aktivität in subzellulären Ebene und auf Zeitskala von Sekunden in lebenden Zellen

Dieses Video zeigt eine Methode, bei der UV-Licht verwendet wird, um die Aktivität eines Proteins an der Plasmamembran zu manipulieren. Zu diesem Zweck werden Zellen mit dem membranverankerten FRB-Protein und dem FK BP-fusionierten Protein von Interesse transfiziert. Dem Medium wird ein in einem Fotokäfig gehaltenes Rapamycin-Derivat zugesetzt.

Bei der Bildgebung lebender Zellen wird dann UV-Licht auf eine bestimmte Region der Zelle aufgebracht. Der Linker zwischen Rapamycin und Biotin wird gespalten und setzt den chemischen Dimerizer frei, und sein Nebenprodukt, der freigesetzte Dimerizer, diffundiert in die Zellen und induziert die Dimerisierung zwischen dem FKBP-markierten Protein von Interesse und dem in der Plasmamembran verankerten FRB in der bestrahlten Region. Ohne die UV-Strahlung assoziieren sich FKBP und FRB nicht und erzeugen daher keine Wirkung.

Die Analyse der Daten zeigt eine hochgradig lokalisierte Rekrutierung des FKBP-fusionierten Proteins von Interesse aufgrund seiner physiologischen Wirkung. Der Vorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Pharmakologie und dem genetischen Ansatz ist die Kombination aus Wirkungsgeschwindigkeit, Zielspezifität und räumlicher Auflösung. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Krebsmetastasierungen und sind eine Folge der Migration von Krebszellen.

Daher kann die Manipulation der Aktivität der wichtigsten Migrationsfaktoren den genauen molekularen Mechanismus aufdecken, der für seine Behandlung und Heilung erforderlich ist. Das Verfahren wird von Chris Paul Meyer, einem Doktoranden, und Bob de Rose, einem Techniker aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie Folgendes in einem sterilen Mikrozentrifugenröhrchen kombinieren: Plasmid, DNA, membrangebundenes FRB, FLUORESZIEREND markiert FKBP, TIA one und deionisiertes Wasser, fügen Sie der Mischung und dem Wirbel einen Mikroliter ein paar Gene HD hinzu.

Inkubieren Sie das Röhrchen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Während der Inkubation geben Sie 50 Mikroliter Poly de Lycine in jede Vertiefung einer Glaskammer mit acht Vertiefungen und inkubieren Sie eine Minute lang, um die Oberfläche zu beschichten, dann aspirieren Sie die Lösung und waschen Sie die Mitte jeder Vertiefung mit 50 m deionisiertem Wasser. Das nächste Trypsin besteht zu 80 bis 85 % aus konfluenten NIH-Drei-T-Zellen.

Nachdem sich die Zellen abgelöst haben, fügen Sie 10 Milliliter DMEM mit 10 % FBS hinzu, übertragen Sie 375 Mikroliter der Suspension in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie drei Minuten lang bei 1.500 g. Nach dem Schleudern das Medium vorsichtig ansaugen. Fügen Sie 750 Mikroliter DMEM mit 10% FVS und Resus hinzu.

Suspendieren Sie das Pellet, indem Sie es mehrmals vorsichtig auf und ab pipettieren. Geben Sie schließlich die Zellsuspension in die Transfektionslösung und rühren Sie mit der Pipettenspitze vorsichtig um, indem Sie 250 Mikroliter der Zelltransfektionssuspension in jede Vertiefung der Kammer geben. Schieben und inkubieren Sie es.

37 Grad Celsius für 15 bis 18 Stunden. Zur Synthese von Rapamycin im Käfig wird ein Biotin-Addukt hergestellt. Beginnen Sie mit der Zubereitung einer 1-millimolaren Stammlösung von CRB in DMSO in einem sterilen Fuge-Röhrchen in einem separaten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, lösen Sie ein Milligramm Avadon in 250 Mikrolitern PBS auf.

Als nächstes konjugieren Sie den Käfigteil mit Rapamycin. 0,5 Mikroliter der CRB-Stammlösung zu gelöstem AVID in gemischter Mischung durch mehrmaliges Invertieren zugeben und dann 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Um CRB AVID in konjugierter Lösung zu erhalten, um ungebundene kleine Moleküle auszuschließen und CRBA zu reinigen, äquilibrieren Sie eine G 25-Größenausschlusssäule mit 300 Mikrolitern PBS.

Wiederholen Sie den Vorgang fünfmal, nachdem sich die Spalte äquilibriert hat. Laden Sie 125 Mikroliter CRBA-Lösung auf das Mittelbett der Säule. Schleudern Sie dann die Lösung zwei Minuten lang bei 800 g Bei Raumtemperatur sammeln Sie den Durchfluss in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen nach der Transfektion der Zellen.

