Name: Immunhistochemische Färbung von B7-H1 (PD-L1) auf Paraffin-embedded Slides der Pankreaskarzinom Tissue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Lernen Sie die immunhistochemische Färbung von B7-H1 (PD-L1) in Pankreaskarzinom-Gewebeschnitten. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung immunsuppressiver Signale im Tumormikromilieu.

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EB, KMB und HX tragen gleichermaßen. Diese Studie wurde von der NCI SPORE in Gastrointestinal Cancers P50 CA062924, NIH K23 CA148964, Lustgarten Foundation, Viragh Foundation, ASCO Young Investigator Award, NIH 5T32 CA0090701-28 Training Grant, Sol Goldman Pancreatic Cancer Center und National Pancreas Foundation unterstützt.

B7-H1/PD-L1, ein Mitglied der B7-Familie von immunregulatorische Zelloberflächenproteinen, spielt eine wichtige Rolle bei der negativen Regulation von zellvermittelten Immunantworten durch seine Wechselwirkung mit seinem Rezeptor, programmierten Zelltod-1 (PD -1) 1,2. Überexpression von B7-H1 durch Tumorzellen wurde in einer Reihe von menschlichen Krebsarten, einschließlich Melanom, Glioblastom und Karzinomen der Lunge, Brust, Dickdarm, Eierstock und Nierenzellen bemerkt worden, und wurde gezeigt, dass anti-Tumor-T beeinträchtigen Zell-Immunität 3-8. Vor kurzem hat B7-H1 Expression von Pankreaskarzinom Geweben als potentieller prognostischer Marker 9,10 identifiziert worden. Zusätzlich hat Blockade von B7-H1 in einem Mausmodell von Bauchspeicheldrüsenkrebs gezeigt worden, um eine Anti-Tumor-Antwort 11 zu erzeugen. Diese Daten legen nahe, wie wichtig B7-H1 als ein potenzielles therapeutisches Ziel. Anti-B7-H1-Blockade Antikörper sind daher in klinischen Studien für mehrere Menschen getestetsolider Tumoren wie Melanomen und Karzinomen der Lunge, Dickdarm, Niere, Magen und Bauchspeicheldrüse 12. Um schließlich in der Lage sein, um die Patienten, die von B7-H1 Targeting-Therapien profitieren zu identifizieren, ist es wichtig, den Zusammenhang zwischen Expression und Lokalisation von B7-H1 und Ansprechen des Patienten auf die Behandlung mit B7-H1-Blockade Antikörper zu untersuchen. Untersuchen der Expression von B7-H1 in menschlichen Pankreaskarzinom Gewebe durch Immunhistochemie wird ein besseres Verständnis, wie diese mit-inhibitorische Signalmolekül trägt zur Unterdrückung der Antitumor-Immunität in Mikroumgebung des Tumors. Die Anti-B7-H1-Antikörper (Klon 5H1) von Chen und Mitarbeitern entwickelt wurde gezeigt, zuverlässig Färbeergebnisse in Kryoschnitten mehrerer Arten von menschlichen neoplastischen Geweben 4,8 zu produzieren, aber auf Anfärben Paraffin eingebetteten Folien war eine Herausforderung, bis kürzlich 13-18. Wir haben die B7-H1 staini entwickeltng Protokoll für Paraffin eingebettete Folien Pankreaskarzinom Gewebe. Die B7-H1 Färbeprotokoll hier beschriebenen konsistente membranöse und zytoplasmatische Färbung von B7-H1 mit wenig Hintergrund. Ein. De-parafinization <ol><li> Bake gleitet bei 55 ° C für 20 min. </li><li> In einer chemischen Haube, Folien tauchen in Xylol für 10 min. </li><li> Objektträger in frischem Xylol für 10 min. </li><li> Objektträger in 100% Ethanol für 5 min. </li><li> Objektträger in frisch 100% Ethanol für 5 min. </li><li> Objektträger in 95% Ethanol für 5 min. </li><li> Objektträger in 80% Ethanol für 5 min. </li><li> Objektträger in entionisiertem Wasser für 5 min. </li></ol> 