Kombinatorische Synthese von und High-Throughput-Protein Release von Polymer Film-und Nanopartikel-Bibliotheken

Dieses Video beschreibt die kombinatorische Synthese von biologisch abbaubaren Polyanhydrid-Film- und Nanopartikel-Bibliotheken sowie die Hochdurchsatzdetektion der Proteinfreisetzung aus diesen Bibliotheken. Zunächst wird eine automatisierte Hochdurchsatz-Abscheidevorrichtung verwendet, um ein kompositionell vielfältiges Array von Monomeren in Glas-Küvetten abzuscheiden. Eine Polykondensationsreaktion wird bei 180 Grad Celsius und 0,3 Tor für 1,5 Stunden durchgeführt.

Diese Reaktionsbedingungen sind spezifisch für die Synthese des C-P-H-S-A-Polyanhydrid-Polymers. Mithilfe der automatisierten Applikationsvorrichtung werden das Lösungsmittel und alle Komponenten für die Einschließung in die Küvetten mit der Polymerbibliothek gegeben. Eine Beschallung kann durchgeführt werden, um eine vollständige Auflösung des Polymers und eine gleichmäßige Verteilung der zusätzlichen Komponenten sicherzustellen.

Anschließend wird das gelöste Polymer in ein Röhrchen mit Nichtlösungsmittel überführt, um durch Nanopräzipitation die Nanopartikel-Bibliothek herzustellen. Die Nanopartikel werden durch Vakuumtrocknung oder Filtration gewonnen und danach in eine modifizierte 96-Well-Freisetzungsschale überführt. Schließlich wird die mit Protein beladene Bibliothek unter physiologischen Bedingungen inkubiert, und die Proteinfreisetzungs-Kinetik wird mittels einer fluorimetrischen Detektionsmethode analysiert.

Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Kinetik der Proteinfreisetzung in Abhängigkeit von den Polymereigenschaften oder den Bedingungen des Freisetzungsmilieus zeigen. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes gegenüber anderen herkömmlichen Methoden, bei denen jeweils nur eine Probe bearbeitet wird, liegt darin, dass wir mehrere Proben gleichzeitig synthetisieren können. Diese Proben können anschließend hochdurchsatzfähig auf Wechselwirkungen zwischen Protein, Polymer, Zelle und Wirtspolymer untersucht werden.

Dies beschleunigt anschließend die rationale Gestaltung und Entwicklung dieser Biomaterialien für die Arzneimittelfreisetzung und das Gewebeengineering. Die Durchführung der Prozedur zeigt La Tricia Peterson, eine Postdoktorandin aus meinem Labor. In diesem Abschnitt des Videos wird ein Hyatt-Durchsatz-Depositionsgerät verwendet, um eine kompositionell variable Monomerbibliothek nach der Polymerisation abzuscheiden.

Dieses Gerät dient zur Herstellung einer kombinatorischen Bibliothek aus leeren oder proteinbeladenen Polymerfilmen oder -nanopartikeln. Die automatisierte Plattform besteht aus zwei programmierbaren Spritzenpumpen und drei linear bewegten Aktuatoren, die in Reihe mit einem Computer verbunden sind. Die LabVIEW-Software wird verwendet, um Befehle an die Spritzenpumpen und Aktuatoren zu senden.

10-cc-Gastdichtspritzen werden mit Metallkapillarrohren, die über Luer-Lock-Verbindungsstücke angeschlossen sind, in die Spritzenpumpen eingesetzt, um die Polymersuspensionen in Glas-Küvetten abzugeben. In dieser Demonstration wird Seic-Säure oder SA zusammen mit einem Sechs-Biss-para-oxy-hean oder CPH verwendet, um eine Bibliothek von Nanopartikeln herzustellen, die Texas-Red-markiertes Rinderserumalbumin einschließen. Die Anweisungen in diesem Video und den begleitenden Dokumenten können angepasst werden, um eine breite Palette von Polymerfilmen und Bibliotheken von Nanopartikeln herzustellen und zu testen.

