Name: Verarbeitung von primären Hirntumoren Tissue für Stem Cell Assays und Flow Sortierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-25T11:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Lernen Sie die Verarbeitung von primären Hirntumorgewebe für Stammzell-Assays und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Anreicherung von BTICs zur Untersuchung ihrer Selbsterneuerung und Genexpression.

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Diese Arbeit wurde von der Ontario Institute of Cancer Research (OICR), die Terry Fox Stiftung und der American Association of Neurological Surgeons finanziert.

Ein. Culture of Brain Tumor Tissue <ol><li> Fügen Sie 200 ul aufgetaut Liberase (Roche Applied Science) auf 15 ml künstlichem CSF (aCSF-siehe Tabelle 1) und Platz in 37 ° C Wasserbad. Liberase TM ist eine Mischung aus proteolytischen Enzymen verwendet, um primäre Gewebeproben sowie kultivierten tumorspheres distanzieren. Im Gegensatz zu Trypsin-EDTA, bewahrt die Liberase Methode das Oberflächen-Antigen CD133. Für eine Gewebeprobe von etwa 0,5 cm 3, verwenden wir 200 ul Liberase. Wenn das Gewebe kleiner ist, verwenden wir 100 ul. </li><li> Bringen Ammoniumchloridlösung (Stammzell-Technologien) auf Raumtemperatur. Ammoniumchlorid-Lösung vorsichtig lysiert roten Blutkörperchen mit minimalen Auswirkungen auf die anderen Zellen. Es enthält keine Fixativ. </li><li> In sterile biologischen Sicherheitswerkbank, 5 ml aCSF um Probenbehälter, wirbeln um Gewebe abspülen, dann abpipettieren. Dieser Schritt hilft, um rote Blutkörperchen (RBC) zu entfernen. </li><li> Übertragen Gehirn Tumorgewebe zu einer sterilen 100 mm Petri dish. </li><li> Mit feinen Schere oder Skalpell und Pinzette, zerlegen Gewebe Gülle Konsistenz. </li><li> Sammle Probe unter Verwendung einer 10 ml regelmäßigen Pipette oder einer Pinzette und Transfer-Fragmente in das Röhrchen mit vorgewärmten aCSF mit Liberase. </li><li> Am Inkubator-Schüttler (30 rpm) und auf 37 ° C für 15 min. </li><li> Filtern Sie die Gewebelysat bis 70 um Zellsieb in einem 50 ml-Falcon-Röhrchen. </li><li> Drehen Sie das Filtrat nach unten bei 280 xg für 5 min. </li><li> Überstand entfernen sorgfältig und evaluieren Größe und Farbe der resultierende Zellpellet: Pellets, die rosa oder rot sind anzugeben wachsende Zahl von roten Blutkörperchen. </li><li> Pellet in 1 ml PBS. </li><li> Hinzufügen einer geeigneten Menge von Ammoniumchloridlösung (4-12 ml) auf Pelletgröße und roten Zellkontamination bezogen (der Ammoniumchloridlösung ist sehr schonend und erhöhte Mengen sind nicht schädlich für andere Zellen als Erythrozyten). </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Spin-ZellenFestlegung bei 280 × g für 5 min. </li><li> Waschen einmal mit 10 ml sterilem PBS. </li><li> Resuspendieren in 5 ml NSC Vollmedium (Tabelle 2) und Transfer zu einem ultra-low-Bindung 60 mm Gewebekulturplatten (Corning). Wir verwenden ultra-low-Bindung Petrischalen mit kovalent gebundenen Hydrogel Oberflächen, die hydrophile und neutral geladen, um Zelladhäsion-vermittelte Differenzierung zu minimieren. </li></ol> Für die ersten Tage in der Kultur, nicht ändern, die Medien: top-up nur mit 1-2 ml Medium je nach Bedarf, dann weiter zu Kultur und Change-Medien zu beobachten, wenn die Farbe der Medien wird leicht gelblich. 