Name: Kombinatorische Synthese von und High-Throughput-Protein Release von Polymer Film-und Nanopartikel-Bibliotheken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Erfahren Sie die kombinatorische Synthese biologisch abbaubarer Polyanhydrid-Filme und Nanopartikel-Bibliotheken mit Hochdurchsatz-Methoden zur Proteinfreisetzung. Diese Technik ermöglicht die rationelle Entwicklung von Biomaterialien für die Arzneimittelfreigabe.

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Die Autoren erkennen die ONR-MURI Award (NN00014-06-1-1176) und die US Army Medical Research und Materiel Command (Grant No W81XWH-10-1-0806) für finanzielle Unterstützung. Dieses Material basiert auf der Arbeit von der National Science Foundation unter Grant No EWG 0552584 und 0851519 unterstützt werden.

Ein. Kombinatorische Polymer Library Synthesis (Wechselnde in Polymerchemie) - siehe Abbildung 1 für Robotic-Setup <ol><li> Aufzulösen jedes Monomer in dem geeigneten Lösungsmittel (Konzentration = 25 mg / ml) und jeweils in eine geladen 10cc gasdichte Spritze. </li><li> Anbringen der lösemittelbeständigen Köder Sperre Kapillarröhren an das Ende jeder Spritze. </li><li> Legen Sie die Spritzen auf den Spritzenpumpen (New Era Programmable Spritzenpumpen) und einrasten. </li><li> Festlegen der Hubantriebe (Zaber) in die Ausgangsposition. </li><li> Verwendung Ring Stativklemmen Positionieren des Endes der beiden Kapillarröhrchen in die Ausgangsstellung Fläschchens / Vertiefung für Monomer Abscheidung. </li><li> Initiieren des LabVIEW Programm, das Pumpen variablen Volumina jedes Monomers in jede Vertiefung je nach der gewünschten Copolymerzusammensetzung. Dies wird in dem Programm durch Anweisen der Z-Achsen-Aktuator, um die Kapillarröhren in das Fläschchen / Vertiefung und dann jede Pumpe zu verringern, um das gewünschte Volumen abzugeben erreicht. Next, instruiert das Programm die Z-Stellglied in seine Ausgangsstellung und die X-und Y-Aktuatoren zurückzukehren, um zu der Position des nächsten Fläschchens / Vertiefung bewegen. Dies erfolgt, bis jede Vertiefung der gewünschte Volumen der Monomer abgeschieden hat hinein durchgeführt. </li><li> Nach Monomer Abscheidung wird der Multi-Well-oder Mehrglasmethode Monomer Bibliothek, um eine vorgewärmte Vakuumofen überführt und unter Vakuum für die Dauer der Kondensationspolymerisationsreaktion. Für CPH: SA-Synthese wird die Reaktion bei 180 ° C, 0,3 Torr für 1,5 Stunden, aber diese Reaktionsbedingungen wird in den diversen Polymer-Systeme variieren. </li></ol> 2. Kombinatorische Blank und Protein-beladenen Polymer Nanopartikel und Film Library Fabrication - siehe Abbildung 1 für Robotic-Setup <ol><li> Die Spritze in der ersten programmierbaren Spritzenpumpe mit einem Lösungsmittel gefüllt (freilassen library) oder ein Lösungsmittel mit darin dispergierten Protein (Protein-beladenen Bibliothek), während die Spritze in der zweiten SpritzePumpe ist leer. Rohre zur Herstellung Nanopartikel in der benachbarten Probenhalter mit dem Nicht-Lösungsmittel gefüllt (Verhältnis von Lösungsmittel zu Nichtlösungsmittel 1 bis 100). Für Filmherstellung eine leere Multiwellplatte wird anstelle der Rohre in dem benachbarten Probenhalter verwendet. </li><li> Verwendung des LabVIEW Programms wird das Lösungsmittel in alle Polymer Vials / Vertiefungen der Bibliothek (Konzentration = 20 mg / ml) abgeschieden und inkubiert für 1-5 min. Eine optionale Beschallungsschritt (30 s bei 40 Hz) eingeführt werden, um vollständige Polymerauflösung gewährleisten. </li><li> Anschließend wird durch Einleiten einer separaten LabVIEW-Programm wird die Probe in die leere Spritze zurückgezogen und hinterlegt in seinem entsprechenden Röhre des Nichtlösungsmittels (Nanopartikel) oder leeren Vertiefung (Filme) in der benachbarten Probenhalter. </li><li> Dieser Vorgang wird für jede Zusammensetzung des diskreten Polymer-Bibliothek durchgeführt wird. </li><li> Das Nanopartikel oder Film-Bibliothek wird dann in einer Vakuumkammer für Lösungsmittel und Nicht-Lösungsmittel-Entfernung (das Nanopartikel libra platziertry können auch wieder mittels Vakuumfiltration werden). </li></ol> 3. High-throughput Protein Freisetzungskinetik <ol><li> Zur Untersuchung mit hohem Durchsatz Protein Freisetzungskinetik von einem Polymer Bibliothek, eine 96 tief welled (2 ml / Vertiefung) wird Polypropylen Platte modifiziert, dass die oberen 1/3 von der Bohrlochwand in benachbarten Säulen (Bsp.: A und B, C und D, E und F, G und H) wird entfernt, um die Vertiefungen angrenzen. Die Protein-beladenen Folien müssen