2. Antigen Retrieval <ol><li> Objektträger in Tris-EDTA-Puffer (pH 9,0) und Wärme in einem Dampfkochtopf bis 125 ° C für 30 sec, dann 90 ° C für 10 sek. </li><li> Lassen Dias cool für 60 min. </li><li> Objektträger in TBST für 5 min; repebei zweimal. </li></ol> 3. Färbung <ol><li> Wischen Sie Lösungen rund um das Gewebe auf den Folien. Markieren Sie einen Kreis um das Gewebe mit einer hydrophoben Stift. </li><li> Objektträger in einer feuchten Kammer und vermeiden das Trocknen des Gewebes auf der Folie über den gesamten Färbeprozesses. Einen Tropfen (etwa 200 ul oder mehr, um das Gewebe vollständig zu bedecken Bereich) von Peroxidase Block innerhalb des hydrophoben Kreis auf der Rutsche und inkubieren in Peroxidase Block für 5 min. </li><li> Die Objektträger mit TBST, dann in TBST für 5 min. </li><li> Geben Sie einen Tropfen BLOCK ACE Blocking-Puffer auf jeder Folie und Inkubation für 15 min. </li><li> Die Objektträger mit TBST, dann in TBST für 5 min. </li><li> Geben Sie einen Tropfen Avidin-Lösung auf jeder Folie und Inkubation für 15 min. </li><li> Die Objektträger mit TBST, dann in TBST für 5 min. </li><li> Geben Sie einen Tropfen Biotin-Lösung auf jeder Folie und Inkubation für 15 min. </li><li> Spülen slides mit TBST, dann in TBST für 5 min. </li><li> Die Objektträger mit 1:1000 Verdünnung von Maus-Anti-B7-H1-Antikörper (Klon 5H1) oder einer Maus IgG1 κ Isotypenkontrolle in 200 ul TBST bei 4 ° C über Nacht für 22 h + / - 1 h. Die endgültige Antikörperkonzentration in TBST ist 2,57 ug / ml. </li><li> Die Objektträger mit TBST, dann in TBST für 5 min. Zweimal wiederholen. </li><li> Die Objektträger mit einem Biotin konjugiertes Ratte-anti-Maus-IgG1-Antikörper in einer sekundären 1:500 Konzentration (in 200 ul 2% Ziegenserum-Lösung) für 30 min. </li><li> Die Objektträger mit TBST, dann in TBST für 5 min. Zweimal wiederholen. </li><li> Geben Sie einen Tropfen Streptavidin-Biotin-Komplex auf jeder Folie und Inkubation für 15 min (muss mindestens 30 min vor Gebrauch vorbereitet werden). </li><li> Die Objektträger mit TBST, dann in TBST für 5 min. Zweimal wiederholen. </li><li> Geben Sie einen Tropfen Amplifikationsreagenz (verdünnt 2:1 mit TBST) auf jeder Folie und Inkubation für 4 min. </li><li> Die Objektträger mit TBST, dann in TBST für 5 min. Zweimal wiederholen. </li><li> Geben Sie einen Tropfen Streptavidin-HRP auf jeder Folie und Inkubation für 15 min. </li><li> Die Objektträger mit TBST, dann in TBST für 5 min. Zweimal wiederholen. </li><li> Setzen Sie einen Tropfen 3,3-Diaminobenzidin (DAB)-Substrat und Chromogen auf jeder Folie entwickeln und die Farbe für 2 min. </li><li> Unmittelbar nach der Farbentwicklung, waschen Folien mit ddH 2 O für 1-2 min. </li><li> Die Objektträger mit einem Tropfen Hämatoxylin für 90 sec. </li><li> Waschen mit ddH 2 O für 1-2 min. </li><li> Waschen mit Seifenwasser Leitungswasser für 1-2 min. </li><li> Waschen mit ddH 2 O für 1-2 min. </li></ol> 4. Dehydration und Montage <ol><li> Eintauchen der Objektträger in 80% Ethanol für 3 min. </li><li> Tauchen Sie die Folien in 95% Ethanol für 3 min. </li><li> Eintauchen der Objektträger in 100% Ethanol für 5 min. Wiederholen. </li><li> Eintauchen der Objektträger in Xylol für 5 min. Wiederholen. </li><li> Einen TropfenCytoseal 60 auf den Schlitten und Ort das Deckglas. </li></ol> Tabelle 1 listet die Reagenzien in den oben beschriebenen Verfahren verwendet.

