Name: Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Lernen Sie die ChIRP-Methode zur Kartierung genomischer Bindungsstellen von langen nicht-kodierenden RNAs. Diese Technik nutzt biotinylierte Antisense-Oligonukleotide für hochspezifische Analysen.

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Wir danken T. Hung, MC. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, T. Swigut, und I. Shestopalov für Diskussionen. Unterstützt von der Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung von Singapur (CC), NIH R01-R01-und CA118750 HG004361 (HYC) und California Institute for Regenerative Medicine (HYC). HYC ist ein Early Career Wissenschaftler des Howard Hughes Medical Institute.

1. OEM Anwendungen Design Anti-sense DNA Fliesen Sonden für die selektive Abrufen von Ziel-RNA von Chirp. <ol><li> Design-Antisense-Oligo Probes mit dem Online-Sonde Designer bei <a href="http://singlemoleculefish.com">singlemoleculefish.com</a> 18. </li><li> Verwenden Sie diese Parameter: Anzahl der Sonden = 1 Sonde / 100 bp Länge von RNA; 2) Ziel GC% = 45, 3) Oligonukleotid-Länge = 20; 4) Abstand Länge = 60-80. Brechen RNA in Segmente, wenn zu lange für den Konstrukteur. Lassen Sie Regionen von Wiederholungen oder weitgehende Homologie. </li><li> Auftrag Antisense-DNA-Sonden mit BiotinTEG am 3&#39;-Ende Ende. </li><li> Markierungs-Sonden entsprechend ihrer Position entlang der RNA. Trennen Sie sie in zwei Pools, so dass die &quot;geraden&quot; Pool enthält alle Sonden Nummerierung 2, 4, 6, usw. und die &quot;ungeraden&quot; Pool enthält Sonden Nummerierung 1, 3, 5, usw. verdünnen Pool von Sonden bis 100 uM Konzentration und Lagerung bei -20 ° C. </li><li> Alle Experimente sind mit handelsüblicherBeide Pools, die als interne Kontrollen für einander zu dienen. Echte RNA-abhängige Signal vorhanden wäre von beiden Pools, während Sonden-spezifischen Geräusche wäre einzigartig für jeden Pool. Dies gilt sowohl für CHIRP qPCR-und Chirp-seq. </li></ol> 2. Ernten Sie die Zellen Sammeln Zellen, die für die Chirp-Experiment verwendet werden. <ol><li> Kultivieren von Zellen in Gewebekulturplatten oder Kolben bis zur Konfluenz. Spülen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) einmal und trypsinieren. Quench mit Trypsin&gt; 2x Volumen von Medien, Pipette auf und ab, um Zellen zu verdrängen und resuspendieren in einzelne Zell-Suspension. Übertragen Sie alle Medien und resuspendierten Zellen in 50 ml Falcon-Röhrchen. 20 Millionen Zellen sind in der Regel ausreichend für ein CHIRP Probe. </li><li> Spin-Zellen bei 800RCF für 4 min. Aspirieren Medien und resuspendieren 40 Millionen Zellen in 40 ml PBS, Rohre verbinden, wenn nötig. Spin-Zellen bei 800RCF für 4 min. Dekantieren PBS, sorgfältig auf einem Winkel die verbleibende Flüssigkeit abzusaugen. </li></ol&gt; 3. Cross-Link-Cells und Sammeln Zellpellet Crosslink gesammelten Zellen mit Glutaraldehyd zu RNA-Chromatin-Wechselwirkungen zu erhalten und bereiten Zellpellet. <ol><li> Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Sie 1% Glutaraldehyd in PBS Raumtemperatur. Bereiten Sie 10 ml pro 10 Millionen Zellen (0,4 ml 25% Glutaraldehyd Lager + 9,6 ml PBS). Glutaraldehyd muss frisch verwendet werden. </li><li> Tippen Sie unten auf Falcon-Röhrchen, um Pellets zu entfernen. Resuspendieren Zellpellet in 1% Glutaraldehyd, beginnend mit einem kleinen Volumen zu Klumpen zu vermeiden, dann von oben bis zur vollen Lautstärke. Umkehren, um zu mischen. Crosslink für 10min bei Raumtemperatur auf einer End-to-End-Schüttler oder Rotator. </li><li> Quench die Vernetzungsreaktion mit 1:10 Volumen von 1,25 M Glycin bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Drehen am 2000RCF für 5 min. Absaugen des Überstandes und Waschen Pellet mit 20 ml PBS gekühlt einmal drehende 2000RCF für 5 min. </li><li> Aspirieren und resuspendieren Sie das wveraschten, vernetzten Pellet mit 1 ml gekühltem PBS pro 20 Millionen Zellen. Übertragen Sie jede ml in ein Eppendorf-Röhrchen und drehen sich mit 2000RCF für 3 min bei 4 C. Entfernen Sie so viel wie möglich mit PBS Pipettenspitze vorsichtig. </li><li> Flash-frieren der Zellpellets in flüssigem Stickstoff und lagern bei -80 ° C auf unbestimmte Zeit. </li></ol> 