2. Tumorsphere Dissoziation für die Durchflusszytometrie <ol><li> Bewerten tumorspheres unter dem Mikroskop: Wenn die Kugel Größe&gt; 100 um, Dissoziation wird empfohlen, da größere Kugeln kann nekrotisch in der Mitte. </li><li> Übertragen Kultur 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Fügen Sie 2-3 ml sterile PBS auf die Platte gründlich und fügen Sie konischen Rohr. </li><li> Zentrifuge bei 280 × g für 5 min. </li><li> Überstand entfernen und resuspendieren in 1 - 2 ml steriler PBS. </li><li> Fügen Sie 10 ul Liberase. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C-Wasserbad für 3 min. Entfernen und visuell auswerten Aufhängung, wenn mehrere Klumpen zu sehen, sanft verreiben mit einem 1.000 ul Pipettenspitze. </li><li> Wenn Verklumpung auftritt, weiterhin Inkubation für eine zusätzliche 1-2 min. </li><li> Waschen der Zellen durch Zugabe von 5 ml sterilem PBS und Zentrifugieren bei 280 × g für 5 min. </li><li> Überstand entfernen und resuspendieren in 500-1,000 ul sterilem PBS 2 mM EDTA. </li><li> Bewerten Zellzahl und Lebensfähigkeit unter Verwendung von Trypanblau. </li><li> Passen Zellzahl zu 1 Million / ml in PBS + 2 mM EDTA. </li></ol> 3. Oberflächenfärbung <ol><li> Übertragen Sie 100 ul von 1x10 6 / ml Zellsuspension pro Test 12x75 mm Strömungsrohre. </li><li> Fügen Sie entsprechende Menge von Antikörpern. Abgestimmt Isotyp Kontrollen sollten für jeden verwendet werdenAntikörper (siehe Tabelle 3). </li><li> Inkubieren für 30 min auf Eis. </li><li> 2 ml PBS 2 mM EDTA zu jedem Strömungsrohr. </li><li> Zentrifugation bei 200 xg für 4 min, dekantieren und Blot. </li><li> Pellet in 300 ul PBS 2 mM EDTA. </li><li> Fügen Sie 10 ul 7AAD Lebensfähigkeit Farbstoff in jedes Röhrchen pipettieren und für mindestens 15 Minuten auf dem Eis. </li><li> Analysieren mittels Durchflusszytometrie. </li></ol> 4. Durchflusszytometrie und-analyse Die Einzelheiten der Erfassung und Analyse von Flow Daten Gerät abhängig. Vertreter negativen Proben laufen und Geräteeinstellungen für Forward (Größe) und Side (Granularität) streuen etabliert. Diese Streuung Muster ermöglicht dem Endbenutzer, um alle Zellen in der Probe zu sehen, darunter Schutt. Eine Region wird in der Regel um die Zellen von Interesse gezogen. (Abbildung 4a) Die Einstellungen werden dann für alle Fluoreszenz-Detektoren erforderlich, um die negativen Zellen innerhalb der ersten Dekade des AF-Position aufgebautluorescence Intensitätsverteilung. Wenn mehr als ein Farbstoff oder Fluorochrom verwendet wird, muss einzigen gefärbten Steuerelemente auszuführen, um Farbe Korrekturwerte (Subtraktion störende Fluoreszenz-Emissionen) zu etablieren. Beim Ausführen von lebenden Zellen eine Lebensfähigkeit Farbstoff wie 7-AAD (7-Amino-Actinomycin D - Anregung 488/emission 655) verwendet wird, und einem zweiten Bereich gezogen, um abgestorbene Zellen (Abb. 4b) auszuschließen. Beide Bereiche werden zu keiner weiteren Analyse der Proben aufgebracht. 