Tauschen Sie das Medium gegen DMEM ohne FBS aus, um die Zellen 12 Stunden lang zu inkubieren. Nach der Inkubation das Medium vorsichtig ansaugen und 250 Mikroliter der vorbereiteten einmikromolaren CRBA-Lösung hinzufügen. Um die Proteindynamik in lebenden Zellen sichtbar zu machen, verwenden Sie ein konfokales Spinning-Disc-Mikroskop mit UV-Beleuchtung, um die Optik für UV-LED-Licht bei 365 Nanometern zu koppeln.

Mit Epi-Fluoreszenzlicht. Definieren Sie die Koordinaten und die Größe eines Beleuchtungspunkts, indem Sie eine Glasplatte verwenden, die mit Fluoreszenzfarbstoffen beschichtet ist, die durch UV-Licht angeregt werden. Dies ermöglicht eine Feinabstimmung des zu bestrahlenden Bereichs.

Platzieren Sie den Objektträger mit den Zellen mit einem 100-fach-Objektiv und Epi-Fluoreszenz auf dem Tisch. Bringen Sie die Zellen in den Fokus und finden Sie eine Zelle. Beginnen Sie für die Bildgebung mit der Bildgebung der Zellen, nachdem Sie die Hintergrundwerte der physiologischen Wirkung bestimmt haben.

Hierbei wird das Membran-Rumpfling gemessen: UV-Licht in einem ausgewählten Quadranten der Zelle bestrahlen, unkäfigförmig, also ursprüngliches Rapamycin in DMSO und dann in PBS auf eine Endkonzentration von 400 Nanomolaren auflösen. Geben Sie 100 Mikroliter der Lösung in die Bildgebungskammer, um globale Effekte zu induzieren. Nehmen Sie 20 Minuten lang alle 15 Sekunden Fluoreszenzbilder auf, um festzustellen, ob eine lokalisierte Aktivierung von RAC eine lokale Rüschenbildung induzieren kann.

NIH drei T-3-Zellen wurden mit dem YFP-markierten RAC-Aktivator FK bp, TIA one und LDR, einer Membran, transfiziert. Auf die FRB-lokalisierte Bestrahlung am Rand der Zelle, die durch den gelben Kreis gekennzeichnet ist, folgte eine globale Beleuchtung mit einer Quecksilberlampe für eine Sekunde ab 1063 Sekunden. Wie hier zu sehen ist, war zu Beginn so gut wie keine Membrankräuselung vorhanden.

Nach lokalisierter Beleuchtung wurde jedoch ein räumlich begrenztes Kräuseln nach globaler Beleuchtung und Zugabe von Rapamycin beobachtet, das eine Translokation von FK bp TIA one in die Plasmamembran verursacht. Die Zelle zeigte eine globale Rüschenbildung, was darauf hindeutet, dass die zuvor beobachtete lokale Rüschenbildung durch eine räumlich begrenzte Aktivierung des Racks verursacht wurde. Für eine quantitative Analyse wurden die Zielzellen in vier Quadranten eingeteilt und die Häufigkeit der Rüschenbildung in jedem Quadranten sowohl bei lokaler als auch nach globaler Stimulation bestimmt, wie in dieser Grafik zu sehen ist.

Keine der beobachteten Zellen zeigte eine Rüschenbildung mit CRBA ohne uve a-Strahlung oder lokaler uve, einer Strahlung mit oder ohne Aden im Bulk-Medium. Wenn jedoch CRBA hinzugefügt und UV-Bestrahlung durchgeführt wurde, wurde die Kräuselungsbildung bei etwa gleich viel beobachtet, etwa 90 % in allen Quadranten mit Globalstrahlung, wenn nur Quadrant eins bestrahlt wurde, die Häufigkeit der Kräuselungsbildung betrug 100 % im Vergleich zu 30 %25 % und 30 % in den Quadranten zwei bis vier. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das lokalisierte Entriegeln von Rapamycin genutzt werden kann, um hochgradig lokalisierte physiologische Effekte in einer einzelnen Zelle zu induzieren.

In diesem Fall Kräuselungen der Membran, die durch die Aktivierung des Racks verursacht werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine räumliche zeitliche Kontrolle der Aktivität kleiner g TPAs durch Licht erreichen können. Diese Methode könnte auf jeden physiologischen Prozess angewendet werden, der von der Translokation bestimmter Proteine zur Plasmamembran abhängt.

Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, Lösungen, Reagenzien und Zellen für jedes Verfahren neu vorzubereiten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit UV-Licht äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie eine UV-Brille immer getragen werden sollten.