Name: Endothelialisierten Mikrofluidik für ein Studium Mikrovaskuläre Wechselwirkungen in Hämatologische Krankheiten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Erfahren Sie die Kultivierung endothelialer Zellschichten in mikrofluidischen Geräten zur Untersuchung mikrovaskulärer Wechselwirkungen bei hämatologischen Erkrankungen. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle biologischer Bedingungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken T. Hunt, M. Rosenbluth, und das Lam-Lab für ihre Ratschläge und nützliche Diskussionen. Wir erkennen die Unterstützung von G. Spinner und dem Institut für Elektronik und Nanotechnologie an der Georgia Institute of Technology. Finanzielle Unterstützung für diese Arbeit wurde durch ein NIH-K08 HL093360, UCSF REAC award, einem der NIH Nanomedizin Development Center Award PN2EY018244, und die Finanzierung aus dem Zentrum für Endothelial Cell Biology von Kinder-Healthcare von Atlanta zur Verfügung gestellt.

1. Fabrication der endothelialen Microdevice <ol><li> Erstellen Sie eine Photomaske durch die Vorlage eines computerunterstützten Konstruktion (CAD) Zeichnung des Mikrofluidik-Vorrichtung an einen externen Anbieter Maske. Die verwendete Maske wurde von einer Chromschicht auf Kalk-Natron-Glas besteht. In diesem Fall wird Mikrofluidkanal Breite betrug 30 um. </li><li> Reinigen einer nackten Silizium-Wafer mit Piranha (10:1 Verhältnis von Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid) für 15 Minuten und tauchen in Flusssäure für 30 Sekunden. Spülen mit deionisiertem Wasser (DI) für ca. 10 Sekunden. </li><li> Verwendung eines Spin-Coater, Spin Microchem SU-8-2025 Photoresist auf den Wafer zu einer Höhe von 30 um. Für SU-8 2025, ist ein Spin Drehzahl von 3000 min empfohlen. Andere Viskositäten von SU-8 zur Verfügung, wird diese Höhe zu erreichen. Eine vollständige Anleitung für SU-8-Einsatz sind verfügbar unter <a href="http://www.microchem.com" target="_blank">www.microchem.com</a> </li><li> Setzen Sie den Wafer mit SU-8 auf einer Heizplatte bei 95 ° C für5 Minuten zu verjagen überschüssiges Lösungsmittel. Hinweis: Ein Ofen wird der Wafer anders trocknen als eine Kochplatte und wird nicht empfohlen. </li><li> Platzieren Sie eine Maske mit dem gewünschten Feature Form über den Wafer, und UV-Licht bestrahlen (160 mJ / cm 2 gemessen bei 365 nm) in einem Mask Aligner (Karl Süss, MA-6). Dieses Kreuz verbindet den Fotolack. </li><li> Legen Sie die Wafer-Rückseite auf einer Heizplatte bei 95 ° C für weitere 5 Minuten weiter beschleunigen die Polymerisation von SU-8. </li><li> Tauchen des Wafers in SU-8-Entwickler, in erster Linie aus PGMEA (Propylenglykolmethylether Acetat) für 4 Minuten zusammen, um den nicht-vernetzten SU-8 zu entfernen. </li><li> Spülen Sie die neu entwickelten Wafer mit 100% Isopropylalkohol (IPA) für 10 s. Der Wafer kann dann unter Verwendung unter Druck stehendem Stickstoff oder indem man das Lösungsmittel aus der Wafer in einem sauberen Abzug, der für mehrere Minuten zu verdampfen. </li><li> Band die Ränder des getrockneten Wafer mit strukturiertem SU-8 in eine Petrischale vorabentlüften Bewegung. </li><li> Bewerben 1 mL Sigmacote auf dem Wafer mit einer Pipette, decken mit der Spitze der Petrischale, und wirbeln Wafer, um eine vollständige Beschichtung der Wafer sicherzustellen, Deckel abnehmen und erlauben Wafer für einige Minuten trocknen lassen, bis alle Lösungsmittel verdampft ist. </li></ol> 2. PDMS (Polydimethylsiloxan) Herstellung <ol><li> Mix PDMS Polymer und Härter im Verhältnis 10:1 (w / w) und Luftblasen mit einem Vakuumexsikkator getrocknet. Die erforderliche Zeit zum Entgasen des PDMS variiert je nach der Stärke des zur Verfügung Vakuumsystem, jedoch typischerweise im Bereich von mehreren Minuten bis eine Stunde. Für ein sechs Zoll Petrischale ohne zuvor ausgegossenen PDMS ist ein Gesamtvolumen von 60 ml des Polymers wird empfohlen. </li><li> Die