4. Cell Lysis Lyse vernetzten Zellen zu Zelllysat vorzubereiten. <ol><li> Eingefrorene Zellpellets bei Raumtemperatur. Tippen schwer zu lösen und das Zellpellet zu mischen. Drehen Sie das Pellet bei 2000RCF für 3 min bei 4 ° C Mit einem scharfen 10 pl Pipettenspitze, um alle verbleibenden PBS zu entfernen. </li><li> Auf einer elektronischen Waage (Genauigkeit 1 mg) Tara die Masse eines leeren Eppendorf-Röhrchen (unsere Rohre wiegen 1,060 Gramm sehr konsequent). Wiegen Sie jedes Pellet und notieren ihr Gewicht. Eine volle 15 cm Schale aus vernetztem HeLa-Zellen in der Regel wiegt 100 mg. </li><li> Supplement Lysis Buffer (10x die Masse der Pellets, z. B. 1 ml für 100 mg) mit fresh Protease-Inhibitor, PMSF und Superase-in (siehe beigefügte Liste Puffer). Gut mischen. </li><li> Fügen 10X Volumen ergänzt Lysispuffer in jedes Röhrchen und das Pellet. Für kleine Pellets &lt;25 mg, in 250 ul ergänzt Lysepuffer resuspendieren. Die Aussetzung sollte glatt sein. Falls nicht, teilen Suspension in 500 ul Aliquots und verwenden Sie einen motorisierten Pellet-Mixer zu brechen Klumpen. Fahren Sie direkt mit Beschallung. </li></ol> 5. Ultraschallbehandlung Shear DNA durch Beschallung vernetzten Zelllysaten. <ol><li> Beschallen Zelllysat in Bioruptor in 15 ml Falcon-Röhrchen. Mit &lt;1,5 ml Lysat in jedem Röhrchen und für eine schnellere Beschallung, beschallen nicht mehr als zwei Rohre zu einer Zeit. </li><li> Mit Ultraschall in einem 4 ° C Wasserbad bei höchster Stufe mit 30 Sekunden ein, 45 Sekunden AUS Pulspausen. Überprüfen Sie Lysat alle 30 min. Weiter Ultraschallbehandlung, bis das Zell-Lysat nicht mehr trübe ist. Dies kann so wenig wie 30 Minuten und nicht weniger als 4 Stunden. Die Anzahlvon Rohren, wird das Probenvolumen, die Badtemperatur und die Dauer der Beschallung Zeit beeinflussen, wie lange der Prozess dauert. Tubes wird wahrscheinlich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten beschallen, so bündeln sie zusammen alle 30 Minuten und weiterzuverbreiten in Original-Röhren, um die Homogenität zu gewährleisten. Hinweis: Glutaraldehyd-vernetzten Zellen nehmen deutlich länger als Formaldehyd-Äquivalente beschallen. </li><li> Wenn Lysat klar macht, übertragen Sie 5 ul Lysat in ein frisches Eppendorf-Röhrchen. In 90 ul DNA-Protease K (PK) Buffer (siehe Liste Puffer) und 5 ul PK. Vortex zu mischen und kurz abzentrifugieren. Inkubieren für 45 min bei 50 ° C </li><li> Extraktion von DNA mit Qiagen PCR Purification Kit. Eluieren DNA in 30 ul Qiagen Elutionspuffer (EB) und überprüfen DNA-Größe auf 1% Agarosegel. Wenn Großteil der DNA-Abstrich ist 100-500 bp, Beschallung ist abgeschlossen. Wenn nicht, weiter beschallen. </li><li> Zentrifuge beschallten Proben 16100RCF für 10 min bei 4 ° C Kombinieren Sie Überstände, Aliquot in 1 ml Proben-und Flash-Freeze in flüssiger Gasdrucn. Lagerung bei -80 ° C. </li></ol> 6. CHIRP Hybridisieren biotinylierten DNA-Sonden an die RNA zu isolieren und gebundenen Chromatin. <ol><li> Auftauen Rohre Chromatin bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Hybridisierungspuffer (siehe Liste Puffer, für das 2 ml pro ml Chromatin). Vortex mischen. </li><li> Für eine typische CHIRP Probe mit 1 ml Lysat, entfernen Sie 10 ul für die RNA-INPUT und 10 ul für DNA-Input und-ort in Eppendorf-Röhrchen. Halten auf Eis bis zur weiteren Verwendung. </li><li> 1 ml Chromatin zu 15 ml Falcon Röhrchen. 2 ml Hybridisierungspuffer in jedes Röhrchen. Für Gesamtvolumen &lt;1,5 ml, Eppendorf-Röhrchen verwenden. </li><li> Auftauen Sonden bei Raumtemperatur. Nanodrop Sonden an Menge nach, wenn Sie es nicht in eine lange Zeit verwendet haben (100 uM Sonden sollten spec ~ 500-600 ng / ul mit Einzelstrang-DNA-Einstellung). Fügen Sie entsprechende Volumen von Sonden auf bestimmte Rohre (100 pmol Sonde pro 1 ml Chromatin, 1 ul 100 pmol / ul Sonde pro 1 ml Chromatin).Gut mischen. Bei 37 ° C für 4 Stunden unter Schütteln. </li><li> Mit 20 min übrigen für die Hybridisierung, bereiten Sie die C-1 magnetische Kügelchen (gelagert bei 4 ° C). Verwenden Sie 100 ul pro 100 pmol von Sonden. Waschen mit 1 ml Lysispuffer unsupplementierten dreimal mit dem Dynamag-2 Magnetstreifen zu trennen Perlen aus dem Puffer. </li><li> Resuspendieren