Um die Bibliotheken herzustellen, lösen Sie zunächst jeden Monomer und Chloroform in einem Glasvial auf eine Endkonzentration von 25 Milligramm pro Milliliter. Danach füllen Sie jede Lösung in eine 10-cc-Gasspritze, indem Sie die Lösung durch das Luer-Lock-Ende der Spritze aufziehen. Entfernen Sie sämtliche Luftblasen.

Befestigen Sie anschließend die lösungsmittelbeständige Lock-Vorrichtung aus Edelstahl an der Kapillare am Ende der Spritze. Sichern Sie die Kapillaren in Klemmen und befestigen Sie diese an einem Stativ. Positionieren Sie dann die Enden beider Kapillaren in der Startvertiefung.

Für die Monomer-Abscheidung. Platzieren Sie die Spritzen auf den programmierbaren Spritzenpumpen und arretieren Sie sie in der LabView-Software in Position. Stellen Sie die linearen Stellantriebe in der Software auf die Ausgangsposition ein.

Starten Sie die automatisierte Deposition der SA- und CPH-Monomere in die Glasgefäße entlang der x-, y- und z-Achse. Aktuatoren positionieren die Kapillarröhrchen korrekt in jedes Q, prüfen dies und pumpen programmierte Volumina jedes Monomers hinein, wodurch eine kompositionell variable Monomerbibliothek entsteht. Nach der Monomerdepotion.

Überführen Sie die Monomerbibliothek in einen vorgeheizten Vakuumofen und inkubieren Sie sie bei 180 Grad Celsius und 0,3 Torr für 1,5 Stunden, um die Kondensationspolymerisation zu ermöglichen. Nach der Inkubation ist die Herstellung der Polymerbibliothek abgeschlossen. Anschließend werden proteinbeladene Polymer-Nanopartikel erzeugt.

Siehe das begleitende Protokoll zur Herstellung einer Bibliothek proteinbeladener Polymerfilme für die Herstellung einer Bibliothek proteinbeladener Nanopartikel. Fügen Sie in diesem Fall das Protein, Texas Red Rinderserumalbumin, dem geeigneten Lösungsmittel hinzu, das in der Lage sein sollte, die Polymerbibliothek zu lösen. Hier wird Methylenchlorid in einer Konzentration von zwei Milligramm pro Milliliter verwendet.

Füllen Sie die 10-cc-Spritze mit dem Texas-Red-BSA-haltigen Lösungsmittel und setzen Sie sie in die erste Spritzenpumpe ein. Setzen Sie anschließend eine saubere, leere 2-cc-Spritze in die zweite Spritzenpumpe ein, und platzieren Sie die Rohre, die 15 Milliliter eines Nichtlösungsmittels – in diesem Fall Pentan – enthalten, im Rohrhalter neben der Vial-Plattform. Starten Sie danach im Labor die automatisierte Ablagerung des Lösungsmittels, indem Sie in der Software das entsprechende Programm auswählen.

Nach Start des Programms wird das Lösungsmittel in die Küvetten mit der Polymerbibliothek gegeben, wodurch eine Polymerkonzentration von 20 Milligramm pro Milliliter entsteht. Sobald das gesamte Lösungsmittel zugegeben ist, sollte es eine bis fünf Minuten lang wirken, um das Polymer aufzulösen. Anschließend kann optional eine Vorgang zur Sicherstellung einer vollständigen Polymerauflösung und einer gleichmäßigen Proteindispersion durchgeführt werden.

Als Nächstes starten Sie das Probenübertragungsprogramm in LabView. Jede gelöste Polymerprobe der Bibliothek wird dann in die leere Spritze aufgezogen und in das entsprechende Röhrchen mit Nichtlösungsmittel im Probenträger abgegeben. Nachdem jede Probe übertragen wurde, gewinnen Sie die proteinbeladenen Nanopartikel zurück, indem Sie die Nanopartikelbibliothek in eine Vakuumkammer bei einem Vakuum von 10 Millimeter Quecksilber oder mithilfe von Vakuumfiltration bringen, bis das Lösungsmittel entfernt ist.

