Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, DNA-Bereiche zu identifizieren, die mit einer bestimmten nicht-kodierenden RNS assoziiert sind, und zwar mithilfe von QPCR oder Hochdurchsatzsequenzierung. Dies wird erreicht, indem Zellen vernetzt werden, um native DNA-RNS-Interaktionen in vivo festzuhalten. In einem zweiten Schritt werden die Zellen lysiert und einer Sonifikation unterzogen, um das Zelllysat zu solubilisieren und die Chromatinstruktur in kleine Fragmente zu zerlegen.

Anschließend werden biotinylierte Antisense-Oligos zum Zelllysat gegeben, um gezielt die R-N-A-D-N-A-Komplexe von Interesse anzureichern; die erhaltenen Ergebnisse klären die Identität der genomischen Bindungsstellen von nicht-kodierenden R-N-A-Molekülen auf, basierend auf QPCR oder Hochdurchsatzsequenzierung. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie R-N-A-D-N-A-FISH besteht darin, dass CHIRP genomweite Karten der Bindungsstellen nicht-kodierender R-N-A-Moleküle mit nahezu basenpaarweiser Auflösung ermöglicht. Diese Methode kann uns helfen, zentrale Fragen im Bereich der nicht-kodierenden R-N-A-Moleküle zu beantworten, beispielsweise, wie die Rocs, R-N-A-Moleküle und männliche Fliegen die Dosiskompensation erreichen.

Die Implikationen dieser Technik betreffen den Fortschritt hin zu Therapien von Erkrankungen, die mit nicht-kodierender Nukleinsäure in Verbindung stehen, da sie ein besseres Verständnis ermöglichen, wie nicht-kodierende RNA die Chromatinzustände und die Genexpression reguliert. Für dieses Chromatin-Isolationsverfahren mittels RNA-Reinigung, oder ChIRP-Experiment, werden 40 Millionen Zellen nach der Zentrifugation geerntet; das PBS wird dekantiert und die restliche Flüssigkeit vorsichtig unter Schrägstellung abgesaugt, wobei durch Antippen des Röhrchenbodens der Zellpellet gelöst wird. Frisch zubereitetes 1 %iges Glutaraldehyd wird hinzugefügt, wobei zunächst ein kleines Volumen verwendet wird, um den Zellpellet aufzulösen, dann auf das Gesamtvolumen aufgefüllt und durch Inversion gemischt. Die Vernetzung erfolgt 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem End-over-End-Schüttler oder Rotator. Die Vernetzungsreaktion wird durch Zugabe eines Zehntels des Volumens einer 1,25-molaren Glycinlösung gestoppt und weitere fünf Minuten bei Raumtemperatur auf dem Schüttler belassen; die Zellen färben sich dabei leuchtend orange.

Als Nächstes bei 2000 RCF fünf Minuten lang zentrifugieren, das Überstandsvolumen dekantieren und den Überstand absaugen, dann das Pellet mit 20 Milliliter kaltem PBS waschen, erneut zentrifugieren, den Überstand absaugen und das gewaschene, vernetzte Pellet in kaltem PBS resuspendieren. Jedes Milliliter Zellen in ein Eppendorf-Röhrchen überführen und drei Minuten bei 2000 RCF und vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach der Zentrifugation mithilfe einer Pipettenspitze so viel PBS wie möglich vorsichtig entfernen.

Blitzgefrieren Sie alle Zellpellets in flüssigem Stickstoff und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius unbegrenzt. Um das Zelllysat für ChIRP vorzubereiten, tauen Sie die gefrorenen, vernetzten Zellpellets bei Raumtemperatur auf. Klopfen Sie kräftig, um das Zellpellet zu lösen und zu vermischen.

Zentrifugieren Sie die Pellets und verwenden Sie eine scharfe 10-Mikroliter-Pipettenspitze, um das restliche PBS auf einer elektronischen Waage, die auf ein Milligramm genau ist, zu entfernen. Wiegen Sie die Masse eines leeren Eppendorf-Gefäßes. Wiegen Sie jedes Pellet und notieren Sie dessen Gewicht.

Gebe das 10fache Volumen eines Lysepuffers, der mit frischem Proteaseinhibitor PMSF und Super Ace ergänzt wurde, in jedes Röhrchen und resuspendiere das Pellet. Das Zelllysat muss unmittelbar nach seiner Herstellung verarbeitet werden. Überführe nicht mehr als 1,5 Milliliter Lysat in jedes 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen und setze die Beschallungsproben ein, indem du sie fest zuschraubst.