<ol><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+B7s%3A+playing+a+pivotal+role+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity.</a> J. Immunother. 30, 251-260 (2007).</li>
<li>Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1%2C+a+third+member+of+the+B7+family%2C+co-stimulates+T-cell+proliferation+and+interleukin-10+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion.</a> Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).</li>
<li>Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+improves+myeloid+dendritic+cell-mediated+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity.</a> Nat. Med. 9, 562-567 (2003).</li>
<li>Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDong%2C+H+%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. 8, 793-800 (2002).</li>
<li>Dong, H., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+pathway+and+its+role+in+the+evasion+of+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity.</a> J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).</li>
<li>Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+blockade+augments+adoptive+T-cell+immunotherapy+for+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma.</a> Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).</li>
<li>Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+and+PD-1+by+monoclonal+antibodies+potentiates+cancer+therapeutic+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity.</a> Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costimulatory+B7-H1+in+renal+cell+carcinoma+patients%3A+Indicator+of+tumor+aggressiveness+and+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).</li>
<li>Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+up-regulated+expression+in+human+pancreatic+carcinoma+tissue+associates+with+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression.</a> J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).</li>
<li>Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+regulation+of+the+costimulatory+molecule+B7-H1+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer.</a> Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).</li>
<li>Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+or+B7-DC+induces+an+anti-tumor+effect+in+a+mouse+pancreatic+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model.</a> Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).</li>
<li>Wang, S., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+cancer+therapies+targeting+CD137+and+B7-H1%2FPD-1+cosignal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).</li>
<li>Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+glycoprotein+blockade%3A+a+novel+strategy+to+enhance+immunotherapy+in+patients+with+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma.</a> Urology. 66, 10-14 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+B7-H1+is+associated+with+poor+prognosis+in+renal+cell+carcinoma+patients+with+long-term+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up.</a> Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).</li>
<li>Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+B7-H1+expression+in+clear+cell+carcinoma+of+the+kidney+for+prognostication+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy.</a> Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).</li>
<li>Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-expressed+B7-H1+and+B7-DC+in+relation+to+PD-1%2B+T-cell+infiltration+and+survival+of+patients+with+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma.</a> Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).</li>
<li>Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+%28B7-H1%29+expression+by+urothelial+carcinoma+of+the+bladder+and+BCG-induced+granulomata%3A+associations+with+localized+stage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression.</a> Cancer. 109, 1499-1505 (2007).</li>
<li>Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).</li>
<li>Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+B7-H1+and+B7-1+expressions+in+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma.</a> World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).</li>
<li>Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+therapeutic+potential+of+the+programmed+death-1+ligand%2Fprogrammed+death-1+pathway+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer.</a> Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).</li>
<li>Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+inflammatory+response+with+B7-h1+expression+in+human+melanocytic+lesions+supports+an+adaptive+resistance+mechanism+of+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape.</a> Sci. Transl. Med. 4, 127ra37(2012).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Immunhistochemische Färbung von B7-H1 auf Kryoschnitten In früheren Studien wurde für eine Vielzahl von Krebsarten 3,4 gemeldet. Jedoch klinischen Tumorproben üblicherweise nur in Form von in Paraffin eingebetteten Blöcke verfügbar. Die monoklonalen Antikörper 5H1 hat neuerdings erfolgreich an die Färbung von Paraffin eingebettet Tumorgeweben einschließlich Nierenzellkarzinom, Gebärmutterhalskrebs, Blasenkrebs und Melanom 13-18 angewandt. B7-H1 Färbung auf Paraffin eingebettete, 9,19 ode...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> CSA-System </td><td> Dako </td><td> K1500 </td><td> Enthält die folgenden Reagenzien in dem Protokoll genannt: Peroxidase Block, Streptavidin-Biotin-Komplex, Amplifikationsreagens, Streptavidin-HRP und DAB Substrat und Chromogen </td></tr><tr><td> Avidin / Biotin Blocking Kit </td><td> Vektor </td><td> SP-2001 </td><td></td></tr><tr><td> Block ACE </td><td> Serotec </td><td> BUF029 </td><td></td></tr><tr><td> Biotin Anti-Maus-IgG1 </td><td> BD </td><td> 553441 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse IgG1 K Isotypkontrolle </td><td> eBioscience </td><td> 14-4714-85 </td><td></td></tr><tr><td> TBS (Tris-gepufferte Salzlösung), 10X </td><td> Cellgro </td><td> 46-012-CM </td><td> 10xTBS enthält 80 g / l NaCl und 24,2 g / L Tirs; Verdünnt 1X mit ddH2O für Waschmittel; </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1379 </td><td> 1 ml zugesetzt, um 1 l 1X TBS zu machen TBST </td></tr><tr><td> Target Retrieval, 20x </td><td> Celerus Welle </td><td> 014-3000-000 </td><td> Verdünnt auf 1x mit ddH 2 O </td></tr><tr><td> 190 Proof Ethylalkohol </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 111000190 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Proof Ethylalkohol </td><td> Pharmo-Aaper </td><td> 111000200 </td><td></td></tr><tr><td> Xylol </td><td> VWR </td><td> 95057-827 </td><td></td></tr><tr><td> Hematoxylin </td><td> Richard-Allan Scientific </td><td> 72804 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Richard-Allan Scientific </td><td> 8310-4 </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td></td></tr><tr><td> Feuchte Kammer </td><td> Sigma </td><td> H6644 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 1. Reagenzien und Ausrüstung. </td></tr></tbody></table>