Mischung auf den Wafer, etwa 5 mm dick. Auch auf einen flachen Teller gießen unten auf eine dünne Folie aus PDMS zu schaffen, etwa 1 mm dick. Härten bei 60 ° C in einem Ofen über Nacht. </li><li> Mit einem Messer oder Skalpell ausgeschnitten rund um die cured PDMS-Gerät und entfernen Sie sie aus dem Wafer. Darüber hinaus schneiden eine dünne Folie aus PDMS geringfügig größer als der Vorrichtung. </li><li> Erstellen Sie Ein-und Auslass Löcher in der PDMS-Gerät mit einem 1,0 mm Lochung. Dies kann unter Verwendung entweder einen Stift Laster, Harris Uni-Core oder ähnlichen Vorrichtung. </li><li> Reinigen Sie die Oberflächen des Gerätes und das Blatt mit Tesafilm. </li><li> Verwendung einer Plasma-Reiniger, freizulegen die Oberflächen der Vorrichtung und PDMS PDMS Datenblatt an Sauerstoffplasma für 30 s. Die Sauerstoff-Plasma erzeugt reaktiven Spezies auf der freiliegenden Oberfläche des PDMS, die darstellt, wenn in körperlichen Kontakt gebracht. </li><li> Verbinden kleiner Schlauch mit einer geringen Länge (einige Zentimeter) mit großem Schläuche, die wiederum mit einer Spritze mit einer stumpfen-Punktnadel verbunden ist, mit 50 ug / ml Fibronectin aus Humanplasma in PBS gefüllt. Der Schlauch und die Nadel sind so bemessen, dass ein Reibschluss zwischen dem Rohr erzeugt wird. Legen kleinere Rohre mit dem Einlass des PDMS und eine Mikrovorrichtungpply Druck auf der Spritze, um die Kanäle ganz mit Fibronectin-Lösung und einen kleinen Tropfen 100 ul an der Auslaßöffnung zu schaffen, um sicherzustellen, dass die Kanäle nassen bleiben. Inkubieren Sie das Gerät bei 37 ° C für 40-60 min. </li><li> Schließen Sie eine frische Spritze mit PBS auf die stumpfe Spitze Nadel gefüllt. Üben Sie Druck auf die Spritze, um das Gerät mit PBS spülen. </li></ol> 3. Seeding der Mikrofluidik-Vorrichtung mit Endothelzellen <ol><li> Planen 1.000.000 Zellen / ml menschlichen Endothelzellen der Nabelvene (HUVECs) in endothelialen Wachstumsfaktor Medien mit 8% Dextran. Ein Bereich von 500.000 bis 2.000.000 Zellen / ml wurde erfolgreich verwendet. Die Zugabe von Dextran in die Zelle Ladehilfsmittel erhöht die Viskosität des Fluids, das die Geschwindigkeit von Endothelzellen abnimmt, wenn sie die Fibronectin-beschichteten mikrofluidischen System eingeben. Dies wiederum erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die Zellen anhaften und Kultur erfolgreich in der Mikrovorrichtung. </li><li> Cchließen Sie den neuen Spritze und Schlauch, wie in Schritt 2.7. jedoch mit einem längeren Schlauch (ca. 1 Meter in der Länge). </li><li> Um die Leistungsfähigkeit dieses Systems zu optimieren, ist es wichtig, an dieser Stelle auf eventuelle Lecks oder Blasen in der gesamten Perfusion Systems zu verhindern, jedes Austreten von Lösung oder das Vorhandensein von Blasen in den Medien wird die Strömung verändern und verhindern, dass erfolgreiche Aussaat der Endothelzellen. Daher ist eng anliegend des Schlauchs wesentlichen um eine Leckage zwischen allen Anschlüssen zu beseitigen. Blasen, die in der Spritze und / oder der Schlauch zu machen, bevor Zellen in der Mikrovorrichtung eingeführt werden und die gesamte Perfusionssystem sollte mit der Zelle Lösung vor dem Anbringen des Schlauchs mit der mikrofluidischen, um die Einführung von Luftblasen zu vermeiden grundiert werden. </li><li> Verwendung einer Spritzenpumpe infundieren Zellsuspension in PDMS Gerät Volumenstrom von 1,23 ml / min für 2 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. Optimale Ergebnisse wurden erzielt, wenn die Spritzenpumpe war beim<html> gleicher Höhe wie der PDMS-Gerät. Für den Zulauf sorgt die längeren Schlauch, der innerhalb des Inkubators werden kann gewickelt, dass die Zellen und Medien ausreichend sind, bevor er in Kontakt mit der Vorrichtung erwärmt. In unserem System nähert sich die volumetrische Strömungsrate von 1,23 ml / min ein Midstream Geschwindigkeit von ~ 1 mm / s in den