Kombinatorische Synthese von und High-Throughput-Protein Release von Polymer Film-und Nanopartikel-Bibliotheken

Dieses Video beschreibt die kombinatorische Synthese von biologisch abbaubaren Polyanhydrid-Film- und Nanopartikelbibliotheken sowie die Hochdurchsatzdetektion der Proteinfreisetzung aus diesen Bibliotheken. Zunächst eine automatisierte Abscheidungsapparatur mit hohem Durchsatz, die zur Abscheidung eines in der Zusammensetzung unterschiedlichen Arrays von Monomeren in Glasküvetten verwendet wird. Eine Polykondensationsreaktion wird bei 180 Grad Celsius und 0,3 Tor für 1,5 Stunden durchgeführt.

Diese Reaktionsbedingungen sind spezifisch für die Synthese von C-P-H-S-A-Polyanhydrid-Polymeren. Unter Verwendung der automatisierten Abscheidungsvorrichtung werden das Lösungsmittel und alle Komponenten für die Verkapselung in die Küvetten abgeschieden, die die Polymerbibliothek enthalten. Eine Beschallung kann durchgeführt werden, um eine vollständige Auflösung des Polymers und eine gleichmäßige Verteilung der zusätzlichen Komponenten zu gewährleisten.

Dann wird das gelöste Polymer in ein Röhrchen mit Nichtlösungsmittel überführt, um die Nanopartikelbibliothek durch Nanofällung herzustellen. Die Nanopartikel werden durch Vakuumtrocknung oder Filtration zurückgewonnen und dann auf eine modifizierte 96-Well-Platte übertragen. Schließlich wird die proteinbeladene Bibliothek unter physiologischen Bedingungen inkubiert und die Kinetik der Proteinfreisetzung mit Hilfe einer Fluoreszenzraumdetektionsmethode bewertet.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass die Freisetzungskinetik von Proteinen in Abhängigkeit von den Polymereigenschaften oder den Bedingungen der Freisetzungsumgebung abhängt. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes gegenüber anderen herkömmlichen Sample-by-the-Time-Techniken besteht darin, dass wir in der Lage sind, mehrere Samples gleichzeitig zu synthetisieren. Diese Proben können dann im Hochdurchsatz auf Protein-, Polymer-, Zellpolymer- oder Wirtspolymer-Wechselwirkungen untersucht werden.

Dies beschleunigt dann das rationale Design und die Entwicklung dieser Biomaterialien für die Wirkstoffverabreichung und das Tissue Engineering. Die Demonstration des Verfahrens wird von La Tricia Peterson durchgeführt, einer Post-OP aus meinem Labor. In diesem Abschnitt des Videos wird eine Hyatt-Durchsatzabscheidungsvorrichtung verwendet, um nach der Polymersynthese eine in der Zusammensetzung variante Monomerbibliothek abzuscheiden.

Diese Vorrichtung wird verwendet, um eine kombinatorische Bibliothek von blinden oder proteinbeladenen Polymerfilmen oder Nanopartikeln herzustellen. Die automatisierte Plattform besteht aus zwei programmierbaren Spritzenpumpen und drei Linearantrieben, die in Reihe mit einem Computer auf dem Computer verbunden sind. Die LabVIEW-Software wird verwendet, um Befehle an die Spritzenpumpen und Aktuatoren zu leiten.

10 cc Gast Tight Spritzen werden mit Metallkapillarrohren in die Spritzenpumpen geladen, die durch Köderverschlussarmaturen verbunden sind, die die Polymerlösungen in Glasküvetten abgeben. In dieser Demonstration wird Seeinsäure oder SA mit einem sechs Biss Paraoxy Heane oder CPH verwendet, um eine Bibliothek von Nanopartikeln herzustellen, die Texas Red Boan Serumalbumin verkapseln. Die Anweisungen in diesem Video und die Begleitdokumente können angepasst werden, um eine breite Palette von Polymerfilm- und Nanopartikelbibliotheken herzustellen und zu testen.