immunhistochemische färbung von b7-h1 (pd-l1) auf paraffin-embedded slides der pankreaskarzinom tissue

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, ein Mitglied der B7-Familie von immunregulatorische Zelloberflächenproteinen, spielt eine wichtige Rolle bei der negativen Regulation von zellvermittelten Immunantworten durch seine Wechselwirkung mit seinem Rezeptor, programmierten Zelltod-1 (PD -1) 1,2. Überexpression von B7-H1 durch Tumorzellen wurde in einer Reihe von menschlichen Krebsarten, einschließlich Melanom, Glioblastom und Karzinomen der Lunge, Brust, Dickdarm, Eierstock und Nierenzellen bemerkt worden, und wurde gezeigt, dass anti-Tumor-T beeinträchtigen Zell-Immunität 3-8. Vor kurzem hat B7-H1 Expression von Pankreaskarzinom Geweben als potentieller prognostischer Marker 9,10 identifiziert worden. Zusätzlich hat Blockade von B7-H1 in einem Mausmodell von Bauchspeicheldrüsenkrebs gezeigt worden, um eine Anti-Tumor-Antwort 11 zu erzeugen. Diese Daten legen nahe, wie wichtig B7-H1 als ein potenzielles therapeutisches Ziel. Anti-B7-H1-Blockade Antikörper sind daher in klinischen Studien für die mul geprüfttiple humanen soliden Tumoren wie Melanomen und Karzinomen der Lunge, Dickdarm, Niere, Magen und Bauchspeicheldrüse 12. Um schließlich in der Lage sein, um die Patienten, die von B7-H1 Targeting-Therapien profitieren zu identifizieren, ist es wichtig, den Zusammenhang zwischen Expression und Lokalisation von B7-H1 und Ansprechen des Patienten auf die Behandlung mit B7-H1-Blockade Antikörper zu untersuchen. Untersuchen der Expression von B7-H1 in menschlichen Pankreaskarzinom Gewebe durch Immunhistochemie wird ein besseres Verständnis, wie diese mit-inhibitorische Signalmolekül trägt zur Unterdrückung der Antitumor-Immunität in Mikroumgebung des Tumors. Die Anti-B7-H1-Antikörper (Klon 5H1) von Chen und Mitarbeitern entwickelt wurde gezeigt, zuverlässig Färbeergebnisse in Kryoschnitten mehrerer Arten von menschlichen neoplastischen Geweben 4,8 zu produzieren, aber auf Anfärben Paraffin eingebetteten Folien war eine Herausforderung, bis kürzlich 13-18. Wir haben developed die B7-H1 Färbeprotokoll für Paraffin eingebettete Folien Pankreaskarzinom Gewebe. Die B7-H1 Färbeprotokoll hier beschriebenen konsistente membranöse und zytoplasmatische Färbung von B7-H1 mit wenig Hintergrund.