hergestellt werden oder die Nanopartikel in diese Platte überführt, um mit hohem Durchsatz Freisetzungskinetik Versuche durchzuführen. Protein-beladenen Nanopartikel oder Filmproben muss nur in einer Vertiefung der angrenzenden Säulen (A, C, E, und G ex) abgegeben werden. Siehe Abbildung 4 für Details. </li><li> Nach der Übertragung der Nanopartikel an die 96 tief welled Ausrückplatte werden die Partikel absetzen gelassen. PBS-Puffer (0,1 mM, pH 7,4) wird langsam zu jedem Probenbehälter (Spalten A, C, E und G) zugegeben und dann zu jedem benachbarten Schacht (Spalten B, D, F und H), bis die Vertiefungen gefüllt sind, und der Puffer ist frei fließend zwischen benachbarten Vertiefungen. Für Nanopartikel, muss dieser Prozess mit besonderer Vorsicht durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Partikel bleiben an der Unterseite der Probe gut (Spalten A, C, E und G) und nicht in den angrenzenden Release übertragen auch (Spalten B, D, F und H). In einigen Fällen wird Zentrifugieren erforderlich ist, um die Nanopartikel zu lokalisieren Proben am Boden des Probenbehälters (Spalten A, C, E und G). </li><li> Als nächstes wird die Auslöseplatte mit einem Deckel verschlossen und bei der gewünschten Temperatur (dh 37 ° C) unter Rühren für die Dauer des Experiments. </li><li> Bei inkrementellen Zeitpunkten (dh 0,04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24 und 30 Tage) die Menge des freigesetzten Fluorochrom-konjugiertem Protein wird quantifiziert unter Verwendung eines 9400 Typhoon Flachbett Fluorescent Scanner ( GE Healthcare). Die Freigabeplatte auf dem Scanner platziert ist, abgetastet mit der entsprechenden Laser-Anregung und Emission filters, und die Fluoreszenzintensität des freigesetzten Proteins in der Freigabestellung Vertiefungen (Spalten B, D, F und H) quantifiziert wird (Bild Quant). Es wird vorgeschlagen, dass Protein Standards bekannter Konzentration in der Well-Platte zum Berechnen Proteinmenge und Bilanzierung von Fluorochrom Abschrecken enthalten sein. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Bei der Herstellung der Polymer-Bibliothek, hat die Charakterisierung wurden mit 1 H-NMR, GPC und FTIR durchgeführt, um zu überprüfen diese kombinatorische Methode 1,7,8,11. Molekulargewichte reichen von 10.000-20.000 g / mol, Polydispersität Index reicht von 1,5 bis 3,0, und die chemische Zusammensetzung hat sich gezeigt, um genau zu sein und in Übereinstimmung mit konventionellen Methoden der Polyanhydrid Synthese 12-15. Ebenso zeigte SEM-Bilder der Nanopartikel Bibliotheken ähnliche Oberflächen-Morphologie, Größe und Größenverteilung als die von herkömmlich hergestellten Nanopartikeln 2. Protein Freisetzung kinetischcs aus Polyanhydrid Nanopartikel oder Filme erfolgt in einer modifizierten Lochplatte durchgeführt, wie zuvor beschrieben ein. Die Ergebnisse zeigten eine ungefähre Freisetzung nullter Ordnung mit oder ohne Burst abhängig Protein Be-und Polymerchemie (Abbildungen 2 und 3) 1,12,14,16. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig1.jpg" /> Abbildung 1. Kombinatorische Polymerfilm und Nanopartikel Vorrichtung zum Herstellen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig2.jpg" /> Abbildung 2 Hochdurchsatzforschung Freisetzung von Texas Red Rinderserumalbumin (TRBSA) von einer CPH:. SA Polymernanopartikel Bibliothek. SA-reichen Polymer-Verbindungen freisetzen gekapselt TRBSA am schnellsten, während CPH-reiche Polymer-Chemie die langsamste freizugeben. Fehlerbalken stellen Standardabweichungention und n = 4 ist. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Petersen et. al. ein. Copyright 2010 American Chemical Society. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig3.jpg" /> Abbildung 3 Hochdurchsatzforschung Freisetzung von Texas Red Rinderserumalbumin (TRBSA) von einer CPTEG:. CPH Polymerfilm Bibliothek. CPTEG-reichen Polymer-Verbindungen freisetzen gekapselt TRBSA am schnellsten, während CPH-reiche Polymer-Chemie die langsamste freizugeben. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung und n = 3 ist. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig4.jpg" /> Abbildung 4. Das Bild zeigt zwei benachbarte Brunnen &quot;vor&quot; und &quot;nach&quot; Änderung in der 96 tief welled Polypropylen-Platte. Das &quot;nach&quot; Modifikation Bild rechts zeigt auch die Zugabe eines Polymerfilms (unten links Vertiefung) mit einem gekapselten Fluoreszenzmolekülwobei zwischen den beiden Bohrungen in einer Pufferlösung gelöst. Das freigesetzte fluoreszierende Molekül wird dann in die richtige gut detektiert.