Sie Perlen in ursprünglichen Volumens Lysispuffer; Ergänzung mit frischen PMSF, PI und Superase-in. Nach 4 Stunden Hybridisierungsreaktion abgeschlossen ist, werden 100 ul Kügelchen in jedes Röhrchen. Gut mischen. Bei 37 ° C für 30 Minuten unter Schütteln. </li><li> Bereiten Waschpuffer (5 ml pro Probe). Vortex mischen. Pre-warm bis 37 ° C. In PMSF vor der Verwendung. </li><li> Waschen Kügelchen mit 1 ml Waschpuffer fünfmal. Auf dem ersten Waschgang, verwenden Dynamag-15 Magnetstreifen zu trennen Perlen, dekantieren und Resuspension in 1 ml Waschpuffer. Übertragen Volumen auf 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Bei 37 ° C unter Schütteln für 5 min. </li><li> Bei nachfolgenden Wäschen, Spin-down jedes Röhrchen auf einem Minizentrifuge, Setzen Sie auf Probe Dynamag-2 Magnetstreifen für 1 min. Dekantieren, reinigen Sie Tropfen mit einem Kimwipe, in 1 ml Waschpuffer resuspendieren. Bei 37 ° C unter Schütteln für 5 min. Wiederholen Sie dies für insgesamt fünf Wäschen. </li><li> Endlich waschen, resuspendieren Perlen gut. Nehmen Sie 100 ul und beiseite stellen für RNA-Isolierung. Reserve für 900 ul DNA-Fraktion. Legen Sie alle Rohre auf Dynamag-2 Magnetstreifen und Waschpuffer zu entfernen. Drehen Sie alle Röhrchen nach unten kurz, legen Sie sie auf Magnetstreifen. Entfernen Sie das letzte Stück der Waschpuffer vollständig mit einem scharfen 10 pl Pipettenspitze. </li></ol> 7. RNA-Isolierung Auszug RNA-Fraktion von Chirp Proben mittels qRT-PCR zu quantifizieren. <ol><li> Nehmen Sie 100 ul Wulst Proben und 10 ul RNA INPUT Probe. In 85 ul RNA-PK-Puffer pH 7,0 zu Input-RNA. Resuspendieren Sie Perlen in 95 ul RNA-PK-Puffer pH 7,0. Geben Sie 5 ul Proteinease K und inkubieren bei 50 ° C für 45 min mit Ende-zu-Ende zittern. </li><li> Kurz Spin-Down alle Rohre undkochen Proben für 10 min auf Heizblock bei 95 ° C </li><li> Entspannen Proben auf Eis, 500 ul TRIzol zugeben und kräftig vortexen für 10 sek. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. Bei -80 ° C oder fahren Sie mit Schritt 4 fort. </li><li> Geben Sie 100 ul Chloroform zu TRIzol behandelten Proben. Vortex kräftig für 10 sek. Drehen am 16100RCF auf einer Tischzentrifuge für 15 min bei 4 ° C </li><li> Nehmen Sie ~ 400 ul wässrige Überstand, die Vermeidung organischer und Schnittstelle. </li><li> Fügen Sie 600 ul (1,5 Volumen) 100% Ethanol und gut mischen. Spin Probe durch MIRNeasy Mini-Säulen. 1x waschen mit RWT (MIRNeasy Mini Kit), 2x mit RPE pro Protokoll des Herstellers. Man eluiert mit 30 ul Nuklease-freiem H 2 O (NFH 2 O). </li><li> Behandeln Sie die RNA-Eluats mit DNA-frei pro Protokoll des Herstellers. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, erwärmen die Probe für 15 Minuten bei 65 ° C zur vollständigen Inaktivierung jegliches verbleibende DNase. </li><li> Verwenden Sie 1 ul RNA isolieren pro Vertiefung für qRT-PCR-Analyse zu bestätigen lncRNARetrieval. GAPDH wird oft als negative Kontrolle verwendet. </li></ol> 8. DNA-Isolierung Auszug DNA-Fraktion von Chirp Proben durch Sequenzierung identifizieren oder zu quantifizieren, indem qPCR. <ol><li> Bereiten DNA Elutionspuffer (siehe Liste Puffer), 150 ul pro Probe, einschließlich DNA-INPUT. </li><li> Fügen Sie 1 0μL RNase A (10 mg / mL) und 10 ul RNase H (10 U / ul) pro ml DNA Elution Buffer und Wirbel zu mischen. </li><li> Resuspendieren jede Probe von Kügelchen in 150 ul DNA-Elutionspuffer mit RNasen. (INPUT resuspendieren DNA in 140 ul) bei 37 ° C für 30 min unter Schütteln inkubieren. </li><li> Separate Perlen und Überstand auf Dynamag-2 Magnetstreifen. Überstand entfernen und hinzufügen, um beschrifteten Röhrchen. </li><li> Bereiten Sie ein zweites Aliquot der DNA-Elutionspuffer mit 10 ul RNase A (10 mg / mL) und RNaseH (10 U / ul) genau wie in 8.2 getan). Fügen Sie 150 ul zu jeder Probe (einschließlich DNA-Input), inkubieren, Überstand entfernen. Sammeln Sie alle Überstand (Schulterd sein ~ 300 ul). </li><li> In 15 ul PK zu jeder Probe. Inkubieren bei 50 ° C für 45 Minuten unter Schütteln. </li><li> Pre-Spin-down-Gelb-Phase-Lock-Gel-Tuben (5PRIME). Transfer-DNA-Proben zu Phase-Lock-Gel-Tuben, und 300 ul PhOH: Chloroform: Isoamylalkohol pro Probe. Gebrauch kräftig schütteln, 10 min, und der Spin-Down auf einer Tischzentrifuge bei 16100RCF für 5 min bei 4 ° C Nehmen wässrigen von der Spitze (~ 300 ul). Add 3 ul GlycoBlue, 30 ul NaOAc und 900 ul 100% EtOH. Gut mischen und bei -20 ° C über Nacht. </li><li> Spin Proben 16100RCF für 30 min bei 4 ° C </li><li> Überstand vorsichtig dekantieren. 