Als Nächstes die Röhrchen in einen Bio-Ruptor geben, bei vier Grad Celsius auf höchster Stufe mit 30 Sekunden an und 45 Sekunden aus pulsierenden Intervallen beschallen. Den Lysat alle 30 Minuten überprüfen. Das Beschallen fortsetzen, bis der Zelllysat nicht mehr trüb ist.

Dies kann je nach Anzahl der Röhrchen, Probenvolumen, Badtemperatur und Dauer der Beschallung zwischen 30 Minuten und vier Stunden dauern. Sobald das Lysat klar wird, überführen Sie fünf Mikroliter in ein neues Eppendorf-Röhrchen. Geben Sie DNA-Protease-K-Puffer und Protease K hinzu, wirbeln Sie zur Vermischung und zentrifugieren Sie kurz. Inkubieren Sie 45 Minuten bei 50 Grad Celsius, nachdem die DNA mit einem PCR-Reinigungskit extrahiert wurde.

Überprüfen Sie die DNA-Größe in einem 1 %igen Agarosegel. Der Großteil des DNA-Smears sollte zwischen 100 und 500 Basenpaaren liegen, was auf eine vollständige Sonikation hinweist. Zentrifugieren Sie 1-Milliliter-Aliquote der sonizierten Proben bei 100 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, überführen Sie das Überstand in frische Eppendorf-Röhrchen und schockgefrieren Sie diese in flüssigem Stickstoff, um mit dem Verfahren für ChIRP zu beginnen. Tauen Sie die Chromatin-Röhrchen bei Raumtemperatur auf für eine typische ChIRP-Probe.

Unter Verwendung von einem Milliliter Lyssat entnehmen Sie 10 Mikroliter für die RNA-Eingabe und 10 Mikroliter für die DNA-Eingabe und geben Sie diese in Einoor-Röhrchen. Bewahren Sie diese auf Eis auf, bis sie weiterverarbeitet werden. Überführen Sie ein Milliliter jeder Chromatinprobe in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen.

Geben Sie zwei Milliliter Hybridisierungspuffer zu jedem Reaktionsgefäß hinzu. Anschließend tauen Sie die Sonden bei Raumtemperatur auf. Diese biotinylierten Kachel-Oligos sind gemäß ihrer Positionen entlang der RNA markiert und in zwei Pools getrennt.

Der geraden Pool enthält alle Sonden mit geraden Nummern. Der ungeraden Pool enthält Sonden mit ungeraden Nummern. Alle Experimente werden unter Verwendung beider Pools durchgeführt, die jeweils als interne Kontrollen füreinander dienen.

Einer der anspruchsvollsten Aspekte des eigentlichen Protokolls besteht darin, dass alle Hybridisierungs- und Waschschritte bei 37 Grad durchgeführt werden müssen. Um eine konstante Versuchstemperatur sicherzustellen, führen Sie alle Schritte in der Nähe oder innerhalb eines Hybridisierungsinkubators durch. Geben Sie das entsprechende Volumen an Sonden zu spezifischen Röhrchen hinzu. Gründlich mischen und vier Stunden bei 37 Grad unter Schütteln inkubieren, 20 Minuten vor Abschluss der Hybridisierung.

Bereiten Sie die C-one-Magnetkugeln vor. Verwenden Sie 100 µL pro 100 pMol Sonden. Waschen Sie die Kugeln dreimal mit je einem Milliliter ungesupplementiertem Lysepuffer unter Verwendung des Dyna-Mag-2-Streifenmagneten, um die Kugeln vom Puffer zu trennen.

Nach der letzten Waschung die Pellets erneut in dem ursprünglichen Volumen an Lysepuffer suspendieren und frisches PMSF sowie Proteaseinhibitor zugeben. Wenn die vierstündige Hybridisierungsreaktion abgeschlossen ist, 100 µL der Pellets zu jedem Ansatz hinzufügen. Ansätze gut 30 Minuten bei 37 °C unter Rütteln inkubieren und anschließend die Pellets mit einem Milliliter an vorgewärmtem Waschpuffer (37 °C) waschen.