<ol><li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+high-throughput+method+to+study+in+vitro+protein+release+from+polymer+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres.</a> J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li>
<li>Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+synthesis+and+high-throughput+dissolution+testing+of+biodegradable+polyanhydride+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers.</a> J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+evaluation+of+in+vivo+biodistribution+of+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles.</a> Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Petersen, L. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+design+of+biomaterials+for+drug+delivery%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).</li>
<li>Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydride+films+promote+neural+stem+cell+adhesion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation.</a> Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).</li>
<li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+protein+stability+in+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles.</a> Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li>
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<li>Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+factors+controlling+protein+release+from+combinatorial+biomaterial+libraries+via+hybrid+data+mining+methods%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods.</a> ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).</li>
<li>Adler, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cell-based+screening+of+biodegradable+polyanhydride+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High+Through.+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries.</a> Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).</li>
<li>Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation%2C+stabilization%2C+and+release+of+BSA-FITC+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres.</a> J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).</li>
<li>Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability+in+the+presence+of+polymer+degradation+products%3A+consequences+for+controlled+release+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations.</a> Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).</li>
<li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
<li>Carrillo-Conde, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+into+amphiphilic+polyanhydride+microparticles+stabilizes+Yersinia+pestis+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens.</a> Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Kenntnis der erforderlichen Synthesebedingungen und den Glasübergangstemperaturen (T g s) der Polymeren synthetisiert sind für Bibliothek Herstellung. Falls die T g s unter Raumtemperatur, so kann der Nanopartikel Herstellungsschritt, müssen unter einer kontrollierten Temperatur-Umgebung unterhalb der T g des Polymers durchgeführt werden. Darüber hinaus sollte mit Vorsicht getroffen werden, um sicherzustellen, dass alle Geräte, die in Kontakt mit hohen Temperaturen und die Lösungsmittel ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Motorisierte XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm Stellweg je Achse </td><td> Zaber Technologies </td><td> T-XYZ-LSM050A-KT04 </td></tr><tr><td> NE-1000 Einzel-Spritzenpumpe </td><td> New Era Pump Systems </td><td> NE-1000 </td></tr><tr><td> Pyrex * Vista * Randlose Reusable Glass Kultur Tubes </td><td> Corning </td><td> 07-250-125 </td></tr><tr><td> Glasküvetten </td><td> Scientific Strategies </td><td> G102 </td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> 776671-35 </td></tr><tr><td> SGE Tight Gas-Spritzen, Luer Loc </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 509507 </td></tr><tr><td> U96 DeepWell Platten 1,3 ml &amp; 2,0 ml </td><td> Thermo Scientific: Nunc </td><td> 278743 </td></tr><tr><td> Nun cap-Matten </td><td> Thermo Scientific: Nunc </td><td> 276000 </td></tr><tr><td> Typhoon 9400 </td><td> GE Healthcare </td><td> 63-0055-79 </td></tr><tr><td> Whatman Grade 50 Circles 90 mm </td><td> Whatman </td><td> 1450-090 </td></tr></tbody></table>

kombinatorische synthese von und high-throughput-protein release von polymer film-und nanopartikel-bibliotheken