kleinsten Mikrokanäle, entsprechend einer Wandschubspannung ~ 1 Dyn / cm 2 bei dieser Kanäle mit Vollblut. </li><li> Mit der gleichen Spritzenpumpe und lange Schläuche, perfuse frische Nährböden für 2-8 Tage bei-Verhältnis von 1,23 ml / min. Eine erfolgreiche Gerät wird eine Monoschicht von Endothel-Zellen, die auf der Innenseite der Vorrichtung innerhalb von 24-48 Stunden. Frühere Experimente haben gezeigt, dass konfluente Monolayer angemessen äußern VE-Cadherin an Zell-Zell-Verbindungen in der gesamten Einrichtung 14. </li><li> Injizieren von Blut oder Zellsuspension in das System für Experimente. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse _content &quot;&gt; Unter Verwendung dieses Protokolls Standard lithographischen Mikrofertigungstechniken verwendet werden, um die Form benötigt, um die mikrofluidischen Kanälen, die physiologisch imitieren die sizescale des Mikrovaskulatur (Abbildung 1A) produzieren zu schaffen. Mit Hilfe eines optimierten Perfusionstechnik, Endothelzellen dann Saatgut und die Kultur konfluent gesamten Innenfläche des mikrofluidischen Systems innerhalb von 24-48 Stunden nach dem Aussähen der Zellen (1B). Da die Mikrofluidik-System transparent ist, kann die gesamte Mikrovorrichtung auf einem Hellfeld / Fluoreszenz-Mikroskops zum Abbilden und Datensammlung gespeichert. Unser System kann dann angewendet, um hämatologische Erkrankungen, die biophysikalischen Eigenschaften, wie zB Sichelzellenanämie, in dem die erhöhte Steifigkeit des sichelförmigen Erythrozyten und Leukozyten und Endothel-aberranten Haftung auf mikrovaskulärer Obstruktion beitragen verändert beinhaltet die Untersuchung werden. Eine klinisch zugelassenes Medikament, Hydroxyurea, lindert Symptome, sondern seine dDirekten Einfluss auf mikrovaskulären Flusses ist nicht bekannt. Unser Test berücksichtigt sowohl Zell-Adhäsion und Steifigkeit, und zeigt, dass Hydroxyurea deutlich bessert Strömung in Sichelzellanämie (Abbildung 2). Sichelzellenanämie ist nur ein Beispiel einer Anwendung für die Mikrovaskulatur-on-a-Chip, wie dieses System ideal geeignet ist, jede hämatologischen Verfahren, bei dem Blutzellen miteinander interagieren und Endothelzellen in der Mikrovaskulatur studieren. Andere klinisch relevante Anwendungen sind entzündliche Erkrankungen, Sepsis / Lungenschädigung, thrombotische Mikroangiopathie, Malaria und Krebs Metastasen, während mehr Basisanwendungen Leukozyten Biologie und hämatopoetischen Stammzellen Zellbiologie, unter vielen anderen auch. <img src="/files/ftp_upload/3958/3958fig1.jpg" alt="1"/> Abbildung 1. A) das Anfangskapital PDMS Mikrofluidikvorrichtung vor Endothelialisierung. Hier wird die Mikrovorrichtung nämlich injizierth Lebensmittelfarbe sizescale und der Gesamtaufbau des Systems darzustellen. B) Hellfeldmikroskopie zeigt die Mikrofluidik-System ist komplett innerhalb von 48 Stunden Zellaussaat endothelialisiert unter Verwendung des Protokolls beschrieben. <img src="/files/ftp_upload/3958/3958fig2.jpg" alt="2"/> Abbildung 2. A) Der Mikrovaskulatur-on-a-Chip mit Mikrokanälen in etwa der Größe der postkapillären Venolen (30 um), dem Ort der meisten Sichelzellenanämie mikrovaskulären obstruktiven Ereignissen. Vollblut aus Sichelzellanämie Patienten, die Hydroxyurea und von Patienten ohne Hydroxyurea wird durch zwei verschiedene Mikrovaskulatur-on-a-Chip-Geräte geflossen. B) Vollblut aus Sichelzellanämie Patienten, die Hydroxyurea Strömungen mit relativer Leichtigkeit in den endothelialisierten Mikrokanäle. C) Unter den gleichen Vorraussetzungen, Vollblut aus Sichelzellanämie Patienten ohne Hydroxyharnstoff zeigt jedoch viel mehr träge Strömung mit microchAnnel Obstruktion. Der untere Kanal vollständig mit keiner Strömung behindert und die Strömungsgeschwindigkeiten in den anderen endothelialisierten Mikrokanäle sind deutlich geringer als in der Hydroxyharnstoff Zustand. Der Balken in allen drei Bildern ist 30 um.

