Name: Non-Plasma-Bonding von PDMS für preiswerte Herstellung von Mikrofluidik-Geräte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-11-01T00:41:54.000+00:00
Duration: 4 min 45 s
Description: Erfahren Sie eine kostengünstige Methode zur reversiblen Bindung von PDMS-Mikrofluidik-Geräten an Glas ohne Plasma-Behandlung. Diese Technik ermöglicht wasserdichte Zellkultur-Anwendungen mit einfachen Laborgeräten.

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Vorbereitung Mikrofluidiksysteme Für Neuron Cell Culture 1) Reinigen Corning No.1 24 mm X 40 mm Glasplättchen <ul><li> Mit Ultraschall die Glasträger in einem Wasserbad Sonicator für 30 Minuten </li><li> Spülen Sie das Glas-Objektträger mit 70% EtOH </li><li> Waschen Sie die Objektträger dreimal mit dH 2 O </li><li> Dry Folien in einer Gewebekultur Haube für mehrere Stunden, am besten über Nacht </li></ul> Hinweis: Wir haben spezielle Metall-Schalen, die wir mit den Schlitten zu laden. Die Folien sind einzeln und getrennt platziert in die Schlitze in das Metallgestell. Wir können dann diese Metall-Be-Trays in einer Glasschale, dass wir mit Wasser, in das Wasser Ultraschallbad zu füllen, und beschallen für 30 Minuten. Nachfolgende Waschungen sind in diesem Gericht durchgeführt. 2) Vorbereitung der PDMS-Geräte <ul><li> Schneiden Sie die PDMS Form aus dem Silizium-Wafer, Löcher stanzen in der PDSM gegossen und Quartal ist </li><li> Reinigen Sie die PDMS-Geräten, indem Sie zuerst weht Inertgas (Argon oder Stickstoff) über sie. Dann nutzen Sie 3M Scotch Brand Tape 471 zum Abheben alle Reste </li></ul> Hinweis: Es ist wichtig, dass die Geräte nach oben. Anfangs, als wir die PDMS abgeschnitten von der Silizium-Wafer, ist die Seite in Kontakt mit dem Wafer der sauberen Seite: Sie enthält die mikrofluidischen Kanälen. Wir versuchen, so vorsichtig wie wir als nicht beschädigen kann, um das Gerät, und halten Sie die saubere Seite nach oben, bis wir bereit für Plasma-Bindung sind. <ul><li> Autoclave Geräte in Kunststoff-Behältern </li><li> Nach dem Autoklavieren, saubere Nr. 1 Corning Glasträger und Plasma-treat-Geräte mit einem Harrick Marke Plasma-Reiniger, <a href="http://www.harrickplasma.com/" target="_blank">www.harrickplasma.com</a> </li><li> Platzieren Sie die Geräte sauber nach unten auf die Glasplatte. </li></ul> Das Gerät ist nun Plasma gebunden an das Glas gleiten. 3) Beschichtung Die Geräte mit Poly-L-Lysin (PLL) <ul><li> PLL ist es, eine gut auf jeder Seite des Gerätes zugegeben und durch in den nächsten gut fließen </li></ul> =&gt; 150 ul PLL für den großen Brunnen und 30 μ l PLL für die kleineren Brunnen. Es muss nicht exakt sein, solange der Brunnen voll sind. Hinweis: Wenn Sie an einem Gerät schauen, werden Sie 4 Brunnen sehen: jeweils zwei miteinander verbunden sind. Sie wollen die PLL in einem gut so, dass es durch das Gerät in den nächsten gut fließen gebracht. <ul><li> Lassen Sie die PLL durch das Gerät für etwa 10 Minuten fließen und fügen Sie dann weitere PLL um den Brunnen, um sie aufzufüllen </li><li> Platzieren Sie die Geräte mit PLL in einem Brutschrank bei 37 ° C für mindestens 4 Stunden (über Nacht ist vorzuziehen) </li><li> Vacuum das überschüssige PLL nach der Behandlung, aber darauf achten, nicht die gesamte Flüssigkeit saugen aus dem Gerät </li></ul> Hinweis: Sie wollen nicht, um Luftblasen zu den Kanälen oder Kammer einzuführen. Nur Vakuum das überschüssige PLL in die Vertiefungen geben. <ul><li> Add autoklaviert dH 2 O in jede Vertiefung auf beiden Seiten des Gerätes, und lassen Sie die anderen auch durch Kapillarwirkung fließen </li></ul> Abbildung 1 ist ein Diagramm eines mikrofluidischen Gerät. Beachten Sie, wie die blaue (Soma auf dieser Seite) angeschlossen ist und die Red (Axonal auf dieser Seite) verbunden sind. Wenn wir sagen, setzen die PLL, oder Wasser oder Medien, auf der einen sowie auf jeder Seite des Gerätes, was wir meinen, ist zum Beispiel: Platz 150 ul autoklaviertem dH 2 O in einem Blau Na dann statt 150 ul autoklaviert dH 2 0 in einem Red Well. Das Wasser (oder PLL, oder Media, oder Zellen) werden durch das Gerät mit dem anderen entsprechenden gut fließen. <img src="/files/ftp_upload/old/410_2008_8_27_3/410_Figure-01.png" alt="Abbildung 1" width="362" height="216" /> Abbildung 1 Hinweis: Bitte beachten Sie, dass von nun an, wenn ich sage &quot;Platz Medien, Zellen-, Wasser-oder PLL in die TOP Brunnen&quot;, I, um das Diagramm oben, wo der Soma würde auf der linken Seite und die Axone beziehe mich wird das Wachstum rechts. <ul><li> Absaugen des Wassers (wieder darauf achten nicht vollständig entfernen Sie die Flüssigkeit aus dem Gerät), dann fügen Sie eine weitere 150 ul autoklaviert dH 2 O zu einer jeden angeschlossenen gut und lassen Sie ihn durchströmen, um den entsprechenden Schacht. </li><li> Stellen Sie das Gerät mit dH 2 O in einem Brutschrank bei 37 ° C für 1 Stunde, dann wiederholen Sie den Waschvorgang wieder. Waschen Sie die Geräte dreimal mit dH 2 O für jeweils eine Stunde, die die Summe ist. </li></ul> Hinweis: Aufgrund der Möglichkeit, dass Borat von der PLL in die PDMS absorbieren, einige in der Jeon Lab empfehlen Inkubation der Geräte über Nacht mit autoklaviertem dH 2 O nach ein paar initial schnelle spült. Dadurch wird sichergestellt, dass alle freien Borat wird Lauge aus dem PDMS vor dem Laden der Zellen. Wenn dies nicht geschieht, kann es zu einer Freisetzung von Borat in den Medien über die Zeit, die Zytotoxizität führen könnte. <ul><li> Add Neural Basal Media (NBM) mit den notwendigen Faktoren (Glutamax, B27, PenStrep) an die Spitze Brunnen </li></ul> Hinweis: Die Geräte können über Nacht inkubiert und verchromt mit Zellen am nächsten Tag, oder inkubiert ein Minimum von 3 Stunden mit NMB + Faktoren vor dem Ausplattieren der Zellen. Vorbereiten des Neurons zum Laden in die Geräte Wir verwenden 18 Tage alten Fötus Rattencortex, dass wir entweder von einer Firma namens Brain-Bits oder das ist hier auf dem Campus für uns vorbereitet zu kaufen. Wir bevorzugen es, sich das Gewebe frisch. <ol><li> Erhalten 1 fetalen Hirnrinde (2 Stück Gewebe) in Hibernate E gespeichert </li><li> Take 3 lange Glaspipetten und Feuer sie jeweils in immer kleinere Größen mit einem Alkohol-Lampe </li><li> entfernen Gewebe von Hibernate E mit einer Glaspipette und in 2 ml NMB + Factors in einem sterilen 15 ml Tube. </li><li> Trituration: Mit einer Glühbirne und Glaspipette der Kortex auf und ging hinunter zu 5 bis 10 mal. Dann wird die nächst kleinere Pipette verwendet werden, um Pipette auf und ab des Gewebes. Schließlich ist die kleinste Pipette