Um die Bibliotheken zu synthetisieren, lösen Sie zunächst jedes Monomer und Chloroform in einer Endkonzentration von 25 Milligramm pro Milliliter in einem Glasfläschchen auf. Laden Sie anschließend jede Lösung in eine 10-cm³-Spritze, indem Sie die Lösung durch das Köderverschlussende der Spritze aspirieren. Entfernen Sie alle Luftblasen.

Befestigen Sie als Nächstes das lösungsmittelbeständige Köderschloss aus Edelstahl am Ende der Spritze. Kapillarrohre in Klammern fixieren, auf einem Ringständer befestigen. Positionieren Sie dann das Ende der beiden Kapillarröhrchen in den Startvete.

Für die Monomerabscheidung. Setzen Sie die Spritzen auf die programmierbaren Spritzenpumpen und verriegeln Sie sie in der Lab-View-Software. Stellen Sie die Linearantriebe in der Software in die Ausgangsposition.

Initiieren Sie die automatische Abscheidung der SA- und CPH-Monomere in die Glasküvetten auf der x-, y- und z-Achse. Aktuatoren positionieren die Kapillarröhrchen richtig in jedem Q, prüfen und pumpen programmierte Volumina jedes Monomers hinein, wodurch eine in der Zusammensetzung variante Monomerbibliothek entsteht. Nach der Monomerabscheidung.

Übertragen Sie die Monomerbibliothek in einen vorgeheizten Vakuumschrank und inkubieren Sie sie 1,5 Stunden lang bei 180 Grad Celsius und 0,3 Grad, um die Kondensationspolymerisation zu ermöglichen. Nach der Inkubation ist die Herstellung der Polymerbibliothek abgeschlossen. Als nächstes werden proteinbeladene Polymer-Nanopartikel erzeugt.

Siehe das begleitende Protokoll für die Herstellung einer proteinbeladenen Polymerfilmbibliothek zur Herstellung einer proteinbeladenen Nanopartikelbibliothek. Fügen Sie das Protein in diesem Fall, Texas Red Bovine Serum Albumin, dem entsprechenden Lösungsmittel hinzu, das in der Lage sein sollte, die Polymerbibliothek aufzulösen. Hier wird Methylenchlorid in einer Konzentration von zwei Milligramm pro Milliliter verwendet.

Füllen Sie die 10-cm³-Spritze mit Texas Red BSA-haltigem Lösungsmittel und geben Sie es in die erste Spritzenpumpe. Legen Sie dann eine saubere, leere Spritze mit zwei cm³ in die zweite Spritzenpumpe. Platzieren Sie Röhrchen mit 15 Millilitern eines Nichtlösungsmittels, in diesem Fall Pentan, in den Röhrchenhalter neben der Fläschchenplattform. Leiten Sie anschließend im Labor die Software an, um den automatisierten Lösungsmittelabscheidungsprozess zu starten, indem Sie das Programm auswählen.

Nach dem Start des Programms wird das Lösungsmittel in die Küvetten abgeschieden, die die Polymerbibliothek enthalten, was zu einer Polymerkonzentration von 20 Milligramm pro Milliliter führt. Wenn sich das gesamte Lösungsmittel abgelagert hat, lassen Sie es das Polymer ein bis fünf Minuten lang auflösen. Anschließend wird eine optionale Syndizierung durchgeführt, um eine vollständige Polymerauflösung und eine gleichmäßige Proteinverteilung zu gewährleisten.

Starten Sie als Nächstes das Probentransferprogramm in der Lab-Ansicht. Jede gelöste Polymerprobe in der Bibliothek wird dann in die leere Spritze entnommen und in das entsprechende Röhrchen mit Nichtlösungsmittel im Probenhalter abgegeben. Sobald jede Probe übertragen wurde, gewinnen Sie die proteinbeladenen Nanopartikel zurück, indem Sie die Nanopartikelbibliothek in eine Vakuumkammer bei 10 Millimeter Quecksilbervakuum legen oder indem Sie eine Vakuumfiltration verwenden, bis das Lösungsmittel entfernt wird.