1 ml 70% EtOH und Wirbel zu mischen. Drehen am 16100RCF für 5 min. Überstand entfernen mittels einer Pipette. Luft für 1min trocknen. Resuspendieren in 30 ul EB. </li><li> DNA-Proben sind bereit für die Analyse von qPCR oder die Zubereitung von Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheken pro Illumina-Protokoll. </li></ol> 10. Repräsentative Ergebnisse 1 </strong&gt; zeigt die CHIRP Workflow. Eine erfolgreiche CHIRP Experiment typischerweise bereichert Ziel-RNA signifikant gegenüber nicht-spezifische RNAs. 2 zeigt Anreicherung von humanen Telomerase-RNA (TERC) aus HeLa-Zellen über GAPDH, ein reichlich zelluläre RNA, die als negative Kontrolle dient. Mehrheit der TERC RNAs (~ 88%) in der Zelle vorhanden, wurden von der Durchführung CHIRP gezogen, während nur 0,46% der GAPDH-RNA wurde abgerufen, was zeigt, einem Anreicherungsfaktor von ~ 200 fache. Unspezifische Sonden wie Sonden Targeting LacZ-RNA, die nicht in Säugetierzellen (2) ausgedrückt wird, können als zusätzliche negative Kontrollen verwendet werden. DNA-Regionen zu erwarten, um das Ziel zu binden lncRNA werden typischerweise über negativen Bereichen, wenn sie durch qPCR gemessen angereichert. 3 zeigt qPCR Validierung von vier HOTAIR-gebundenen Plattformen primäre humane Vorhautfibroblasten, dass wir durch Ausführen CHIRP-seq in der gleichen Zelllinie bestimmt, während TERC und GAPDH DNA Seiten an sichrve als negative Kontrolle Regionen. Sowohl &quot;gerade&quot; und &quot;ungerade&quot;-Sonde setzt erbrachten vergleichbare Anreicherung erwartet HOTAIR-gebundenen Seiten über Regionen negativ, ein Kennzeichen der wahren lncRNA-Bindungsstellen. Hochdurchsatz-Sequenzierung von Chirp angereicherte DNA ergibt sich eine globale Karte der lncRNA-Bindungsstellen. Die Drosophila lncRNA roX2 ist bekannt, mit dem X-Chromosom in einer Weise, die für die Dosierung Kompensation erforderlich ist interagieren. 4 zeigt roX2 Bindungsprofil über einen Abschnitt des X-Chromosoms. Sowohl &quot;gerade&quot; und &quot;ungerade&quot; Proben wurden sequenziert und ihre einzigartige Geräusche wurden eliminiert, um eine Spur von sich überlappenden Signale zu erzeugen. Jede &quot;Spitze&quot; hier zeigt eine starke Seite von roX2 bindend. Die komplette Liste der Spur und roX2 Zielgene in Chu et al. 2011 17. <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ablaufschema des Chirp-VerfahDure. Chromatin ist lncRNA vernetzt: Proteinaddukte in vivo biotinylierten Sonden hybridisiert Fliesen zu lncRNA zielen, und Chromatin-Komplexe werden unter Verwendung von magnetischen Streptavidin-Kügelchen, gefolgt von strengen Wäschen.. Wir eluieren lncRNA gebundene DNA oder Proteinen mit einem Cocktail von RNase A und H. Eine mutmaßliche lncRNA Bindungssequenz orange schematisiert wird. Zuvor in Chu et al. 2011. 17 <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig2.jpg" /> Abbildung 2. CHIRP bereichert für den menschlichen TERC RNA. TERC-asDNA Sonden abrufen ~ 88% der zellulären RNA TERC und GAPDH nicht nachweisbar. LacZ-asDNA Sonden werden als negative Kontrollen verwendet und Abrufen weder RNAs. Mittel + SD dargestellt. Zuvor in Chu et al. 2011. 17 <img alt="Abbildung 3." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig3.jpg" /> Abbildung 3. HOTAIR CHIRP-qPCR in primären humanen fürEskin Fibroblasten. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 und ABCA2 sind Bereiche, die mit HOTAIR interagieren. TERC und GAPDH diente als negative Kontrollen. Mittel + SD dargestellt. Zuvor in Chu et al. 2011. 17 <img alt="Abbildung 4." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig4.jpg" /> Abbildung 4. CHIRP-seq Daten von roX2 RNA in Sl2 Drosophila-Zellen. &quot;Selbst&quot; und &quot;ungerade&quot; wurden getrennt sequenziert; ihre Daten zusammenführen, um gemeinsam nur Spitzen in beide reflektieren. Das fusionierte Bahn dargestellt. Zuvor in Chu et al. 2011. 17