verwendet werden, um Pipette auf und ab des Gewebes. Wir möchten sicherstellen, dass keine sichtbaren Brocken. Hinweis: Vor kurzem begann die Jeon Lab verglichen Zellen aus dem Gewebe in Hibernate E, um Zellen, die aus Gewebe zunächst mit 0,125% Trypsin in 50% behandelt wurden hergestellt gespeicherten Ca + + frei und Mg + + frei Dissektion Puffer. Der Konsens ist, dass Gewebe hergestellt unter Verwendung von Trypsin Ertrag mehr lebensfähige Zellen als Gewebe zunächst in Hibernate E. platziert Wenn Sie nicht gehen, um das Gewebe sofort verwenden, dann müssen Sie das Gewebe in Hibernate E. speichern Wenn Sie vorhaben, das Gewebe sofort einsatzbereit sind und würde höhere Rentabilität mögen, dann behandeln das Gewebe mit Trypsin vor der mechanischen Zerkleinerung wie folgt: 1) verdünnt 1 ml 0,25% Trypsin (Gibco, Invitrogen) mit 1 ml Ca + + freie Mg + + frei Dissektion Puffer (final Trypsin = 0,125%) in eine 15 ml Tube (keep eiskalt), 2) Platz Gewebe in Puffer und Inkubation sofort bei 37 ° C für 8 Minuten, 3) 10 ml DMEM/10% FBS bis zum Anschlag Trypsin-Reaktion und weiter-Protokoll unten. </li><li> Centrifuge Zellen bei 1100 rpm für 1 Minute </li><li> Aspirated Medien vorsichtig von der Zellpellet </li><li> 1 ml der NMB + Faktoren auf die Pellet-und resuspendiert sie durch Auf-und Abpipettieren </li><li> Pass den resuspendierten Zellen durch die Schwerkraft fließen durch einen Filter, um alle Klumpen zu entfernen (BD Falcon Zellsieb 40 um Nylon) </li><li> Graf und Platte-Zellen: <ul><li> In ein Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 60 ul NMB + Faktoren, 20 ul Zellsuspension und 20 ul Trypanblau dann mischen </li><li> Etwa 10 ul dieser Lösung auf eine Zählkammer und zählen die Live-Zellen (nicht blau) </li><li> Adjust Konzentration von 2,5 bis 4,5 x10 6 Zellen / ml Hinweis: Wir in der Regel erhalten eine Konzentration von etwa 2,5 bis 4,5 x 106 Zellen / ml. je nach Umfang werden die Zellen in (in der Regel 1 ml NBM + B27/Glutamax/PenStrep percortex) resuspendiert. Wenn das Gewebe mit Trypsin hergestellt wurde, wird die Ausbeute wahrscheinlich erhöht werden. </li></ul></li></ol> Plating Die Geräte <ol><li> Wägezellen (primären Neuronen) in einem Brunnen des Gerätes </li><li> Plate 5 ul pro kleines Gerät und 20 ul pro big Gerät Hinweis: Sie können 10 ul der Zellen auf der Oberseite des Geräts und 10 ul auf der Unterseite des Geräts (die Hälfte Gesamtvolumen) zu laden, oder direkt alle 20 ul der Zellen in der oberen Somal gut (5 ul in der oberen Somal gut für die kleinen Geräte). </li><li> Inkubieren für 10 Minuten bei 37 ° C Inkubator so Zellen beginnen zu befestigen </li><li> Add etwa 150/30 ul NMB + Faktoren in jede Vertiefung je nach Gerätegröße Hinweis: Volumes kann je nach der Dicke des PDMS. Alles, was zählt ist, dass die Brunnen voll sind. </li></ol> Zusätzliche On Mit die Geräte ohne Plasma Bonding Ohne Plasmabehandlung, sagt Christina Tu, ein Techniker, der es erfolgreich jede Woche ohne Plasma, laden Sie einfach die Zellen sofort. Denken Sie daran, die Medien aus beiden Brunnen auf dem Soma-Seite (Axon Seite keine Rolle, ob Sie die Medien in Urlaub) zu entfernen. Es ist die Strömung, die die Zellen zum Hauptkanal eingeben können. Wenn Sie Medien in den Vertiefungen haben, werden Sie nicht bekommen Strömung.