Eine erfolgreiche immunhistochemische Färbung von B7-H1 demonstrieren die heterogene Expression von B7-H1 (braun Signale DAB Farbentwicklung) in Pankreaskarzinom. Einige Pankreaskarzinom-Zellen haben überwiegend membranöse Expression von B7-H1 (Abbildung 1A), während andere entweder vorwiegend zytoplasmatische Expression von B7-H1 oder wenig Expression von B7-H1 (Abbildungen 2 und 3). Normale Pankreasgangepithel drückt etwas B7-H1 (Abbildung 4). Anfärbung mit einem Maus...

B7-H1 (PD-L1) und seine Bindung an PD-1 einen großen tumorinduzierte immunsuppressiven Signal in Mikroumgebung des Tumors. Eine immunhistochemische Färbetechnik, die Expression und Lokalisation von B7-H1 in Pankreaskarzinom zu charakterisieren ist hier beschrieben.

Immunhistochemische Färbung von B7-H1 (PD-L1) auf Paraffin-embedded Slides der Pankreaskarzinom Tissue

B7-H1/PD-L1, ein Mitglied der B7-Familie immunregulatorischer Zelloberflächenproteine, spielt eine wichtige Rolle bei der negativen Regulation der zellvermittelten ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe immunhistochemischer Färbetechniken die Expression von B seven H one PD L one in Paraffinschnitten menschlichen Pankreasadenokarzinomgewebes zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Paraffin entfernt und die geschnittenen Gewebeproben rehydriert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens ist die Antigen-Retrieval, bei dem ein Schnellkochtopf zur Färbung des Gewebes verwendet wird.Ein Antikörper-Färbungsverfahren wird durch eine Signalverstärkung und Entwicklung der Farbe mittels DAB ergänzt. Die abschließenden Schritte bestehen in der Dehydrierung und Einbettung des Gewebes. Sobald abgeschlossen.Mithilfe von Mikroskopie und Bildanalyse können membranöses und zytoplasmatisches B-sieben-H-eins sichtbar gemacht werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Forschung eines pankreatischen Endokarzinoms zu beantworten, indem sie ein besseres Verständnis dafür liefert, wie B-sieben-eins BTL-eins zur Unterdrückung der anti-tumoralen Immunität im Mikromilieu des Tumors beiträgt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Färbung von Kryoschnitten, liegt darin, dass sie speziell für die Anwendung an paraffin-eingebetteten Gewebeschnitten optimiert wurde, die oft leichter verfügbar und besser lagerbar sind.Eine zuverlässige Antikörperfärbung auf Objektträgern ist nicht möglich, ohne zuerst das Paraffin zu entfernen. Um Objektträger mit paraffineinbettetem Gewebe vorzubereiten, heizen Sie die Objektträger zunächst 20 Minuten lang bei 55 Grad Celsius im Ofen ein. Anschließend werden in einem Abzug eine Reihe von sieben chemischen Bädern verwendet, um das Paraffin zu entfernen; tauchen Sie die Objektträger zuerst 10 Minuten lang in Xylol ein.Danach die Objektträger für 10 Minuten in ein zweites frisches Xylolbad tauchen. Drittens die Objektträger für fünf Minuten in 100 % Ethanol tauchen. Viertens die Objektträger erneut für fünf Minuten in frisches, 100 %iges Ethanol tauchen.Fünftens tauchen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in 95 % Ethanol ein. Sechstens tauchen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in 80 % Ethanol