<ol><li>Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Level+of+Laboratory+Testing+Required+for+Diagnosis+or+Exclusion+of+a+Platelet+Function+Disorder+Using+Platelet+Aggregation+and+Secretion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Thromb.+Hemost%22%5BJournal%5D)">The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays.</a> Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).</li>
<li>Young, E. W. K., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+microfluidic+cell+culture+in+controlled+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments.</a> Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).</li>
<li>Young, E. W. K., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macro-+microscale+fluid+flow+systems+for+endothelial+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Macro- microscale fluid flow systems for endothelial cell biology.</a> Lab on a Chip. 10, 143-160 (2010).</li>
<li>Higgins, J. M., Eddington, D. T., Bhatia, S. N., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+cell+vasoocclusion+and+rescue+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sickle cell vasoocclusion and rescue in a microfluidic device.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 20496-20500 (2007).</li>
<li>Rosano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physiologically+realistic+in+vitro+model+of+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).</li>
<li>Meer, A. D. vander, Poot, A. A., Duits, M. H. G., Feijen, J., Vermes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Technology+in+Vascular+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Technology in Vascular Research.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).</li>
<li>Karunarathne, W., Ku, C. -J., Spence, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dual+nature+of+extracellular+ATP+as+a+concentration-dependent+platelet+P2X1+agonist+and+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">The dual nature of extracellular ATP as a concentration-dependent platelet P2X1 agonist and antagonist.</a> Integrative Biology. 1, 655-663 (2009).</li>
<li>Kotz, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+microfluidics+for+neutrophil+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical microfluidics for neutrophil genomics and proteomics.</a> Nat. Med. 16, 1042-1047 (2010).</li>
<li>Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+cell+mechanics+in+hematologic+diseases+with+microfluidic+biophysical+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry.</a> Lab on a Chip. 8, 1062-1070 (2008).</li>
<li>Shelby, J. P., White, J., Ganesan, K., Rathod, P. K., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+model+for+single-cell+capillary+obstruction+by+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14618-14622 (1073).</li>
<li>Borenstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+endothelialized+microvascular+networks+with+circular+cross-sections+in+a+tissue+culture+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Functional endothelialized microvascular networks with circular cross-sections in a tissue culture substrate.</a> Biomedical Microdevices. 12, 71-79 (2010).</li>
<li>Nesbitt, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shear+gradient-dependent+platelet+aggregation+mechanism+drives+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation.</a> Nat. Med. 15, 665-673 (2009).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).</li>
<li>Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+the+microvascular+occlusion+and+thrombosis+that+occur+in+hematologic+diseases+using+microfluidic+technology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology.</a> The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Green, D. A., Murphy, W. G., Uttley, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemolytic+uraemic+syndrome%3A+prognostic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Laboratory+Haematology%22%5BJournal%5D)">Haemolytic uraemic syndrome: prognostic factors.</a> Clinical & Laboratory Haematology. 22, 11-14 (2000).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Unsere endothelialisierten Kleinstgerätes System eignet sich am besten in Verbindung mit in-vivo-Experimenten verwendet und seine reduktionistische Ansatz kann dazu beitragen, Aufklärung der biophysikalischen Mechanismen von hämatologischen Prozesse, die beim Menschen und im Tiermodell beobachtet werden. Darüber hinaus ist unser System nicht ohne Einschränkungen. Zum Beispiel sind unsere mikrofluidischen Kanälen im Querschnitt quadratisch. Obwohl technisch kreisförmigen Mikrokanäle 10,11 hergestellt ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> stumpfer Spitze Nadel </td><td> OK International </td><td> 920.050-TE </td><td> Präzisions-TE Nadel 20 Gauge x 1/2 &quot;, pink </td></tr><tr><td> Dextran </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 31392 </td><td></td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0895 </td><td></td></tr><tr><td> Locher (Bohrfutterhalters) </td><td> Technische Innovationen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Humane Nabelschnur-Endothelzellen (HUVECs) </td><td> Lonza </td><td> CC-2519 </td><td></td></tr><tr><td> Plasma cleaner </td><td> Plasma </td><td> PDC-326 </td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS) </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9285739 </td><td> Sylgard 184 Siliconelastomer KIT </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> SL2 </td><td></td></tr><tr><td> SU-8-2025 </td><td> Microchem </td><td> Y111069 </td><td></td></tr><tr><td> SU-8-Entwickler </td><td> Microchem </td><td> Y020100 </td><td></td></tr><tr><td> Spritzenpumpe </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-3008 </td><td> PHD-ULTRA </td></tr><tr><td> Schlauch (größeren) </td><td> Cole-Parmer Instrument Company </td><td> 06418-02 </td><td> Tygonreg Microbore Schläuche, 0,020 &quot;ID x 0.060&quot; OD </td></tr><tr><td> Schlauch (kleiner) </td><td> Cole-Parmer Instrument Company </td><td> 06417-11 </td><td> PTFE-Schläuche Microbore, 0,012 &quot;ID x 0.030&quot; OD </td></tr></tbody></table>