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</ol>

C. Chu Chang und HY sind als Erfinder auf einer Patentanmeldung auf dieser Methode benannt.

Hier beschrieben CHIRP-seq, ein Verfahren zur Zuordnung in vivo lncRNA Bindungsstellen genomweiten. Die wesentlichen Parameter für Erfolg sind die Split-Pools von Fliesen Oligonukleotid-Sonden und Glutaraldehyd-Vernetzung. Das Design der Sonden-Affinität ist einfach angesichts der RNA-Sequenz und erfordert keine Vorkenntnisse in der RNA-Struktur oder funktionellen Domänen. Unser Erfolg mit roX2, TERC und HOTAIR - drei ziemlich unterschiedlichen RNAs in zwei Arten - legt nahe, dass CHIRP-seq wahrscheinlich verallgemeinerbar zu viele lncRNAs ist. Wie bei allen Experimenten werden Pflege und angemessene Kontrollen erforderlich, um die Ergebnisse zu interpretieren. Verschiedene lncRNA kann Titration von Bedingungen, und vernünftige Änderung der Bedingungen, wie zB Auswahl von verschiedenen Affinitätssonden oder Vernetzer erfordern, kann auf unterschiedliche Aspekte der RNA-Chromatin-Wechselwirkungen. Wie Chip-seq sind nicht alle Bindungsereignisse unbedingt funktional, und weitere Studien sind erforderlich, um die biologischen Folgen der RNA-o ermittelnccupancy auf Chromatin. Dennoch sehen wir viele interessante Anwendungen dieser Technologie für Forscher anderer Chromatin-assoziierten lncRNAs, die jetzt in die Tausende 8,9. So wie ChIP-seq hat die Tür für genomweite Untersuchungen der DNA-Protein-Interaktionen eröffnet, kann CHIRP-seq Studien des &quot;RNA Interaktom&quot; enthüllen viele neue Wege der Biologie.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Pufferliste:</td></tr><tr><td colspan="4">Lösen Sie ein Pellet vollständigen Proteaseinhibitors in 1 ml Wasser als 50x-Stammlösung. Stellen Sie 100 mM PMSF in Isopropanol (100x-Stammlösung) her. Superase-in wird als 200x-Stammlösung verwendet. Lagern Sie alle Lösungen bei -20 °C. &amp;deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Puffer zur Zelllyse:</td></tr><tr><td colspan="4">50 mM Tris-Cl, pH 7,0&lt;br/&gt;10 mM EDTA&lt;br/&gt;1 % SDS&lt;br/&gt;PMSF, P.I. und Superase-in stets frisch vor der Verwendung hinzufügen, außer beim Waschen der Kügelchen</td></tr><tr><td colspan="4">Proteinase K-Puffer (für DNA)</td></tr><tr><td colspan="4">100 mM NaCl&lt;br/&gt;10 mM TrisCl, pH 8,0 (für RNA pH 7,0 verwenden)&lt;br/&gt;1 mM EDTA&lt;br/&gt;0,5 % SDS&lt;br/&gt;Frisch vor Gebrauch 5 % (v/v) Protease K (Ambion AM2546 20 mg/ml) hinzufügen</td></tr><tr><td colspan="4">Hybridisierungspuffer</td></tr><tr><td colspan="4">750 mM NaCl&lt;br/&gt;1 % SDS&lt;br/&gt;50 mM Tris-Cl, pH 7,0&lt;br/&gt;1 mM EDTA&lt;br/&gt;15 % Formamid (im Dunkeln bei 4 °C lagern) &amp;deg;C)&lt;br/&gt;PMSF, P.I. und Superase-In stets vor Gebrauch frisch zugeben</td></tr><tr><td colspan="4">Waschpuffer</td></tr><tr><td colspan="4">2x NaCl und Natriumcitrat (SSC) (verdünnt von 20x SSC Invitrogen-Bestand)&lt;br/&gt;0,5 % SDS&lt;br/&gt;PMSF stets frisch vor der Verwendung hinzufügen</td></tr><tr><td colspan="4">Puffer zur DNA-Elution</td></tr><tr><td colspan="4">50 mM NaHCO₃&lt;br/&gt;1 % SDS</td></tr><tr><td colspan="4">Tabelle spezifischer Reagenzien und Geräte:</td></tr><tr><td>Glutaraldehyd (EM-Reinheit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-10x10ml</td><td></td></tr><tr><td>Motorisierter Pelletmischer</td><td>VWR international</td><td>V8185-904</td><td></td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor</td><td>Roche-Gruppe</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Superase-in</td><td>Ambion</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?AM2696">AM2696&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon-Röhrchen (für die Sonifikation)</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Reinigungs-Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>C-1-Magnetkugeln</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-15-Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>123-01D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2-Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>MIRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>R0601K</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Phasen-Lock-Gel Heavy</td><td>5 PRIM</td><td>2302810</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamyl</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Ricca</td><td>RSOC0020-1C</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>JT Baker</td><td>4057-06</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Elutionspuffer (EB)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Invitrogen</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>10 % SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15553-027</td><td></td></tr><tr><td>DNA-&lt;em&gt;kostenlos&lt;/em&gt;</td><td>Ambion</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Puffer-Kit</td><td>Ambion</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Invitrogen</td><td>15515-026</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin isolierung von rna-reinigung (chirp)

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Lange-kodierende RNAs sind wichtige Regulatoren der Chromatin Staaten für wichtige biologische Prozesse wie Dosiskompensation, Imprinting und Entwicklungsstörungen Genexpression 1,2,3,4,5,6,7. Die jüngste Entdeckung von Tausenden von lncRNAs in Verbindung mit spezifischen Modifikation Chromatin-Komplexe wie Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) vermittelt, dass Histon H3 Lysin 27 Trimethylierung (H3K27me3), breite Rollen für zahlreiche lncRNAs bei der Verwaltung von Chromatin-Staaten in einer Gen-spezifischen schlägt Mode 8,9. Während einige lncRNAs gedacht werden, um in cis auf benachbarte Gene arbeiten, arbeiten andere lncRNAs in trans zu weit entfernten Gene regulieren. Zum Beispiel sind Drosophila lncRNAs roX1 und roX2 bind zahlreichen Regionen auf dem X-Chromosom der männlichen Zellen, und entscheidend für Dosiskompensation 10,11. Allerdings sind die genauen Standorte von ihren Bindungsstellen nicht mit hoher Auflösung bekannt. In ähnlicher Weise können menschliche lncRNA HOTAIR PRC2 Belegung auf h beeinflussenundreds von Genen genomweiten 3,12,13, aber wie Spezifität erreicht wird, ist unklar. LncRNAs kann auch als Modulgerüsten dienen dazu, die Montage von mehreren Protein-Komplexe zu rekrutieren. Die klassische trans-agierende RNA-Gerüst ist die TERC RNA, die als Vorlage und Gerüst für die Telomerase-Komplex 14 dient; HOTAIR kann auch als Gerüst für PRC2 und einem H3K4 Demethylase Komplex 13 zu dienen. Frühere Studien Mapping RNA-Belegung am Chromatin haben gezeigt, wesentliche Einblicke 15,16, aber nur an einem einzigen Gen-Locus zu einer Zeit. Die Belegung der meisten Websites lncRNAs sind nicht bekannt, und die Rollen von lncRNAs in Chromatin Regulation wurden zumeist aus den indirekten Auswirkungen der lncRNA Störung abgeleitet. So wie Chromatin-Immunopräzipitation von Microarray-oder tief-Sequenzierung (ChIP-Chip oder Chip-seq bezeichnet) verfolgt hat, unser Verständnis von Protein-DNA-Wechselwirkungen im genomischen Maßstab verbessert, hier haben wir veranschaulichen eine recenTLY veröffentlichten Strategie zu lange RNA-Belegung genomweiten bei hoher Auflösung 17 Karte. Chromatin-Komplex, der durch Antisense-Oligonukleotide Tiling, der dann eine Karte der genomischen Bindestellen bei einer Auflösung von mehreren hundert Basen mit: Diese Methode, Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp) (Abbildung 1), basiert auf Affinität Erfassung von Soll-lncRNA Basis hoher Empfindlichkeit und geringem Hintergrund. Chirp ist auf viele lncRNAs, weil das Design der Affinitäts-Sonden ist einfach aufgrund der RNA-Sequenz und erfordert keine Kenntnis der RNA-Struktur oder funktionelle Domänen.