ein. Schließlich spülen Sie die Objektträger fünf Minuten lang mit entionisiertem Wasser sauber.Nachdem das Paraffin entfernt wurde, ist es anschließend notwendig, das Antigen zugänglich zu machen. Tauchen Sie die Objektträger zuerst in Tris-EDTA-Puffer ein. Erhitzen Sie nun die Objektträger in einem Schnellkochtopf mit einem zweistufigen Programm.Zunächst werden sie 30 Sekunden lang bei 125 Grad Celsius erhitzt. Danach 10 Sekunden bei 90 Grad Celsius. Anschließend die Objektträger beiseite stellen, um sie auf Raumtemperatur abkühlen zu lassen.Nachdem die Objektträger eine Stunde lang abgekühlt sind, werden sie zweimal mit TBST gewaschen, jeweils fünf Minuten pro Bad. Anschließend können die Objektträger angefärbt werden. Beginnen Sie damit, die TBST-Lösung um das Gewebe herum durch Abtupfen zu entfernen, und umkreisen Sie das Gewebe dann mit einem hydrophoben Stift.Während des gesamten Verfahrens vermeiden Sie das Austrocknen des Gewebes, indem Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer aufbewahren. Wenn sie nicht gespült werden, geben Sie einen Tropfen Peroxidase-Block innerhalb des hydrophoben Kreises auf dem Objektträger auf. Warten Sie fünf Minuten und spülen Sie die Peroxidase anschließend mit TBST ab.Anschließend die Objektträger fünf Minuten lang in TBST baden. Die Objektträger aus der Lösung nehmen und vorsichtig das überschüssige TBST abtropfen lassen. Nun einen Tropfen eines CE-Blockierpuffers auf jeden Objektträger geben und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Reinigen Sie die Objektträger mit einer Spülung und einem fünfminütigen Bad in TBST. Geben Sie anschließend einen Tropfen Vidan-Lösung auf jeden Objektträger und warten Sie 15 Minuten. Entfernen Sie das AVADON mit derselben TBST-Spülung und dem gleichen Badeverfahren.Tragen Sie nun Biotin auf. Warten Sie fünf Minuten und reinigen Sie die Objektträger erneut mit TBST. Inkubieren Sie die Objektträger anschließend mit einer Verdünnung eines mausmonoklonalen Antikörpers oder eines Kontrollantikörpers.In TBST die Antikörper 22 Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren lassen. Am nächsten Tag die Objektträger dreimal wie zuvor mit TBST waschen. Jede Waschung umfasst eine A-T-B-S-T-Spülung und ein fünfminütiges Bad.Dieses dreifache Waschprotokoll wird mehrmals wiederholt, während der primäre Antikörper abgewaschen wird. Bereiten Sie die STR-Titin-Bio-ITIN-Komplexlösung vor. Diese sollte mindestens 30 Minuten vor der Verwendung zubereitet werden.Jetzt die Objektträger 30 Minuten lang mit biotinyliertem Ziegen-Anti-US-Sekundärantikörper in einer Ziegenserumlösung inkubieren. Während dieser Inkubation die DACO-Kit-Anleitung befolgen, um die DAB-Substrat-Chromogenlösung herzustellen. Die Lösung kann bis zu acht Stunden bei vier Grad im Dunkeln aufbewahrt werden.Nach der Inkubation dreimal mit TBST waschen. Anschließend einen Tropfen Streptavidin-Biotin-Komplex auf jede Probe geben. Die Objektträger 15 Minuten inkubieren und danach dreimal mit TBST waschen.Als Nächstes einen Tropfen Amplifikationsreagenz auf jeden Objektträger auftragen. Vier Minuten warten und die Objektträger dreimal mit TBST waschen. Nach dem Abwaschen des Amplifikationsreagenzes