endothelialisierten mikrofluidik für ein studium mikrovaskuläre wechselwirkungen in hämatologische krankheiten

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in Mikrofabrikationstechniken haben die Produktion von kostengünstigen und reproduzierbaren mikrofluidischen Systemen für die Durchführung von biologischen und biochemischen Experimenten auf der Mikro-und nanoskaligen 1,2 aktiviert. Darüber hinaus haben Mikrofluidik ebenfalls speziell verwendet, um quantitativ zu analysieren hämatologischen und mikrovaskulären Verfahren, wegen ihrer Fähigkeit, eine einfache Steuerung der dynamischen Strömungsumgebung und biologischen Bedingungen 3-6. Als solche haben die Forscher in jüngerer Zeit mikrofluidischen Systemen verwendet werden, um Blutkörperchen Verformbarkeit, Blutkörperchen Aggregation, mikrovaskuläre Blutfluss und Blutkörperchen-Endothelzell-Interaktionen 6-13 studieren. Allerdings sind diese mikrofluidischen Systemen entweder gar nicht zählen kultivierten Endothelzellen waren größer oder als die sizescale relevanten mikrovaskulären pathologischen Prozessen. Ein mikrofluidischen Plattform mit kultivierten Endothelzellen, dass genau rekapituliert die zelluläre, physikalischen und hemodynAmic Umfeld der Mikrozirkulation wird benötigt, um unser Verständnis der zugrunde liegenden biophysikalischen Pathophysiologie von hämatologischen Erkrankungen, die eine erneute Mikrovaskulatur. Hier berichten wir über eine Methode, um eine &quot;endothelialisierten&quot; In-vitro-Modell der Mikrovaskulatur erstellen, mit Hilfe eines einfachen, einzigen Maske Mikrofabrikationsprozessen in Verbindung mit Standard Endothelzellkultur Techniken, zu pathologischen mikrovaskulären biophysikalischen Interaktionen, die in hämatologischen Erkrankungen auftreten, zu studieren. Diese &quot;Mikrovaskulatur-on-a-Chip&quot; bietet die Forscher mit einem robusten Assay, die eng kontrolliert biologischem sowie biophysikalischen Bedingungen und wird mit einer Standard-Spritzenpumpe und Hellfeld / Fluoreszenzmikroskopie. Parameter wie mikrozirkulatorischen Vorraussetzungen, Endothelzellen Typ, Blut Zelltyp (en) und Konzentration (en), Arzneimittel / Hemmkonzentration usw., sind bequem gesteuert. Als solche bietet unser Mikrosystemtechnikeine Methode, um quantitativ zu untersuchen Krankheit Prozesse, in denen mikrovaskulären Flusses aufgrund der Veränderungen von Zell-Adhäsion, Aggregation und Verformbarkeit, eine Fähigkeit, nicht verfügbar mit den bestehenden Assays beeinträchtigt wird.

Verfahren zur Kultur von Endothelzellen eine Monoschicht der gesamten inneren Oberfläche des 3D einer Mikrofluidikvorrichtung mit mikrovaskulären großen Kanälen (&lt;30 um) beschrieben. Dies<em&gt; In-vitro-</em&gt; Mikrovaskulatur Modell ermöglicht die Untersuchung der biophysikalischen Wechselwirkungen zwischen Blutzellen, Endothelzellen, und löslichen Faktoren in hämatologischen Erkrankungen.

Endothelialisierten Mikrofluidik für ein Studium Mikrovaskuläre Wechselwirkungen in Hämatologische Krankheiten