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydride sind eine Klasse von Biomaterialien mit exzellenten Biokompatibilität Droge Lieferfähigkeit. Während sie wurden ausgiebig mit der studierten herkömmlichen Ein-Stichproben-at-a-time-Synthese-Technologien, eine neuere High-Throughput-Ansatz entwickelt ermöglicht die Synthese und Erprobung von großen Bibliotheken Polyanhydride 1. Dies erleichtert eine effizientere Optimierung und Design-Prozess dieser Biomaterialien für Drogen-und Impfstoff-Delivery-Anwendungen. Das Verfahren in dieser Arbeit beschreibt die kombinatorische Synthese von biologisch abbaubaren Polyanhydrid Film-und Nanopartikel-Bibliotheken und die Hochdurchsatz-Detektion von Protein-Freisetzung aus diesen Bibliotheken. In diesem Roboter betriebene Verfahren (Abbildung 1) werden lineare Aktuatoren und Spritzenpumpen von LabVIEW, die eine Freisprecheinrichtung automatisierten Protokoll ermöglicht, wodurch Anwenderfehler gesteuert. Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren die rasche Herstellung von Mikro-Maßstab Polymer Bibliotheken, rotenucing die Chargengröße während was zur Schaffung multivariante Polymersystemen. Diese kombinatorische Ansatz zur Synthese von Polymeren ermöglicht die Synthese von bis zu 15 verschiedene Polymere in eine äquivalente Menge an Zeit, die für ein Polymer konventionell synthetisieren würde. Darüber hinaus kann die kombinatorische Bibliothek in freilassen Polymer oder Protein-beladenen Geometrien einschließlich Filmen oder Nanopartikel beim Auflösen des Polymers Bibliothek in einem Lösungsmittel und Ausfällen in einem Nichtlöser (z. Nanopartikel) oder durch Vakuumtrocknung (für Folien) hergestellt werden. Nach dem Laden eines Fluorochrom-konjugierten Proteins in die Polymer-Bibliotheken kann Protein Freisetzungskinetik bei hohem Durchsatz untersucht werden mit Hilfe eines Fluoreszenz-basierten Detektionsverfahren (Abbildungen 2 und 3), wie zuvor beschrieben ein. Diese kombinatorische Plattform wurde mit konventionellen Methoden validiert wurden 2 und das Polyanhydrid Film-und Nanopartikel-Bibliotheken wurden mit geprägt <sup&gt; 1 H-NMR-und FTIR. Die Bibliotheken haben für Protein Freisetzungskinetik, Stabilität und Antigenität durchsucht, in vitro zelluläre Toxizität, Zytokin-Produktion, Oberflächenmarker Ausdruck, Adhäsion, Proliferation und Differenzierung, und in vivo Bioverteilung und Mucoadhäsion 1-11. Die kombinatorischen Methode entwickelt hierin ermöglicht Hochdurchsatz-Polymer-Synthese und Herstellung von Protein-beladenen Nanopartikel und Filmbibliotheken, welche wiederum können, in vitro und in vivo zur Optimierung der Leistung Biomaterial gescreent werden.

Diese Methode beschreibt die kombinatorische Synthese von biologisch abbaubaren Polyanhydrid Film-und Nanopartikel-Bibliotheken und die Hochdurchsatz-Detektion von Protein-Freisetzung aus diesen Bibliotheken.

Kombinatorische Synthese von und High-Throughput-Protein Release von Polymer Film-und Nanopartikel-Bibliotheken

Polyanhydride sind eine Klasse von Biomaterialien mit exzellenter Biokompatibilität und hervorragenden Eigenschaften zur Wirkstofffreisetzung. Obwohl sie bereits umfassend in Verbindung mit ... untersucht wurden,