Chirp ist eine neuartige und schnelle Technik, um genomische Bindungsstellen der langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs) abzubilden. Die Methode nutzt die Spezifität der anti-sense-Oligonukleotide Fliesen um die Auszählung von lncRNA-gebundene genomische Stellen zu ermöglichen.

Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Lange nicht-kodierende RNAs sind zentrale Regulatoren von Chromatinstatus für wichtige biologische Prozesse wie die Dosiskompensation, das Imprinting und die Entwicklung ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, DNA-Bereiche zu identifizieren, die mit einer bestimmten nicht-kodierenden RNS assoziiert sind, und zwar mithilfe von QPCR oder Hochdurchsatzsequenzierung. Dies wird erreicht, indem Zellen vernetzt werden, um native DNA-RNS-Interaktionen in vivo festzuhalten. In einem zweiten Schritt werden die Zellen lysiert und einer Sonifikation unterzogen, um das Zelllysat zu solubilisieren und die Chromatinstruktur in kleine Fragmente zu zerlegen. Anschließend werden biotinylierte Antisense-Oligos zum Zelllysat gegeben, um gezielt die R-N-A-D-N-A-Komplexe von Interesse anzureichern; die erhaltenen Ergebnisse klären die Identität der genomischen Bindungsstellen von nicht-kodierenden R-N-A-Molekülen auf, basierend auf QPCR oder Hochdurchsatzsequenzierung. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie R-N-A-D-N-A-FISH besteht darin, dass CHIRP genomweite Karten der Bindungsstellen nicht-kodierender R-N-A-Moleküle mit nahezu basenpaarweiser Auflösung ermöglicht. Diese Methode kann uns helfen, zentrale Fragen im Bereich der nicht-kodierenden R-N-A-Moleküle zu beantworten, beispielsweise, wie die Rocs, R-N-A-Moleküle und männliche Fliegen die Dosiskompensation erreichen.Die Implikationen dieser Technik betreffen den Fortschritt hin zu Therapien von Erkrankungen, die mit nicht-kodierender Nukleinsäure in Verbindung stehen, da sie ein besseres Verständnis ermöglichen, wie nicht-kodierende RNA die Chromatinzustände und die Genexpression reguliert. Für dieses Chromatin-Isolationsverfahren mittels RNA-Reinigung, oder ChIRP-Experiment, werden 40 Millionen Zellen nach der Zentrifugation geerntet; das PBS wird dekantiert und die restliche Flüssigkeit vorsichtig unter Schrägstellung abgesaugt, wobei durch Antippen des Röhrchenbodens der Zellpellet gelöst wird. Frisch zubereitetes 1 %iges Glutaraldehyd wird hinzugefügt, wobei zunächst ein kleines Volumen verwendet wird, um den Zellpellet aufzulösen, dann auf das Gesamtvolumen aufgefüllt und durch Inversion gemischt. Die Vernetzung erfolgt 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem End-over-End-Schüttler oder Rotator. Die Vernetzungsreaktion wird durch Zugabe eines Zehntels des Volumens einer 1,25-molaren Glycinlösung gestoppt und weitere fünf Minuten bei Raumtemperatur auf dem Schüttler belassen; die Zellen färben sich dabei leuchtend orange.Als Nächstes bei 2000 RCF fünf Minuten lang zentrifugieren, das Überstandsvolumen dekantieren und den Überstand absaugen, dann das Pellet mit 20 Milliliter kaltem PBS waschen, erneut zentrifugieren, den Überstand absaugen und das gewaschene, vernetzte Pellet in kaltem PBS resuspendieren. Jedes Milliliter Zellen in ein Eppendorf-Röhrchen überführen und drei Minuten bei 2000 RCF und vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach der Zentrifugation mithilfe einer Pipettenspitze so viel PBS wie möglich vorsichtig entfernen.Blitzgefrieren Sie alle Zellpellets in flüssigem Stickstoff und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius unbegrenzt. Um das Zelllysat für ChIRP vorzubereiten, tauen Sie die gefrorenen, vernetzten Zellpellets bei Raumtemperatur auf. Klopfen Sie kräftig, um das Zellpellet zu lösen und zu vermischen.Zentrifugieren Sie die Pellets und verwenden Sie eine scharfe 10-Mikroliter-Pipettenspitze, um das restliche PBS auf einer elektronischen Waage, die auf ein Milligramm genau ist, zu entfernen. Wiegen Sie die Masse eines leeren Eppendorf-Gefäßes. Wiegen Sie jedes Pellet und notieren Sie dessen Gewicht.Gebe das 10fache Volumen eines Lysepuffers, der mit frischem Proteaseinhibitor PMSF und Super Ace ergänzt wurde, in jedes Röhrchen und resuspendiere das Pellet. Das Zelllysat muss unmittelbar nach seiner Herstellung verarbeitet werden. Überführe nicht mehr als 1,5 Milliliter Lysat in jedes 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen und setze die Beschallungsproben ein, indem du sie fest zuschraubst.Als Nächstes die Röhrchen in einen Bio-Ruptor geben, bei vier Grad Celsius auf höchster Stufe mit 30 Sekunden an und 45 Sekunden aus pulsierenden Intervallen beschallen. Den Lysat alle 30 Minuten überprüfen. Das Beschallen fortsetzen, bis der Zelllysat nicht mehr trüb ist.Dies kann je nach Anzahl der Röhrchen, Probenvolumen, Badtemperatur und Dauer der Beschallung zwischen 30 Minuten und vier Stunden dauern. Sobald das Lysat klar wird, überführen Sie fünf Mikroliter in ein neues Eppendorf-Röhrchen. Geben Sie DNA-Protease-K-Puffer und Protease K hinzu, wirbeln Sie zur Vermischung und zentrifugieren Sie kurz. Inkubieren Sie 45 Minuten bei 50 Grad Celsius, nachdem die DNA mit einem PCR-Reinigungskit extrahiert wurde.