Fortschritte in den Mikrofertigungstechniken haben die Herstellung kostengünstiger und reproduzierbarer mikrofluidischer Systeme für die Durchführung biologischer und ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine mikrofluidische Vorrichtung herzustellen, die mit endothelialen Zellen beschichtet ist. Dies wird erreicht, indem zunächst die mikrofluidische Form hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, den PDMS-Kanal zu erzeugen.Anschließend werden die Endothelzellen in die Vorrichtung eingebracht. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen innerhalb der Vorrichtung zu kultivieren. Letztendlich werden mikrofluidische Vorrichtungen mit Endothelzellenbeschichtung verwendet, um zelluläre Interaktionen in vitro darzustellen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie dem Forscher präzise Kontrollen über die biologischen und biophysikalischen Bedingungen ermöglicht und mit der Fluoreszenzmikroskopie kompatibel ist. Obwohl diese Methode Einblicke in die biophysikalischen Zell-Zell-Interaktionen bei hämatologischen Erkrankungen liefern kann, ist sie ebenso auf Phänomene wie die Leukozytenbiologie, die Metastasierung von Krebs oder die Biologie hämatopoetischer Stammzellen anwendbar. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Bedingungen streng kontrolliert werden müssen, um eine erfolgreiche Zellanheftung zu gewährleisten.Zur Vorbereitung der Herstellung wird eine Fotomaske angefertigt, indem ein computergestütztes Designbild des mikrofluidischen Geräts an einen externen Maskenhersteller gesendet wird. Nach Erhalt besteht die Maske aus einer Chromschicht auf Natronkalkglas. Hier beträgt die Breite des mikrofluidischen Kanals 30 Mikrometer.Um die Herstellung des mikrofluidischen Geräts zu beginnen, reinigen Sie einen blanken Siliziumwafer 15 Minuten lang mit Piranha, anschließend spülen Sie ihn 10 Sekunden lang mit entionisiertem Wasser ab. Danach tauchen Sie den Siliziumwafer 30 Sekunden lang in Flusssäure ein und spülen ihn etwa 10 Sekunden lang mit entionisiertem Wasser ab. Als Nächstes beschichten Sie den Wafer mit einer Dicke von 30 Mikrometern mittels eines Spin-Coaters mit dem Fotolack Micro Chem SU-8 2025 bei einer Drehzahl von 3000 Umdrehungen pro Minute. Legen Sie den mit SU 8 20 25 beschichteten Wafer fünf Minuten lang auf eine Heizplatte, die auf 95 Grad Celsius eingestellt ist, um überschüssiges Lösungsmittel zu entfernen. Für diesen Schritt wird die Verwendung eines Ofens nicht empfohlen. Anschließend platzieren Sie die Fotomaske über dem Wafer und belichten ihn mit UV-Licht in einem Maskenbelichter, um den SU 8 20 25-Photoresist zu vernetzen.Nach der Vernetzung das Wafer erneut für fünf Minuten auf die Heizplatte bei 95 Grad Celsius stellen, um die Polymerisation des SU 8 20 25 Fotolacks weiter zu beschleunigen. Anschließend das Wafer vier Minuten lang in den SU 8-Entwickler eintauchen, der hauptsächlich aus P-G-M-E-A besteht.Dadurch wird der nicht vernetzte SU 8 20 25-Photoresist entfernt. Spülen Sie den neu strukturierten Wafer 10 Sekunden lang mit 100 % Isopropanol ab und trocknen Sie ihn anschließend mit Druckluftstickstoff oder indem Sie den Lösungsmittelresten ermöglichen, einige Minuten lang in einer sauberen Abzugshaube vom Wafer zu verdampfen. Bringen Sie den getrockneten Wafer nun mittig auf die Petrischale auf, wobei darauf zu achten ist, das Klebeband an den Rändern des Wafers anzubringen.Pipettieren Sie abschließend 500 Mikroliter Sigma-Beschichtung auf das Wafer. Decken Sie die Petrischale mit dem Deckel ab und schwenken Sie die Schale, um eine vollständige Beschichtung des Wafers sicherzustellen. Entfernen Sie den Deckel und lassen Sie das Wafer mehrere Minuten lang trocknen, bis das gesamte Lösungsmittel verdampft ist.Nach dem Mischen des PDMS-Polymeren und des Härteragents im Gewichtsverhältnis von 10 zu 1 werden die eingeschlossenen Luftblasen mithilfe eines Vakuum-Exsikkators für mehrere Minuten bis eine Stunde entfernt, abhängig von der Leistungsfähigkeit des verfügbaren Vakuumsystems. Sobald alle Luftblasen entfernt sind, wird die Mischung in die Schale gegossen, sodass sowohl der Wafer als auch die Oberfläche der Schale bedeckt sind. Um eine PDMS-Schicht von etwa fünf Millimetern Dicke zu erzeugen.Erstellen Sie außerdem ein dünnes, strukturloses Stück PDMS mit einer Dicke von einem Millimeter. Anschließend mischen und härten Sie das Gemisch über Nacht in einem Ofen bei 60 Grad Celsius. Am nächsten Tag schneiden Sie mit einem Messer oder Skalpell um das Wafer herum und entfernen mehrere mikrofluidische PDMS-Geräte.Schneiden Sie dann das Blatt, um einzelne Geräte zu isolieren. Schneiden Sie das PDMS-Blatt etwas größer als das mikrofluidische Gerät zu. Verwenden Sie nun eine Handbohrmaschine wie Harris Unicorn oder ein ähnliches Gerät, um Einlass- und Auslassöffnungen in dem mikrofluidischen Gerät anzulegen.Als Nächstes reinigen Sie die Oberflächen des mikrofluidischen Geräts und des Blatts mit Klebeband. Anschließend setzen Sie die Oberflächen des mikrofluidischen Geräts und des PDMS-Blatts mit einem Plasma-Reiniger 30 Sekunden lang Sauerstoffplasma aus. Das Sauerstoffplasma erzeugt reaktive Spezies auf der exponierten Oberfläche des PDMS, die miteinander Bindungen eingehen, sobald sie in physischen Kontakt gebracht werden.Füllen Sie als Nächstes eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer stumpfen 