Dieses Video beschreibt die kombinatorische Synthese von biologisch abbaubaren Polyanhydrid-Film- und Nanopartikel-Bibliotheken sowie die Hochdurchsatzdetektion der Proteinfreisetzung aus diesen Bibliotheken. Zunächst wird eine automatisierte Hochdurchsatz-Abscheidevorrichtung verwendet, um ein kompositionell vielfältiges Array von Monomeren in Glas-Küvetten abzuscheiden. Eine Polykondensationsreaktion wird bei 180 Grad Celsius und 0,3 Tor für 1,5 Stunden durchgeführt.Diese Reaktionsbedingungen sind spezifisch für die Synthese des C-P-H-S-A-Polyanhydrid-Polymers. Mithilfe der automatisierten Applikationsvorrichtung werden das Lösungsmittel und alle Komponenten für die Einschließung in die Küvetten mit der Polymerbibliothek gegeben. Eine Beschallung kann durchgeführt werden, um eine vollständige Auflösung des Polymers und eine gleichmäßige Verteilung der zusätzlichen Komponenten sicherzustellen.Anschließend wird das gelöste Polymer in ein Röhrchen mit Nichtlösungsmittel überführt, um durch Nanopräzipitation die Nanopartikel-Bibliothek herzustellen. Die Nanopartikel werden durch Vakuumtrocknung oder Filtration gewonnen und danach in eine modifizierte 96-Well-Freisetzungsschale überführt. Schließlich wird die mit Protein beladene Bibliothek unter physiologischen Bedingungen inkubiert, und die Proteinfreisetzungs-Kinetik wird mittels einer fluorimetrischen Detektionsmethode analysiert.Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Kinetik der Proteinfreisetzung in Abhängigkeit von den Polymereigenschaften oder den Bedingungen des Freisetzungsmilieus zeigen. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes gegenüber anderen herkömmlichen Methoden, bei denen jeweils nur eine Probe bearbeitet wird, liegt darin, dass wir mehrere Proben gleichzeitig synthetisieren können. Diese Proben können anschließend hochdurchsatzfähig auf Wechselwirkungen zwischen Protein, Polymer, Zelle und Wirtspolymer untersucht werden.Dies beschleunigt anschließend die rationale Gestaltung und Entwicklung dieser Biomaterialien für die Arzneimittelfreisetzung und das Gewebeengineering. Die Durchführung der Prozedur zeigt La Tricia Peterson, eine Postdoktorandin aus meinem Labor. In diesem Abschnitt des Videos wird ein Hyatt-Durchsatz-Depositionsgerät verwendet, um eine kompositionell variable Monomerbibliothek nach der Polymerisation abzuscheiden.Dieses Gerät dient zur Herstellung einer kombinatorischen Bibliothek aus leeren oder proteinbeladenen Polymerfilmen oder -nanopartikeln. Die automatisierte Plattform besteht aus zwei programmierbaren Spritzenpumpen und drei linear bewegten Aktuatoren, die in Reihe mit einem Computer verbunden sind. Die LabVIEW-Software wird verwendet, um Befehle an die Spritzenpumpen und Aktuatoren zu senden.10-cc-Gastdichtspritzen werden mit Metallkapillarrohren, die über Luer-Lock-Verbindungsstücke angeschlossen sind, in die Spritzenpumpen eingesetzt, um die Polymersuspensionen in Glas-Küvetten abzugeben. In dieser Demonstration wird Seic-Säure oder SA zusammen mit einem Sechs-Biss-para-oxy-hean oder CPH verwendet, um eine Bibliothek von Nanopartikeln herzustellen, die Texas-Red-markiertes Rinderserumalbumin einschließen. Die Anweisungen in diesem Video und den begleitenden Dokumenten können angepasst werden, um eine breite Palette von Polymerfilmen und Bibliotheken von Nanopartikeln herzustellen und zu testen.Um die Bibliotheken herzustellen, lösen Sie zunächst jeden Monomer und Chloroform in einem Glasvial auf eine Endkonzentration von 25 