Um die Freisetzung von verkapseltem BSA zu untersuchen, beginnen Sie mit einer tiefen 96-Schweiß-Polypropylenplatte, die modifiziert wurde, indem der obere halbe Zoll jeder Well-Wand jeder anderen angrenzenden Säule in der Platte entfernt wurde. Das Entfernen der Oberseite jeder Vertiefung zwischen den Säulen A und B, C sowie DENF und GNH ermöglicht den Flüssigkeitsfluss zwischen jedem Paar benachbarter Vertiefungen, wenn sie bis zum vollen Volumentransfer gefüllt sind. Texas Red BSA-Standards reichen von 1000 bis 10 Mikrogramm pro Milliliter in die tiefe 96-Well-Platte.

Diese werden zur Berechnung der Proteinmenge verwendet und berücksichtigen auch die Fluorochrom-Quenchung, die Rekonstitution der gewünschten Masse an Nanopartikeln in PBS-Puffer und die anschließende Beschallung, um die Partikel gleichmäßig zu dispergieren. Übertragen Sie anschließend die Nanopartikelbibliothek in die tiefe 96-Well-Platte und warten Sie, bis sich die Proben am Boden der Well-Platte abgesetzt haben. Füllen Sie anschließend mit einer Pipette langsam alle angrenzenden Vertiefungen mit PBS-Puffer bis zu einem Viertel Zoll von der Oberseite der Vertiefung entfernt.

In den angrenzenden Vertiefungen sollte genügend Puffer vorhanden sein, damit er frei zwischen den Vertiefungen fließen kann. Als nächstes verschließen Sie die Auslöseplatte mit dem Deckel und stellen sie bei 37 Grad Celsius unter Rühren. Verwenden Sie für die Dauer des Experiments zu inkrementellen Zeitpunkten einen 9.400 Typhoon-Flachbett-Fluoreszenzscanner, um die Platte mit den entsprechenden Anregungs-, Laser- und Emissionsfiltern zu scannen.

Verwenden Sie nach dem Scannen eine Bildquantitätssoftware, um die Menge des freigesetzten Fluorochrom-konjugierten Proteins in jeder Freisetzung zu quantifizieren. Nun, Texas Red BSA wurde in einer Polymer-Nanopartikel-Bibliothek eingekapselt, die aus SA- und CPH-Monomeren synthetisiert wurde, wie in diesem Video beschrieben, um die Kinetik der Proteinfreisetzung in Abhängigkeit von der Polymerchemie zu bestimmen. Die proteinbeladenen Nanopartikel wurden einen Monat lang bei 37 Grad Celsius inkubiert, wobei Fluoreszenzscans zu inkrementellen Zeitpunkten für die Quantifizierung der Proteinfreisetzung durchgeführt wurden.

Wie hier gezeigt, wurde diese Hydro-Durchsatz-Methode verwendet, um die Texas Red BSA-Freisetzungskinetik aus der A-C-P-H-S-A-Polyanhydrid-Nanopartikel-Bibliothek zu bestimmen. Chemieabhängige Trends wurden mit zunehmenden Freisetzungsraten aus der Arich-Filmchemie beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Verwendung von Standard-Proteinquantifizierungsassays erzielt.

In einem separaten Experiment wurde die Texas Red BSA-Freisetzung aus CPT CPH Poly Anhydride Film Libraries untersucht, wie hier gezeigt, wobei Freisetzungskinetiken nahe null Ordnung beobachtet wurden, wobei cpeg-reiche Filme das Protein am schnellsten freisetzten, mit potenziellen Anwendungen im medizinischen Bereich als biologisch abbaubare Arzneimittelverabreichungsgeräte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das gewünschte Freisetzungsprofil eines therapeutischen Medikaments oder eines Impfstoffantigens durch eine Änderung der Polymerchemie gesteuert werden kann. Im Anschluss an dieses Verfahren wurden weitere kombinatorische Methoden entwickelt, um Bereiche wie Proteinstabilität, zelluläre Toxizität, zelluläre Aktivierung und InVivo-Bioverteilung zu untersuchen.

Diese Aspekte sind wichtig für das rationale Design von Biomaterialien für die Wirkstoffverabreichung und das Tissue Engineering. Vergessen Sie nicht, während des gesamten Protokolls die richtige PSA zu tragen und sichere Laborverfahren zu praktizieren.