20-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin aus menschlichem Plasma in PBS, und stecken Sie anschließend ein Stück Schlauch über die Nadel. Führen Sie ein dünneres Schlauchstück in das erste Schlauchstück ein, um eine Reibungsverbindung zwischen den beiden Schlauchstücken herzustellen.Dann befestigen Sie das andere Ende des dünneren Schlauchstücks am Eingang des mikrofluidischen Geräts. Üben Sie Druck auf die Spritze aus, um die Kanäle vollständig mit Fibronectin-Lösung zu füllen, und bilden Sie einen kleinen Tropfen von 100 Mikrolitern am Auslassport, um sicherzustellen, dass die Kanäle feucht bleiben. Inkubieren Sie das mikrofluidische Gerät anschließend 40 bis 60 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius.Nach der Inkubation eine frische Spritze, die mit PBS gefüllt ist, an die stumpfe Kanüle anschließen. Unter Druck setzen, um das mikrofluidische Gerät mit PBS zu spülen. Bereiten Sie 500.000 bis 2 Millionen Zellen pro Milliliter humane Umbilikalvenenendothelzellen oder hve in endothelialem Wachstumsmedium mit 8% Dextran vor.Die Zugabe von Dextran erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die Zellen haften und sich erfolgreich im mikrofluidischen Gerät kultivieren lassen. Füllen Sie eine saubere Spritze mit einer stumpfen Nadel und weiterer Schlauchleitung mit der Zellsuspension und verbinden Sie eine längere Schlauchstrecke von etwa einem Meter Länge. Es ist entscheidend sicherzustellen, dass die Schläuche fest miteinander verbunden sind, um Leckagen an Verbindungsstellen zu vermeiden.Spülen Sie die Tubing mit der Zellsuspension, wobei sichergestellt werden muss, dass weder in der Spritze noch in den Tubingblasen vorhanden sind, um die Leistung des Systems zu optimieren. An dieser Stelle ist es entscheidend, das Eindringen von Leckagen oder Blasen in das System zu verhindern. Jede Lösungsleckage oder das Vorhandensein von Blasen im Medium verhindert eine erfolgreiche Anlagerung der endothelialen Zellen.Nachdem alle Luftblasen entfernt wurden und die gesamte Länge der Schlauchleitung mit der Zellsuspension befüllt ist, setzen Sie die Spritze auf die Pumpe und verbinden das andere Ende mit dem Mikrofluidik-Einlass. Die Spritzenpumpe wird auf gleicher Höhe wie die mikrofluidische Vorrichtung positioniert. Die lange Schlauchlänge wird sorgfältig innerhalb des Brutschrankes aufgerollt, um sicherzustellen, dass die Zellen und das Medium ausreichend erwärmt werden, bevor sie mit der Vorrichtung in Kontakt kommen.Anschließend wird die Zellsuspension zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in der Mikrofluidikvorrichtung mit einer volumetrischen Durchflussrate von 1,23 Mikrolitern pro Minute infundiert. In unserem System entspricht die volumetrische Durchflussrate von 1,23 Mikrolitern pro Minute einer mittleren Strömungsgeschwindigkeit von einem Millimeter pro Sekunde in den kleinsten Kanälen. Dies entspricht bei Verwendung von Vollblut einer Wand-Schubspannung von einem Dyne pro Quadratzentimeter in diesen Kanälen.Nach Abschluss der Zell-Suspensions-Infusion frische Wachstumsmedien mittels desselben Spritzenpumps und derselben langen Schlauchleitung, jedoch mit einer größeren Spritze, zwei bis acht Tage lang mit einer Geschwindigkeit von 1,23 Mikrolitern pro Minute infundieren. Wenn die Zell-Monomerschicht den gewünschten Konfluenzgrad erreicht hat, Blut oder Zell-Suspension zur Durchführung von Experimenten in das System injizieren. Hier ist die mikrofluidische Vorrichtung vor der Endothelialisierung dargestellt.Die mikrofluidische Vorrichtung wurde mit Lebensmittelfarbe befüllt, um Größe, Maßstab und das gesamte Design der Vorrichtung zu veranschaulichen, die die Physiologie des vaskulären Systems nachahmt. Die Hellfeldmikroskopie zeigt die Endothelialisierung einer mikrofluidischen Vorrichtung. Dieses Bild wurde weniger als 48 Stunden nach der Aussaat mithilfe des beschriebenen Protokolls aufgenommen; die optimierte Perfusionsmethode ermöglicht es Endothelzellen, die gesamte innere Oberfläche des mikrofluidischen Systems konfluent zu besiedeln.Innerhalb von 24 bis 48 Stunden nach der Zellaussaat. Wie dieses konfokale Bild zeigt, entspricht die Größe des mikrovaskulären Tumors auf einem Chip mit Mikrokanälen von etwa 30 Mikrometern der Größe postkapillärer Venolen, dem Ort der meisten mikrovaskulären Verschlüsse bei der Sichelzellerkrankung. In diesem Experiment wird Vollblut von gesunden Patienten unter deoxygenierten Bedingungen in eine mikrovaskuläre Struktur auf einem Chip-Gerät infundiert.Dieses Video zeigt, dass der Fluss von Vollblut in unserem endothelialen mikrofluidischen System regelmäßig, gleichmäßig und kontinuierlich ist, ohne Bereiche einer Mikrokanal-Verstopfung. Hier wird Vollblut von Patienten mit der Krankheit der Sichelzellenanämie in eine mikrovaskuläre Struktur auf einem Chip-Gerät infundiert. Unter deoxygenierten Bedingungen sind signifikante Veränderungen im Blutfluss zu erkennen, wobei in mehreren Kanälen vollständige Okklusionen auftreten.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, beim Wechseln der Schläuche keine Luftblasen einzuführen. Das fertige Gerät ist mit der Fluoreszenzmikroskopie kompatibel und kann an traditionelle Fluoreszenz-Assays angepasst werden. Diese Technik eröffnet experimentellen Hämatologen die Möglichkeit, Experimente mit Einzelzellen in einer kontrollierten biophysikalischen und hämodynamischen Umgebung durchzuführen.Keine Blasen.