Milligramm pro Milliliter. Danach füllen Sie jede Lösung in eine 10-cc-Gasspritze, indem Sie die Lösung durch das Luer-Lock-Ende der Spritze aufziehen. Entfernen Sie sämtliche Luftblasen.Befestigen Sie anschließend die lösungsmittelbeständige Lock-Vorrichtung aus Edelstahl an der Kapillare am Ende der Spritze. Sichern Sie die Kapillaren in Klemmen und befestigen Sie diese an einem Stativ. Positionieren Sie dann die Enden beider Kapillaren in der Startvertiefung.Für die Monomer-Abscheidung. Platzieren Sie die Spritzen auf den programmierbaren Spritzenpumpen und arretieren Sie sie in der LabView-Software in Position. Stellen Sie die linearen Stellantriebe in der Software auf die Ausgangsposition ein.Starten Sie die automatisierte Deposition der SA- und CPH-Monomere in die Glasgefäße entlang der x-, y- und z-Achse. Aktuatoren positionieren die Kapillarröhrchen korrekt in jedes Q, prüfen dies und pumpen programmierte Volumina jedes Monomers hinein, wodurch eine kompositionell variable Monomerbibliothek entsteht. Nach der Monomerdepotion.Überführen Sie die Monomerbibliothek in einen vorgeheizten Vakuumofen und inkubieren Sie sie bei 180 Grad Celsius und 0,3 Torr für 1,5 Stunden, um die Kondensationspolymerisation zu ermöglichen. Nach der Inkubation ist die Herstellung der Polymerbibliothek abgeschlossen. Anschließend werden proteinbeladene Polymer-Nanopartikel erzeugt.Siehe das begleitende Protokoll zur Herstellung einer Bibliothek proteinbeladener Polymerfilme für die Herstellung einer Bibliothek proteinbeladener Nanopartikel. Fügen Sie in diesem Fall das Protein, Texas Red Rinderserumalbumin, dem geeigneten Lösungsmittel hinzu, das in der Lage sein sollte, die Polymerbibliothek zu lösen. Hier wird Methylenchlorid in einer Konzentration von zwei Milligramm pro Milliliter verwendet.Füllen Sie die 10-cc-Spritze mit dem Texas-Red-BSA-haltigen Lösungsmittel und setzen Sie sie in die erste Spritzenpumpe ein. Setzen Sie anschließend eine saubere, leere 2-cc-Spritze in die zweite Spritzenpumpe ein, und platzieren Sie die Rohre, die 15 Milliliter eines Nichtlösungsmittels – in diesem Fall Pentan – enthalten, im Rohrhalter neben der Vial-Plattform. Starten Sie danach im Labor die automatisierte Ablagerung des Lösungsmittels, indem Sie in der Software das entsprechende Programm auswählen.Nach Start des Programms wird das Lösungsmittel in die Küvetten mit der Polymerbibliothek gegeben, wodurch eine Polymerkonzentration von 20 Milligramm pro Milliliter entsteht. Sobald das gesamte Lösungsmittel zugegeben ist, sollte es eine bis fünf Minuten lang wirken, um das Polymer aufzulösen. Anschließend kann optional eine Vorgang zur Sicherstellung einer vollständigen Polymerauflösung und einer gleichmäßigen Proteindispersion durchgeführt werden.Als Nächstes starten Sie das Probenübertragungsprogramm in LabView. Jede gelöste Polymerprobe der Bibliothek wird dann in die leere Spritze aufgezogen und in das entsprechende Röhrchen mit Nichtlösungsmittel im Probenträger abgegeben. Nachdem jede Probe übertragen wurde, gewinnen Sie die proteinbeladenen Nanopartikel zurück, indem Sie die Nanopartikelbibliothek in eine Vakuumkammer bei einem Vakuum von 10 Millimeter Quecksilber oder mithilfe von Vakuumfiltration bringen, bis das Lösungsmittel entfernt ist.Um die Freisetzung der verkapselten BSA zu untersuchen, beginnen Sie mit einer tiefen 96er-Wel-Platte aus Polypropylen, bei der die oberen halben Zoll der Wand jedes Wells jeder benachbarten Spalte der Platte entfernt wurden. Das