<ol><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li>
<li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Offenlegungen vorzunehmen.

Hier haben wir gezeigt, wie man das Neuron Mikrofluidikvorrichtung, ohne dass ein Plasma Cleaner zu verwenden. Wir bezeichnen dies als Nicht-Plasma-Bindung.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Reagenz</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 184 mit Härtungsmittel. Bitte wenden Sie sich an Dow Corning, um einen Händler in Ihrer Nähe zu finden</td></tr><tr><td>Cornig No. 1 Deckglas</td><td>Deckglas</td><td>Corning</td><td>Corning No. X2935 244</td><td>Erhältlich über Fisher Scientific, Fish-Katalognummer 12-531D</td></tr><tr><td>B27</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>B27 ist ein proprietäres Supplement, erhältlich über Invitrogen in ihrer Gibco-Reihe von Zellkultur-Reagenzien.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>Glutamax ist erhältlich über Invitrogen in ihrer Gibco-Reihe von Zellkultur-Reagenzien.</td></tr><tr><td>60-mm-Petri-Schale</td><td>Werkzeug</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13A</td><td>Sterile 60-mm-Polystyrol-Petri-Schalen dienen zur Aufnahme des an Glas befestigten Geräts.</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1274</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50-ml-Röhrchen</td><td>Werkzeug</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon Nr. 352098</td><td>Erhältlich über Fisher Scientific, Katalognummer 14-959-49A</td></tr><tr><td>BD Falcon 15-ml-Röhrchen</td><td>Werkzeug</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon Nr. 352097</td><td>Erhältlich über Fisher Scientific, Katalognummer 14-959-70C</td></tr></tbody></table>

non-plasma-bonding von pdms für preiswerte herstellung von mikrofluidik-geräte

Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices

In diesem Video zeigen wir, wie man das Neuron Mikrofluidikvorrichtung ohne Plasma Bindung verwenden. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, reversibel Bindung Geräte mit dem Corning Nr. 1 Deckglas. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, vielleicht, um ein Plasma-Reiniger nicht zur Verfügung steht. In anderen Fällen kann es wünschenswert sein, das Gerät aus dem Glas zu entfernen, nachdem die Züchtung von Neuronen für bestimmte Arten der Mikroskopie oder Immunfärbung, obwohl es nicht notwendig ist, um das Gerät für Immunfärbung, da die Neuronen in das Gerät gefärbt werden können entfernen. Einige Forscher, aber immer noch lieber auf das Gerät zu entfernen. In diesem Fall macht reversible Bindung des Gerätes an das Deckglas, das möglich ist. Es gibt einige Nachteile auf Nicht-Plasma-Bindung der Geräte in die nicht so dicht an einer Dichtung gebildet wird. In einigen Fällen Axone kann unter den Rillen statt durch sie zu wachsen. Auch, weil das Glas und PDMS hydrophob sind, tun Flüssigkeiten nicht ohne weiteres in das Gerät eindringen macht es notwendig sein, um Medien und anderen Reagenzien in das Gerät zu erzwingen. Flüssigkeiten wird das Gerät durch Kapillarwirkung geben, aber es dauert wesentlich länger als im Vergleich zu Geräten, Plasma gebunden gewesen. Die Plasma-Reiniger temporäre hydrophile Ladungen auf der Glas-und Gerät, das den Durchfluss von Flüssigkeiten über das Gerät zu erleichtern nach der Verklebung innerhalb von Sekunden. Für Nicht-Plasma-Geräte gebunden, nimmt Flüssigkeit durch die Geräte mehrere Minuten dauern. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Geräte mit den Nicht-Plasma verwendet werden Verklebung müssen zuerst sterilisiert werden, während Plasma behandelt Geräte müssen sich nicht vor Anwendung sterilisiert werden soll, weil das Plasma Reiniger sie abzutöten ist.

In diesem Video zeigen wir, wie der Neuron Mikrofluidikvorrichtung ohne Plasma Bindung verwenden.

Non-Plasma-Bonding von PDMS für preiswerte Herstellung von Mikrofluidik-Geräte

In diesem Video demonstrieren wir die Verwendung des mikrofluidischen Neuronen-Devices ohne Plasmabonding. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, eine reversible Bondung herzustellen ...