endothelialized-microfluidics-for-studying-microvascular-interactions

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Hier beschreiben wir eine Methode zur menschlichen Nabelschnurblut-derived endothelial Kolonie-bildenden Zellen (ECFCs) und Knochenmark gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in einem Kollagen / Fibronektin Gel eingebettet, subkutan in immundefizienten Mäusen. Liefern Diese Zelle / Gel-Kombination erzeugt eine humane vaskuläre Netzwerk, das mit der Maus Gefäßsystem verbindet.

Bioengineering humane mikrovaskuläre Networks in immundefizienten Mäusen

Mikrofluidische Strömungskammern durch Photolithographie geätzt und hergestellt von PDMS werden angewendet, um die funktionellen Ergebnisse mit den EG-Dysfunktion und Entzündung zu untersuchen. In einem repräsentativen Experiment, die Fähigkeit der Differential Scherbeanspruchung zu modulieren die Zelladhäsion an Monozyten Cytokin aktiviert EG Monoschichten nachgewiesen wird.

On-Chip-Endothelial Entzündliche Phänotypisierung

A Mikrokanälen-on-a-Chip-Plattform wurde durch die Kombination von photolithographischen reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie und Mikrofluidik entwickelt. Die endothelialisierten Mikrokanäle Plattform imitiert die dreidimensionale (3D) Geometrie in vivo Mikrogefäßen läuft unter kontrollierten kontinuierlichen Perfusionsfluss, ermöglicht qualitativ hochwertige und Echtzeit-Bildgebung und kann für mikrovaskuläre Forschung angewendet werden.

Verfahren für die Entwicklung von Multi-Tiefe rundem Querschnitt endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip

Die Thrombozytentransfusion und Hämostase wurde unter Verwendung von Blutrekonstitution und mikrofluidischen Flusskammern modelliert, um die Funktion von Blutbankplättchen zu untersuchen. Die Daten zeigen die Auswirkungen einer Thrombozytenspeicherung auf die Blutstillung in vitro.

Mikrofluidik-Strömungskammern Mit Rekonstituierte Blut Hämostaseologie und Transfusions Platelet zu Modell<em&gt; In Vitro</em

Primäre humane Nabelvenendothelzellen (HUVECs) wurden innerhalb eines mikrofluidischen Netzwerkgeräts zur Konfluenz gezüchtet. Die Endothelzellübergänge und F-Aktin-Verteilungen wurden dargestellt und die Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration und der Stickoxidproduktion als Reaktion auf Adenosintriphosphat (ATP) wurden in Echtzeit auf Einzelzellebene quantifiziert.

Entwicklung und Charakterisierung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Und die Produktion von Stickoxid

Dieses Manuskript stellt ein Spritzgussverfahren microvessels zu entwickeln, die physiologischen Eigenschaften des Endothels rekapitulieren. Die Mikrofluidik-basierten Prozess erstellt Patent 3D Gefäßnetze mit tailor Bedingungen, wie Durchfluss, zelluläre Zusammensetzung, Geometrie und biochemische Steigungen. Das Herstellungsverfahren und Beispiele für mögliche Anwendungen beschrieben.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

Wir präsentieren ein In-vitro-Modell für Gefäßerkrankungen, um Vollblut-Wechselwirkungen mit patientenabgeleitetem Endothel zu untersuchen. Dieses System ermöglicht die Untersuchung der thrombogenen Eigenschaften der primären Endothelzellen unter verschiedenen Umständen. Das Verfahren eignet sich besonders zur Beurteilung der Thrombogenität und Antikoagulationstherapie in verschiedenen Phasen der Gerinnung.

In Vitro Mikrofluidic Disease Model zur Untersuchung von Blut-Endothel-Wechselwirkungen und Blutgerinnsungsdynamik in Echtzeit

Hier bieten wir einen mikrofluidischen Chip und ein automatisch gesteuertes, hocheffizientes Kreislauf-Mikrofluidsystem, das die anfängliche Mikroumgebung der Neovaskularisation rekapituliert und es ermöglicht, Endothelzellen (ECs) durch hohe Luminalscherspannung, physiologischen Transendothelfluss und verschiedene vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) gleichzeitig zu stimulieren.

Mikrofluidisches Modell zur Nachahmung des ersten Ereignisses der Neovaskularisation

In diesem Protokoll wird ein biomimetischer Mikrofluid-Assay, der eine physiologisch relevante mikrovaskuläre Umgebung reproduzieren und die gesamte Leukozyten-Adhäsions-/Migrationskaskade reproduzieren kann, eingesetzt, um Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen bei entzündlichen Erkrankungen zu untersuchen.

Ein mikrophysiologisches System zur Untersuchung der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion während einer Entzündung

Die Thrombozytenfunktion unter Fluss kann beurteilt und eine simulierte hämostatische Wiederbelebung mit einem mikrofluidischen Gerät modelliert werden, das in der Trauma- und Transfusionsmedizin Anwendung findet.

Mikrofluidik zur Beurteilung der Thrombozytenfunktion

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein mikrofluidisches System herzustellen und zu betreiben, das Endothelzellen synchronisierter oszillatorischer Hyperglykämie und pulsatiler Scherspannung aussetzt. Dieser Ansatz bietet ein physiologisch relevantes In-vitro-Modell zur Untersuchung diabetischer Endotheldysfunktion. Dieses Protokoll ermöglicht die quantitative Messung von oxidativem Stress und den Antworten von Endothelzellen.

Ein mikrofluidisches System zur Modellierung der endothelialen Dysfunktion unter kombinierter physiologischer pulsatiler Scherspannung und oszillatorischer Hyperglykämie

Erfahren Sie die Kultivierung endothelialer Zellschichten in mikrofluidischen Geräten zur Untersuchung mikrovaskulärer Wechselwirkungen bei hämatologischen Erkrankungen. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle biologischer Bedingungen.

Endothelialisierten Mikrofluidik für ein Studium Mikrovaskuläre Wechselwirkungen in Hämatologische Krankheiten

Weitere Videos entdecken