Überprüfen Sie die DNA-Größe in einem 1 %igen Agarosegel. Der Großteil des DNA-Smears sollte zwischen 100 und 500 Basenpaaren liegen, was auf eine vollständige Sonikation hinweist. Zentrifugieren Sie 1-Milliliter-Aliquote der sonizierten Proben bei 100 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, überführen Sie das Überstand in frische Eppendorf-Röhrchen und schockgefrieren Sie diese in flüssigem Stickstoff, um mit dem Verfahren für ChIRP zu beginnen. Tauen Sie die Chromatin-Röhrchen bei Raumtemperatur auf für eine typische ChIRP-Probe.Unter Verwendung von einem Milliliter Lyssat entnehmen Sie 10 Mikroliter für die RNA-Eingabe und 10 Mikroliter für die DNA-Eingabe und geben Sie diese in Einoor-Röhrchen. Bewahren Sie diese auf Eis auf, bis sie weiterverarbeitet werden. Überführen Sie ein Milliliter jeder Chromatinprobe in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen.Geben Sie zwei Milliliter Hybridisierungspuffer zu jedem Reaktionsgefäß hinzu. Anschließend tauen Sie die Sonden bei Raumtemperatur auf. Diese biotinylierten Kachel-Oligos sind gemäß ihrer Positionen entlang der RNA markiert und in zwei Pools getrennt.Der geraden Pool enthält alle Sonden mit geraden Nummern. Der ungeraden Pool enthält Sonden mit ungeraden Nummern. Alle Experimente werden unter Verwendung beider Pools durchgeführt, die jeweils als interne Kontrollen füreinander dienen.Einer der anspruchsvollsten Aspekte des eigentlichen Protokolls besteht darin, dass alle Hybridisierungs- und Waschschritte bei 37 Grad durchgeführt werden müssen. Um eine konstante Versuchstemperatur sicherzustellen, führen Sie alle Schritte in der Nähe oder innerhalb eines Hybridisierungsinkubators durch. Geben Sie das entsprechende Volumen an Sonden zu spezifischen Röhrchen hinzu. Gründlich mischen und vier Stunden bei 37 Grad unter Schütteln inkubieren, 20 Minuten vor Abschluss der Hybridisierung. Bereiten Sie die C-one-Magnetkugeln vor. Verwenden Sie 100 µL pro 100 pMol Sonden. Waschen Sie die Kugeln dreimal mit je einem Milliliter ungesupplementiertem Lysepuffer unter Verwendung des Dyna-Mag-2-Streifenmagneten, um die Kugeln vom Puffer zu trennen.Nach der letzten Waschung die Pellets erneut in dem ursprünglichen Volumen an Lysepuffer suspendieren und frisches PMSF sowie Proteaseinhibitor zugeben. Wenn die vierstündige Hybridisierungsreaktion abgeschlossen ist, 100 µL der Pellets zu jedem Ansatz hinzufügen. Ansätze gut 30 Minuten bei 37 °C unter Rütteln inkubieren und anschließend die Pellets mit einem Milliliter an vorgewärmtem Waschpuffer (37 °C) waschen.Verwenden Sie einen magnetischen Dyna Mag 15-Streifen, um die Kügelchen zu separieren, dekantieren und resuspendieren Sie sie in einem Milliliter Waschpuffer, überführen Sie sie in ein 1,5-Milliliter-EOR-Röhrchen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius unter Schütteln für fünf Minuten bei nachfolgenden Waschschritten, zentrifugieren Sie jedes Röhrchen in einer Minizentrifuge und stellen Sie die Probe für eine Minute auf einen magnetischen Dyna Mag 2-Streifen, dekantieren Sie die Probe. Wischen Sie eventuelle Tropfen mit einem Kim-Tuch ab und resuspendieren Sie in einem Milliliter.Puffer waschen, bei 37 Grad Celsius unter Schütteln fünf Minuten lang inkubieren. Wiederholen, insgesamt fünf Waschungen; bei der letzten Waschung resuspendieren. Die Kügelchen gut suspendieren, 100 Mikroliter abnehmen und für die RNA-Isolierung beiseitelegen, 900 Mikroliter für den DNA-Anteil reservieren.Stellen Sie alle Röhrchen auf den magnetischen Streifen des DynaMag-Röhrchenhalters und entfernen Sie den Waschpuffer. Nach einem kurzen Zentrifugationsschritt stellen Sie das Röhrchen erneut auf den Magnetstreifen und verwenden eine scharfe 10-Mikroliter-Pipettenspitze, um den restlichen Waschpuffer vollständig aus jedem Röhrchen zu entfernen.RNA- und DNA-Fraktionen werden anschließend aus den ChIRP-Proben zur Quantifizierung und Sequenzierung isoliert. Diese Abbildung zeigt die Anreicherung von humaner Telomerase, RNA oder Turk aus HELOC-Zellen im Vergleich zu GA dh. Eine reichlich vorhandene zelluläre RNA dient als negativer Kontrollwert.Der Großteil der im Zellinneren vorhandenen Turk-RNA, etwa 88 %, wurde mittels CHIRP angereichert, wohingegen nur 0,46 % der GAPDH-RNA gewonnen wurden, was einen Anreicherungsfaktor von etwa 200-fach zeigt. Unspezifische Sonden, wie Sonden, die gegen LACZ-RNA gerichtet sind – ein Molekül, das normalerweise nicht in Säugerzellen exprimiert wird –, können als zusätzliche negative Kontrollen verwendet werden. DNA-Regionen, von denen erwartet wird, dass sie an die Ziel-RNA binden. Längere nicht-kodierende RNAs sind typischerweise gegenüber negativen Regionen angereichert, wenn die Quantifizierung mittels qPCR erfolgt.Diese Abbildung zeigt die QPCR-Validierung von vier durch Hotair gebundenen Stellen in primären humanen Vorhautfibroblasten, die mittels ChIRP-SSE in derselben Zelllinie bestimmt wurden, wobei die DNA-Stellen von Turk und GA DH als negative Kontrollregionen dienen. Sowohl die geraden als auch die ungeraden Probensätze ergaben einen vergleichbaren Anreicherungsgrad der erwarteten, durch Hotair gebundenen Stellen gegenüber den negativen Regionen. Ein Kennzeichen echter Bindungsstellen langer nicht-kodierender RNA.Eine globale Karte der Bindungsstellen langer nicht-kodierender RNA kann durch Hochdurchsatzsequenzierung von CHIRP-angereichertem DNA erhalten werden, wie anhand dieser Daten von der langen nicht-kodierenden RNA *rocks two* veranschaulicht, von der bekannt ist, dass sie mit dem X-Chromosom in einer Weise interagiert, die für die Dosiskompensation erforderlich ist. Sowohl gerade als auch ungerade Proben wurden separat sequenziert, und ihre einzigartigen Hintergrundsignale wurden eliminiert, um eine Spur überlappender Signale zu erzeugen, wobei jeder Peak eine starke Bindungsstelle von *rocks two* anzeigt. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, eine korrekte RNase-freie Technik anzuwenden.Andere Methoden wie die Protein-Dot-Blot-Analyse können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welche Proteine mit der nicht-klinischen DRNA von Interesse nach ihrer Entstehung interagieren. CHI ebnete Forschern auf dem Gebiet der RNA-Biologie den Weg, die RN-Aktivität in Kulturzellen und fixierten Geweben abzubilden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier präsentieren wir eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) Verfahren zur genomweiten Ort Analyse von Protein-Isoformen, die in einer Histon-bindende Domäne unterscheiden. Wir wenden es ChIP-Seq-Analyse, um die Ziele des KDM5A/JARID1A/RBP2 Histon-Demethylase zu identifizieren.