einen Tropfen Streptavidin-HRP auf jeden Objektträger geben und 15 Minuten inkubieren.Führen Sie vor dem Fortfahren eine weitere dreifache TBST-Wäsche durch. Nun folgt der empfindlichste Schritt des Verfahrens. Geben Sie einen Tropfen DAB-Substrat-ChROMOGEN zusammen mit Substrat-Wasserstoffperoxid auf einen Objektträger und beobachten Sie die Farbentwicklung, das DAB-Substrat.Die Entwicklungszeit des Chromogens beträgt in der Regel zwei Minuten, wobei wir den Entwicklungsprozess routinemäßig unter dem Mikroskop überwachen, um eine optimale Färbung sicherzustellen. Um einen minimalen Hintergrund bei jeder Färbungsrunde zu gewährleisten, fügen wir einen Objektträger aus einer vorherigen Charge und einen Mandel-Objektträger als unsere positiven Kontrollen hinzu. Sobald die Färbung abgeschlossen ist, spülen Sie den Objektträger sofort mit Wasser, nicht mit TBST, ab.Die Probe mit einem Tropfen Hämatin 90 Sekunden inkubieren. Die Probe unmittelbar danach mit destilliertem entionisiertem Wasser, gefolgt von seifigem Leitungswasser und anschließend erneut mit DD-Wasser, waschen. Damit ist das Färbeprotokoll abgeschlossen.Nachdem alle Objektträger gefärbt wurden, verwenden Sie eine Ethanolreihe, um die Objektträger vor dem Eindecken zu dehydrieren. Zuerst tauchen Sie die Objektträger drei Minuten lang in 80 % Ethanol ein. Zweitens tauchen Sie die Objektträger drei Minuten lang in 95 % Ethanol ein.Für das dritte und vierte Bad tauchen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in 100 % Ethanol ein. Für das fünfte und sechste Bad tauchen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in Xylol ein. Geben Sie abschließend einen Tropfen pro Probe auf jeden Objektträger und legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf. Die Objektträger sind nun bereit für die immunhistochemische Färbung mittels Mikroskopie; die Expression von B seven H one zeigte eine heterogene Verteilung von B seven H one im Pankreasadenokarzinom. Diese erscheinen braun infolge der DAB-Färbungsentwicklung. Einige Pankreasadenokarzinomzellen weisen vorwiegend membranöse Expression von B seven H one auf, während andere entweder vorwiegend zytoplasmatische Expression von B seven H one oder kaum Expression von B seven H one aufweisen. Das normale Pankreasgangepithel zeigte geringe B seven H one-Färbung. Bei Verwendung eines Maus-IgG1-Kappa-Isoform-Kontrollantikörpers anstelle des Anti-B seven H one-Antikörpers trat nahezu keine Hintergrundfärbung auf. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von sieben Stunden durchgeführt werden, verteilt auf zwei Tage mit einer 22-stündigen Übernachts-Inkubation, sofern sie korrekt durchgeführt wird, nach dieser Entwicklung.Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Onkologie den Weg, um die B-sieben-H-eins-PD-L-eins-Signalübertragung in anderen malignen Erkrankungen zu untersuchen.

immunohistochemical-staining-b7-h1-pd-l1-on-paraffin-embedded-slides

Research

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JoVE Journal

Medicine

Medizin

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Färbeprotokollen for Human Pankreasinseln

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