Entfernen des oberen Teils jedes Wells zwischen den Spalten A und B, C und D, E und F sowie G und H ermöglicht einen Flüssigkeitsfluss zwischen jedem Paar benachbarter Wells, wenn diese bis zur vollen Transfermenge gefüllt sind. Geben Sie Texas-rot-markierte BSA-Standards im Bereich von 1000 bis 10 Mikrogramm pro Milliliter in die tiefe 96er-Wel-Platte.Diese werden zur Berechnung der Proteinmenge verwendet und berücksichtigen zudem die Fluorochrom-Quenchung. Rekonstituieren Sie die gewünschte Masse an Nanopartikeln in PBS-Puffer und sonifizieren Sie, um die Partikel gleichmäßig zu dispergieren. Überführen Sie anschließend die Nanopartikel-Bibliothek in die tiefe 96-Well-Platte und warten Sie, bis sich die Proben am Boden der Platte abgesetzt haben. Füllen Sie danach mit einer Pipette langsam alle angrenzenden Wells mit PBS-Puffer bis zu einem Viertel Zoll unter den Rand der Wells auf.Es sollte genügend Puffer in den angrenzenden Vertiefungen vorhanden sein, damit dieser frei zwischen den Vertiefungen fließen kann. Verschließen Sie anschließend die Freisetzungsplatte mit dem Deckel und stellen Sie sie unter Rühren bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie während des gesamten Experiments zu bestimmten inkrementellen Zeitpunkten einen 9.400 Typhoon-Flachbett-Fluoreszenzscanner, um die Platte mit den entsprechenden Anregungs-, Laser- und Emissionsfiltern zu scannen.Nach dem Scannen verwenden Sie Bildquantifizierungssoftware, um die Menge des freigesetzten fluorochrommarkierten Proteins in jeder Probe zu bestimmen. In diesem Fall wurde Texas Red-markiertes BSA in einer Bibliothek polymerer Nanopartikel eingeschlossen, die aus SA- und CPH-Monomeren synthetisiert wurden, wie in diesem Video beschrieben, um die Proteinfreisetzungs-Kinetik in Abhängigkeit von der Polymerchemie zu untersuchen. Die mit Protein beladenen Nanopartikel wurden einen Monat lang bei 37 Grad Celsius inkubiert, wobei fluoreszierende Scans zu zeitlich gestaffelten Zeitpunkten zur Quantifizierung der Proteinfreisetzung aufgenommen wurden.Wie hier gezeigt, wurde diese Hochdurchsatzmethode verwendet, um die Freisetzungs­kinetik von Texas Red-markiertem BSA aus einer Bibliothek von A-C-P-H-S-A-Polyanhydrid-Nanopartikeln zu bestimmen. Es wurden chemieabhängige Trends beobachtet, wobei die Freisetzungs­raten mit zunehmender Filmchemie nach Sarich anstiegen. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung standardmäßiger Proteinquantifizierungsassays erhalten.In einem separaten Experiment wurde die Freisetzung von Texas Red BSA aus CPT CPH Poly-Anhydrid-Filmbibliotheken untersucht, wobei hier eine nahezu nullte-Ordnung-Freisetzungs­kinetik beobachtet wurde. Filme mit hohem cpeg-Gehalt setzten das Protein am schnellsten frei, was potenzielle Anwendungen im medizinischen Bereich als biologisch abbaubare Arzneimittelabgabesysteme nahelegt. Diese Ergebnisse zeigen, dass das gewünschte Freisetzungsprofil eines therapeutischen Wirkstoffs oder eines Impfantigens durch Änderung der Polymerchemie gesteuert werden kann. Im Anschluss an dieses Verfahren wurden weitere kombinatorische Methoden entwickelt, um Bereiche wie Proteinstabilität, zelluläre Toxizität, zelluläre Aktivierung und die In-vivo-Biodistribution zu untersuchen.Diese Aspekte sind wichtig für die gezielte Entwicklung von Biomaterialien für die Arzneimittelfreisetzung und das Gewebeengineering. Vergessen Sie nicht, die richtige PSA zu tragen und während des gesamten Protokolls sichere Laborverfahren anzuwenden.