Labs, die routinemäßig Photolithografie und Softlithografie durchführen, verfügen in der Regel über ein sogenanntes Plasma-Reinigungsgerät. Ein solches Gerät besitzt eine elektrische Spule, die ein teilweise ionisiertes Gas erzeugt, bestehend aus Elektronen, Ionen, neutralen Atomen und Molekülen. Das Plasma erzeugt reaktive Spezies auf der Oberfläche des Glases und des Bauteils, die sich bei Kontakt dauerhaft miteinander verbinden. Das Plasma macht die Oberfläche des Geräts außerdem hydrophil, was die Zugabe von Flüssigkeiten erleichtert. In einigen Fällen ist jedoch eine dauerhafte, irreversible Bindung nicht erwünscht. Außerdem haben viele Labore keinen Zugang zu einem Plasmareiniger.Um dieses Anliegen zu adressieren, wird heute die reversible, nicht-plasmabasierte Verbindung des Neuronengeräts mit einer Deckglasabdeckung mittels elektrostatischer Kräfte zwischen PDMS und Glas demonstriert. Diese Kräfte erzeugen eine wasserdichte Verbindung, die für die Zellkultur geeignet ist. Ich möchte Ihnen Kiana Lee vorstellen. Sie wird die Demonstrationen heute durchführen.Corning Nr. 1 24 Millimeter mal 40 Millimeter Deckgläser werden mithilfe eines Ultraschallbades gereinigt. Die Gläser werden in ein Edelstahlgestell gelegt, das anschließend in einen Glasbehälter mit entionisiertem Wasser gestellt wird. Der Glasbehälter wird dann in das Ultraschallbad eingesetzt.Die Objektträger werden anschließend 30 Minuten lang ultraschallbehandelt. Nach der Beschallung wird das entionisierte Wasser aus dem Glasbehälter entsorgt. Anschließend wird 70 %iger Ethanol in den Glasbehälter mit den Objektträgern gegeben, der dann zur Sterilitätssicherung in einen standardmäßigen Sicherheitswerkbank eingebracht wird.Nach dem Spülen mit 70 % Ethanol wird der Edelstahlständer aus dem Glasbehälter entfernt, und die Objektträger werden mehrere Stunden oder über Nacht vollständig trocknen gelassen. Anschließend werden die Objektträger im Sicherheitswerkbank, indem sie in einen mit PLL-Lösung gefüllten Behälter getaucht werden. Die Objektträger werden mindestens drei Stunden oder über Nacht in der PLL-Lösung belassen.Nach der PLL-Beschichtung wird die PLL-Flüssigkeit aus der Schale entfernt und anschließend werden die Objektträger gründlich mit entionisiertem Wasser gespült. Nach mehrmaligem Spülen des mit PLL beschichteten Glases mit Wasser wird die Schale mit Wasser gefüllt und die Objektträger dürfen mehrere Stunden im Wasser einweichen. Nach dem Einweichen für mehrere Stunden in entionisiertem Wasser wird das Wasser aus der Schale abgesaugt.Die Objektträger werden schnell gespült und anschließend aus der Schale genommen, in ein Edelstahlgestell gelegt und über Nacht trocknen gelassen. In einem Sicherheitswerkbank werden die Neuron-Geräte in die Sicherheitswerkbank gebracht und gründlich mit 70 %igem Ethanol gespült, um sie zu sterilisieren. Der überschüssige Ethanol wird dann vom Gerät abgesaugt. Die Geräte werden am nächsten Tag über Nacht in der Sicherheitswerkbank trocknen gelassen.Dieses sterile Neuronen-Device wird einfach auf das saubere, sterile und mit PLL behandelte Glas gelegt. Das PDMS bildet mit dem Glas eine reversibel verschließbare Kammer, die flüssigkeitsdicht ist. Ein Device wird durch sanften Druck am Glas fixiert, anschließend werden sofort Zellen oder Medium dem Device zugegeben.Wenn zu lange gewartet wird, bevor Medium oder Zellen nach der Montage dem Gerät hinzugefügt werden, kann dies das Eindringen der Flüssigkeit in das Gerät erschweren. Es ist wichtig zu beachten, dass die Flüssigkeit nicht so leicht in nicht plasmabehandelte Geräte eindringt wie in plasmabehandelte Geräte. Plasmabehandelte Geräte sind anfangs hydrophil, sodass Flüssigkeiten unmittelbar nach der Plasma-Behandlung leicht in das hydrophile Gerät einfließen, während der Durchfluss durch nicht plasmabehandelte Geräte deutlich langsamer ist.In einigen Fällen kann es notwendig sein, eine Pipette zu verwenden, um Flüssigkeit in das Gerät hineinzuzwingen. In diesem Video haben wir Ihnen gezeigt, wie man das Neuronen-Gerät ohne Plasmabehandlung mit einer Abdeckungsscheibe verbindet. Dies ist eine effiziente und kostengünstige Methode, um PDMS reversibel an Glasoberflächen zu befestigen.Wir hoffen, dass Sie dieses Video informativ und hilfreich fanden. Damit schließen wir aus dem John-Labor. Vielen Dank fürs Zuschauen.

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