Verwenden Sie einen magnetischen Dyna Mag 15-Streifen, um die Kügelchen zu separieren, dekantieren und resuspendieren Sie sie in einem Milliliter Waschpuffer, überführen Sie sie in ein 1,5-Milliliter-EOR-Röhrchen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius unter Schütteln für fünf Minuten bei nachfolgenden Waschschritten, zentrifugieren Sie jedes Röhrchen in einer Minizentrifuge und stellen Sie die Probe für eine Minute auf einen magnetischen Dyna Mag 2-Streifen, dekantieren Sie die Probe. Wischen Sie eventuelle Tropfen mit einem Kim-Tuch ab und resuspendieren Sie in einem Milliliter.

Puffer waschen, bei 37 Grad Celsius unter Schütteln fünf Minuten lang inkubieren. Wiederholen, insgesamt fünf Waschungen; bei der letzten Waschung resuspendieren. Die Kügelchen gut suspendieren, 100 Mikroliter abnehmen und für die RNA-Isolierung beiseitelegen, 900 Mikroliter für den DNA-Anteil reservieren.

Stellen Sie alle Röhrchen auf den magnetischen Streifen des DynaMag-Röhrchenhalters und entfernen Sie den Waschpuffer. Nach einem kurzen Zentrifugationsschritt stellen Sie das Röhrchen erneut auf den Magnetstreifen und verwenden eine scharfe 10-Mikroliter-Pipettenspitze, um den restlichen Waschpuffer vollständig aus jedem Röhrchen zu entfernen.

RNA- und DNA-Fraktionen werden anschließend aus den ChIRP-Proben zur Quantifizierung und Sequenzierung isoliert. Diese Abbildung zeigt die Anreicherung von humaner Telomerase, RNA oder Turk aus HELOC-Zellen im Vergleich zu GA dh. Eine reichlich vorhandene zelluläre RNA dient als negativer Kontrollwert.

Der Großteil der im Zellinneren vorhandenen Turk-RNA, etwa 88 %, wurde mittels CHIRP angereichert, wohingegen nur 0,46 % der GAPDH-RNA gewonnen wurden, was einen Anreicherungsfaktor von etwa 200-fach zeigt. Unspezifische Sonden, wie Sonden, die gegen LACZ-RNA gerichtet sind – ein Molekül, das normalerweise nicht in Säugerzellen exprimiert wird –, können als zusätzliche negative Kontrollen verwendet werden. DNA-Regionen, von denen erwartet wird, dass sie an die Ziel-RNA binden. Längere nicht-kodierende RNAs sind typischerweise gegenüber negativen Regionen angereichert, wenn die Quantifizierung mittels qPCR erfolgt.

Diese Abbildung zeigt die QPCR-Validierung von vier durch Hotair gebundenen Stellen in primären humanen Vorhautfibroblasten, die mittels ChIRP-SSE in derselben Zelllinie bestimmt wurden, wobei die DNA-Stellen von Turk und GA DH als negative Kontrollregionen dienen. Sowohl die geraden als auch die ungeraden Probensätze ergaben einen vergleichbaren Anreicherungsgrad der erwarteten, durch Hotair gebundenen Stellen gegenüber den negativen Regionen. Ein Kennzeichen echter Bindungsstellen langer nicht-kodierender RNA.

Eine globale Karte der Bindungsstellen langer nicht-kodierender RNA kann durch Hochdurchsatzsequenzierung von CHIRP-angereichertem DNA erhalten werden, wie anhand dieser Daten von der langen nicht-kodierenden RNA *rocks two* veranschaulicht, von der bekannt ist, dass sie mit dem X-Chromosom in einer Weise interagiert, die für die Dosiskompensation erforderlich ist. Sowohl gerade als auch ungerade Proben wurden separat sequenziert, und ihre einzigartigen Hintergrundsignale wurden eliminiert, um eine Spur überlappender Signale zu erzeugen, wobei jeder Peak eine starke Bindungsstelle von *rocks two* anzeigt. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, eine korrekte RNase-freie Technik anzuwenden.

Andere Methoden wie die Protein-Dot-Blot-Analyse können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welche Proteine mit der nicht-klinischen DRNA von Interesse nach ihrer Entstehung interagieren. CHI ebnete Forschern auf dem Gebiet der RNA-Biologie den Weg, die RN-Aktivität in Kulturzellen und fixierten Geweben abzubilden.