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JoVE Journal

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Eine Beschreibung der Bildung eines Polymers unter Verwendung eines Mikroarray-on-Chip-Technik Photopolymerisation. Der hohe Durchsatz Oberflächencharakterisierung mittels Rasterkraftmikroskopie, Wasser Randwinkelmessungen, Röntgen-Photoelektronenspektroskopie und Flugzeit-Sekundärionen-Massenspektrometrie und einer Zellanhaftung-Assay wird auch beschrieben.

Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials

Wir stellen eine mikrofluidische Ansatz für die Expression von Protein-Arrays. Die Vorrichtung besteht aus Tausenden von Reaktionskammern durch mikromechanische Ventile gesteuert. Mikrofluidische Vorrichtung mit einer Mikroarray-bedruckte Genbibliothek gepaart. Diese Gene werden dann transkribiert und translatiert auf dem Chip, was zu einem Protein-Array bereit zu Versuchszwecken verwendet.

High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

In diesem Artikel wird ein hoher Durchsatz Verfahren zur Synthese von Oligosacchariden und ihre Befestigung an der Oberfläche der Nanopartikel Polyanhydrid zur weiteren Verwendung bei der Ausrichtung der spezifische Rezeptoren auf Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert wird.

Hochdurchsatz-Synthese von Kohlenhydraten und Funktionalisierung von Nanopartikeln Polyanhydrid

Eine einfache, robuste und skalierbare Technik, um auf Vorlage freie Substrate zu funktionalisieren und Selbstorganisation makroskopischer Nanopartikel-Liganden-Monoschichten wird in diesem Protokoll beschrieben.

Eine Technik, um auf Vorlage freie Substrate zu funktionalisieren und Selbstorganisation makroskopische Nanopartikel-Liganden-Monolayer Films

Wir berichten über Protokolle zur "Polymerisation" verschiedener Arten von polymerverkapselten Metallnanopartikeln in lange Ketten von "Homo-" und "Co-Polymeren".

Verwendung Polystyrol-<em&gt; Block</em&gt; -Poly (Acrylsäure) beschichteten Metallnanopartikel als Monomere für ihre Homo- und Polymerisation

Nicht gerührt Fällungspolymerisation liefert eine schnelle, reproduzierbare Prototyping Ansatz zur Synthese von Stimuli empfindlichen Poly (N Isopropylacrylamid) Mikrogele mit enger Größenverteilung. In diesem Protokoll Synthese, Charakterisierung Lichtstreuung und Einzelpartikelfluoreszenz-Tracking dieser Mikrogele in einem Weitfeldmikroskopie Einrichtung demonstriert.

Kontrollierte Synthese und Fluoreszenz-Tracking von Hoch Uniform Poly (<em&gt; N</em&gt; Isopropylacrylamid) Mikrogele

Nanomaterialien bieten vielseitige Mechanismen der kontrollierten therapeutischen Lieferung für Grundlagenforschung und Translationale Anwendungen, aber oft ihre Herstellung erfordert Fachwissen, das in den meisten biomedizinischen Labors nicht verfügbar ist. Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle für die skalierbare Fertigung und therapeutische laden diverse selbstgebaute darin, die Verwendung von Flash-Nanoprecipitation.

Schnelle, skalierbare Montage und Beladung von bioaktiven Proteinen und Immunstimulantien in diversen synthetischen darin über Flash-Nanoprecipitation

Hier stellen wir ein Protokoll zur Konjugierung von Proteinmonomer durch Enzyme vor, die Proteinpolymere mit einer kontrollierten Sequenz bilden, und immobilisieren es auf der Oberfläche für Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Studien.

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Nanogele sind eine hervorragende und vielseitige Nanopartikelplattform für die Verabreichung von Biologika. Stimuli-responsive polymere Nanogele auf Poly(ethylen)-glykol-Basis, die in der Lage sind, proteinbasierte Nutzlasten zu verkapseln, wurden unter Verwendung einer einstufigen Vernetzungs-Co-Nanopolymerisationsstrategie unter wässrigen Bedingungen synthetisiert. Die optimale Herstellung und Charakterisierung dieser neuartigen Nanopartikel wird hier vorgestellt.

Synthese von Stimuli-responsiven Nanogelen mittels wässriger Ein-Schritt-Vernetzung und Co-Nanopolymerisation

In dieser Arbeit stellen wir zwei Protokolle zur Einbettung zellfreier Proteinsynthesereaktionen in makroskalige Hydrogelmatrices vor, ohne dass eine externe Flüssigphase erforderlich ist.

Methoden zur Einbettung zellfreier Proteinsynthesereaktionen in makroskalige Hydrogele

Die Herstellung einer auf Polydimethylsiloxan (PDMS) basierenden Doppelschichtbaurichtung zur Herstellung von kombinatorischen Bibliotheken in Wasser-in-Öl-Emulsionen (Plugs) wird hier vorgestellt. Die notwendige Hard- und Software, die zur Automatisierung der Steckerproduktion erforderlich ist, wird im Protokoll detailliert beschrieben, und die Herstellung einer quantitativen Bibliothek von Leuchtstoffsteckern wird ebenfalls demonstriert.

Zweischichtiges mikrofluidisches Gerät für die kombinatorische Steckerproduktion

Erfahren Sie die kombinatorische Synthese biologisch abbaubarer Polyanhydrid-Filme und Nanopartikel-Bibliotheken mit Hochdurchsatz-Methoden zur Proteinfreisetzung. Diese Technik ermöglicht die rationelle Entwicklung von Biomaterialien für die Arzneimittelfreigabe.

Kombinatorische Synthese von und High-Throughput-Protein Release von Polymer Film-und Nanopartikel-Bibliotheken

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