Um die Freisetzung der verkapselten BSA zu untersuchen, beginnen Sie mit einer tiefen 96er-Wel-Platte aus Polypropylen, bei der die oberen halben Zoll der Wand jedes Wells jeder benachbarten Spalte der Platte entfernt wurden. Das Entfernen des oberen Teils jedes Wells zwischen den Spalten A und B, C und D, E und F sowie G und H ermöglicht einen Flüssigkeitsfluss zwischen jedem Paar benachbarter Wells, wenn diese bis zur vollen Transfermenge gefüllt sind. Geben Sie Texas-rot-markierte BSA-Standards im Bereich von 1000 bis 10 Mikrogramm pro Milliliter in die tiefe 96er-Wel-Platte.

Diese werden zur Berechnung der Proteinmenge verwendet und berücksichtigen zudem die Fluorochrom-Quenchung. Rekonstituieren Sie die gewünschte Masse an Nanopartikeln in PBS-Puffer und sonifizieren Sie, um die Partikel gleichmäßig zu dispergieren. Überführen Sie anschließend die Nanopartikel-Bibliothek in die tiefe 96-Well-Platte und warten Sie, bis sich die Proben am Boden der Platte abgesetzt haben. Füllen Sie danach mit einer Pipette langsam alle angrenzenden Wells mit PBS-Puffer bis zu einem Viertel Zoll unter den Rand der Wells auf.

Es sollte genügend Puffer in den angrenzenden Vertiefungen vorhanden sein, damit dieser frei zwischen den Vertiefungen fließen kann. Verschließen Sie anschließend die Freisetzungsplatte mit dem Deckel und stellen Sie sie unter Rühren bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie während des gesamten Experiments zu bestimmten inkrementellen Zeitpunkten einen 9.400 Typhoon-Flachbett-Fluoreszenzscanner, um die Platte mit den entsprechenden Anregungs-, Laser- und Emissionsfiltern zu scannen.

Nach dem Scannen verwenden Sie Bildquantifizierungssoftware, um die Menge des freigesetzten fluorochrommarkierten Proteins in jeder Probe zu bestimmen. In diesem Fall wurde Texas Red-markiertes BSA in einer Bibliothek polymerer Nanopartikel eingeschlossen, die aus SA- und CPH-Monomeren synthetisiert wurden, wie in diesem Video beschrieben, um die Proteinfreisetzungs-Kinetik in Abhängigkeit von der Polymerchemie zu untersuchen. Die mit Protein beladenen Nanopartikel wurden einen Monat lang bei 37 Grad Celsius inkubiert, wobei fluoreszierende Scans zu zeitlich gestaffelten Zeitpunkten zur Quantifizierung der Proteinfreisetzung aufgenommen wurden.

Wie hier gezeigt, wurde diese Hochdurchsatzmethode verwendet, um die Freisetzungs­kinetik von Texas Red-markiertem BSA aus einer Bibliothek von A-C-P-H-S-A-Polyanhydrid-Nanopartikeln zu bestimmen. Es wurden chemieabhängige Trends beobachtet, wobei die Freisetzungs­raten mit zunehmender Filmchemie nach Sarich anstiegen. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung standardmäßiger Proteinquantifizierungsassays erhalten.

In einem separaten Experiment wurde die Freisetzung von Texas Red BSA aus CPT CPH Poly-Anhydrid-Filmbibliotheken untersucht, wobei hier eine nahezu nullte-Ordnung-Freisetzungs­kinetik beobachtet wurde. Filme mit hohem cpeg-Gehalt setzten das Protein am schnellsten frei, was potenzielle Anwendungen im medizinischen Bereich als biologisch abbaubare Arzneimittelabgabesysteme nahelegt. Diese Ergebnisse zeigen, dass das gewünschte Freisetzungsprofil eines therapeutischen Wirkstoffs oder eines Impfantigens durch Änderung der Polymerchemie gesteuert werden kann. Im Anschluss an dieses Verfahren wurden weitere kombinatorische Methoden entwickelt, um Bereiche wie Proteinstabilität, zelluläre Toxizität, zelluläre Aktivierung und die In-vivo-Biodistribution zu untersuchen.

Diese Aspekte sind wichtig für die gezielte Entwicklung von Biomaterialien für die Arzneimittelfreisetzung und das Gewebeengineering. Vergessen Sie nicht, die richtige PSA zu tragen und während des gesamten Protokolls sichere Laborverfahren anzuwenden.