Genomweite Analyse mittels ChIP zu Isoform-spezifische Gene-Targets zu identifizieren

Chromatin Interaction Analysis von Paired-End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) ist eine Methode...

Chromatin Interaction Analysis gepaart mit End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) zur Abbildung von Chromatin-Wechselwirkungen zu verstehen und Transkriptionsregulation

Wir beschreiben eine robuste Methode zur Chromatinimmunpräzipitation mit primären T-Zellen. Die Methode basiert auf Standard-Ansätzen gegründet, nutzt aber einen bestimmten Satz von Bedingungen und Reagenzien, die Effizienz für begrenzte Mengen von Zellen einer zu verbessern. Wichtig ist, dass auf eine detaillierte Beschreibung des Datenanalysephase dargestellt.

Effiziente Chromatin Immunopräzipitation mit limitierende Mengen an Biomasse

Die Kombination von Chromatinimmunpräzipitation und ultra-Sequenzierung mit hohem Durchsatz (Chip-seq) zu identifizieren und abzubilden Protein-DNA-Wechselwirkungen in einem bestimmten Gewebe oder Zelllinie. Skizziert ist, wie man eine hohe Qualität ChIP Vorlage für anschließende Sequenzierung mit Erfahrung mit dem Transkriptionsfaktor TCF7L2 als Beispiel zu generieren.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

Durch die Kombination von nativen und Vernetzungs Chromatinimmunpräzipitation mit hochauflösender Massenspektrometrie ermöglicht ChroP Ansatz, um die Verbund Proteom-Architektur der Histon-Modifikationen, Varianten und Nicht-Histon-Proteine ​​synergizing bei funktionell unterschiedlichen Chromatindomänen sezieren.

Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

Die Identifizierung von Molekülen, die mit spezifischen genomischen Regionen von Interesse assoziiert sind, ist erforderlich, um die Mechanismen der Regulation der Funktionen dieser Regionen zu verstehen. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Durchführung einer technischen DNA-bindenden Molekül-vermittelten Chromatin-Imunopräzipitation (enChIP) zur Identifizierung von Proteinen und RNAs, die mit einer bestimmten genomischen Region assoziiert sind.

Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP

Hier beschreiben wir eine Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) und ChIP-Seq Bibliothek Vorbereitung Protokoll zum globalen epigenomischen Profile aus Low-Fülle Huhn embryonalen Proben zu generieren.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben

Hier beschreiben wir Methoden zum Ausführen von ChIP-Seq und CARIP-FF, einschließlich der Bibliothek Vorbereitung auf Next Generation Sequencing, global epigenomischen und Chromatin-assoziierter RNA zu generieren-Karten von ES-Zellen.

CARIP-Seq und ChIP-Seq: Methoden zur Ermittlung von Chromatin-assoziierter RNA und Protein-DNA-Wechselwirkungen in embryonale Stammzellen

Wir beschreiben eine Schritt für Schritt Protokoll für Tandem Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (tChIP-Seq), die es die Analyse der Zelle-typspezifischen genomweite Histon-Modifikation ermöglicht.

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenom Profilierung

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Chromatinpräparation aus tiefgefrorenem Gewebe und eignet sich für die Vernetzung der Chromatin-Immunpräzipitation (X-ChIP), gefolgt von einer quantitativen PCR-Analyse (X-ChIP-qPCR) oder einem Next-Generation-Sequencing-Ansatz (X-ChIP-seq).

Chromatinextraktion aus gefrorenem chimärem Lebergewebe für die Chromatin-Immunpräzipitationsanalyse

Lernen Sie die ChIRP-Methode zur Kartierung genomischer Bindungsstellen von langen nicht-kodierenden RNAs. Diese Technik nutzt biotinylierte Antisense-Oligonukleotide für hochspezifische Analysen.

Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

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