5. Selbst-Erneuerung Assay Der Schlüssel-Assay, die sich stark durch klonale Wachstum Kugel erleichtert ist die in-vitro-Test der Selbsterneuerung Kapazität, der Grenzverdünnung Assay. Tumorspheres dissoziiert und verteilt in Verdünnungen bis zu einer einzelnen Zelle pro Vertiefung, und die Geschwindigkeit der nachfolgenden Bereich Bildung über 7 Tagen in Kultur berechnet. Am Tag 7, wird der Prozentsatz der Vertiefungen ohne Gehalt Kugeln für jede Zelle Plattierungsdichte (F 0) berechnet und gegengegen die Anzahl der Zellen pro Vertiefung (x). Die Anzahl der Zellen erforderlich ist, um mindestens eine in jedem gut tumorsphere bilden wird aus dem Punkt, an dem die Leitung kreuzt die 0,37 Niveau (F 0 = e-x) bestimmt. In einer Poisson-Verteilung von Zellen, F 0 = 0,37 entspricht der Verdünnung von einer Zelle pro Napf, so dass diese Berechnung (der 37% schneiden) die Frequenz des klonogenen Stammzellen in der gesamten Zellpopulation (Abbildung 5) reflektiert. 6. Single Cell RT-PCR Einzelne Zellen aus verschiedenen Populationen von Beckman Coulter MoFlo XDP auf Reaktionsstellen auf einem AmpliGrid Schieber (Beckman Coulter cat # AG480F) sortiert. Einzelne Zelle RT-PCR unter Verwendung AmpliGrid Single One Step RT-PCR-System (Beckman Coulter cat # OAX04515) nach den Angaben des Herstellers. Kurz gesagt, wird eine einzelne Zelle in jede Reaktionsstelle eines AmpliGrid Objektträger aufgebracht; die Anwesenheit einer einzelnen Zelle in jedemReaktionsstelle durch Mikroskopie bestätigt. Reverse Transkription (RT) wird unmittelbar nach dem Sortieren, um die Probe nicht beeinträchtigt wird durchgeführt. Die RT Master Mix wird frisch zubereitet, nach Testvorschrift (Tabelle 4). Wir verwendeten 0,03 ul 25 uM Zufallsprimern (Promega) pro Reaktion; 1 ul Mastermix ist an der Mitte jeder Reaktionsstelle zugegeben. Dies wird sofort mit 5 ul Versiegelungslösung (Beckman Coulter cat # OAX04503) beschichtet. Verwendung einer Folie AmpliSpeed ​​Zykluseinrichtung (Beckman Coulter, cat # OAX04101), Objektträger werden bei 25 ° C für 10 min, 42 ° C für 10 min und 55 ° C für 45 min. Nach der reversen Transkription, 3 ul DNAse / RNAse-freiem Wasser ist jedem Reaktionsstelle zugegeben und die gesamte Mischung zu einem PCR-Röhrchen (1 Röhre / Stelle) übertragen. 8 ul qPCR Master Mix (5 ul Sybr Green (Quanta), 1 ul Wasser, 1 ul 10 uM vorwärts und rückwärts Primer mix) plus 2 &amp;: In einer PCR-Platte wird eine Reaktion Volumen von 10 ul für die quantitative PCR verwendetmu; l des RT Mischung. Für Echtzeit-Quantifizierung, Proben auf einem BioRad Cycler ausgeführt mit folgendem Programm: 95 ° C für 10 min, 45 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 60 ° C für 60 sec, 72 ° C für 60 sec, gefolgt von 10 min bei 72 ° C und Schmelzkurvenanalyse. Ct-Werte wurden mit Opticon Monitor 3 (BioRad). Drei Gene pro Zelle beurteilt werden, einschließlich GAPDH als Housekeeping-Gen. Genexpression zu GAPDH normalisiert Expression, nach Anspruch 2-ACt. Mindestens ein Dutzend einzelne Zellen des gleichen Bevölkerung von der gleichen Art verwendet werden, wie biologische Replikate aus Mangel an technischen Replikate zu kompensieren. 7. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 zeigt eine Magnetic Resonance Imaging (MRI)-Scan eines repräsentativen Patienten mit GBM. Hirntumor Proben aus mündigen Patienten sofort nach der Operation erhalten, als genehmigt von der Hamilton Health Sciences / McMaster Health Sciences Research Ethics Board. Ein Teil jeder Probe wird der Neuropathologe für die klinische Routinediagnostik gegeben. Der verbleibende Probe wird verarbeitet, wie in Abbildung 2 dargestellt. Die Tumorzellen, einmal in völliger neuralen Stammzelle Medien mit Wachstumsfaktoren, Form tumorspheres ausplattiert wie in Abbildung 3 dargestellt. Die Tumorzellen werden mit neuronalen Oberfläche Stammzellmarkern CD133 und CD15 etikettiert und durch Durchflusszytometrie analysiert, wie in Abbildung 4 dargestellt. Einzelne Zellen aus verschiedenen Populationen für zB CD15 + / CD133 +, CD15 + / CD133-, CD15-/CD133 +, CD15-/CD133- werden dann in 96-Well-Platten (5a) oder in AmpliGrid Dias (6a) sortiert. In der 96-Well-Platte können einzelne Zellen, die Selbst-Erneuerung Kapazität (zB CD133 + Zellen), (5b) besitzen, bilden tumorspheres (Abbildung 5c) nach incubation. Ein Selbsterneuerung Graph kann aufgetragen (Figur 5d) durch Zählen der Anzahl von Kugeln pro Vertiefung ausgebildet werden. Einzelzellen in die Reaktionsstelle der AmpliGrid Schlitten (6a) sortiert. Die RNA aus Zellen extrahiert einzigen revers transkribiert werden kann unter Verwendung des Advalytix AmpliSpeed ​​(Abbildung 6b). Die erhaltene cDNA wird verwendet, um in Echtzeit RT-PCR (6c) durchzuführen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig1.jpg"> Abbildung 1. Magnetresonanztomographie (MRI) eines Patienten GBM. MRT des Gehirns eines 16-jähriges Mädchen mit einer einmonatigen Geschichte der Kopfschmerzen und einer Woche Geschichte Erbrechen, Lethargie und visuelle Unschärfe. Axial FLAIR-Sequenz zeigt eine große bi-hemisphärische ("Schmetterling") GBM. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig2.jpg"> Abbildung 2. Hirntumor Verarbeitung. Hirntumor Proben sind obtaINED vom mündigen Patienten sofort nach der Operation. Sie sind mechanisch dissoziiert als (a) gezeigt und sind dann enzymatisch dissoziiert aCSF mit Liberase durch Inkubation in einem 30 min-Rocking-Inkubator bei 37 ° C für 15 min (b). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig3.jpg"> Abbildung 3. BTIC Populationen bilden tumorspheres in der Kultur. Dissoziierte Hirntumorzellen in völliger neuralen Stammzellen Medien mit Wachstumsfaktoren beschichtet bilden tumorspheres. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig4.jpg"> Abbildung 4. Die durchflusszytometrische Analyse der BTIC Populationen. (A) Forward gegenüber Seitwärtsstreuung Eigenschaften bereitzustellen ein Bild von allen Zellen, einschließlich Schmutz (b) Zellen, die mit der Lebensfähigkeit Farbstoff 7-AAD Flecken werden von der Analyse ausgeschlossen. (C) Die Position der statistischen Quadranten bestimmt wird unter Verwendung geeigneter Steuerungen Isotyp (d) Tumorzellen mit Oberflächen ma angefärbtrkers CD15-PE und CD133-APC. (D) MoFlo XDP Zellsortierer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4111/4111fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig5.jpg"> Abbildung 5. Grenzverdünnung Analyse BTICs offenbart ihre Selbsterneuerung Kapazität. (A) Zellen der unterschiedlichen Verdünnungen in 96 Vertiefungen, enthaltend 200 ul NSC zu (b) einer einzelnen Zelle pro Well sortiert werden. (C) Nach einer 7-tägigen Inkubationszeit wird ein tumorsphere gebildet. Die Morphologie der sekundären tumorspheres ist identisch mit der primären tumorspheres. (D) Die mittleren x-Achsenabschnitt Werte können aus Grenzverdünnung Analyse für jeden Tumorsubtyp um die Anzahl der Zellen erforderlich ist, um mindestens einen tumorsphere pro Vertiefung bilden offenbaren berechnet. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig6.jpg"> Abbildung 6. Genexpressionsanalysen aus einer einzigen Zelle BTICwiederholen, indem einzelne Zelle RT-PCR-Technologie. (a) Einzel-Zellen aus einer Population kann auf BTIC AmpliGrid Folien sortiert werden. (B) cDNA-Synthese wird auf einzelne Zellen auf AmpliGrid Dias mit dem Advalytix AmpliSpeed ​​durchgeführt. (C) Quantitative Realtime PCR basiert auf der cDNA von einzelnen BTIC Zellen synthetisiert durchgeführt. <table border="1"><tbody><tr><td> 2 M NaCl </td><td> 62 ml </td></tr><tr><td> 1M KCl </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 3,2 ml </td></tr><tr><td> 155 mM NaHCO 3 </td><td> 169 ml </td></tr><tr><td> 1M Glucose </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 108 mM CaCl 2 </td><td> 0,9256 ml </td></tr><tr><td> PURELAB Ultra-H 2 0 </td><td> 749,84 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Artificial Liquor (aCSF) -. 1.000 ml. <table border="1"><tbody><tr><td> Lager Basal Medien </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> 01.01 DMEM: F12 </td><td> 480 ml </td></tr><tr><td> N2 Ergänzung </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 3,0 g </td></tr><tr><td> N-Acetylcystein (60 ug / ml) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Neural Überleben factor-1 (NSF-1) </td><td> 10 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Neuralen Stammzellen Medien. NSC komplette Medien (frisch zubereitet vor der Verwendung): NSC Grundmedien + 20 ng / ml EGF (epidermal growth factor) + 20 ng / ml bFGF (basic fibroblast growth factor) + 10 ng / ml LIF (Leukämie inhibierender Faktor) * + 10 ul / ml Antibiotikum-Antimykotikum * Leukemia inhibitory factor (LIF): Dieses Reagenz von Millipore enthält ein Interleukin 6 Klasse Cytokin, ein protein die spontane Differenzierung von Stammzellen zu fördern längerfristige Wartung der Stammzell-Kulturen unterdrückt. <table border="1"><tbody><tr><td> Antikörper </td><td> Lieferant / CAT # </td><td> ul / test (in 100 ul) </td></tr><tr><td> CD133 / 2 APC (293C3) </td><td> Miltenyi Biotec/130-090-854 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> IgG2b APC (Isotyp-Kontrolle) </td><td> Miltenyi Biotec/130-092-217 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> CD15PE </td><td> Beckman Coulter/IM1954U </td><td> 5 </td></tr><tr><td> IgG2a PE (Isotyp-Kontrolle) </td><td> Beckman Coulter/A09141 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> Beckman Coulter/A07704 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Durchfluss Antikörper. <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Volume (1 Reaktion) </td><td> Volume (48 Reaktion) </td></tr><tr><td> 2x Single Cell RT Reaktionspuffer </td><td> 0,50 ul </td><td> 30,0 ul </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor (10 U / ul) </td><td> 0,02 ul </td><td> 1,2 ul </td></tr><tr><td> 5X Single Cell RT-Enhancer </td><td> 0,15 ul </td><td> 9,00 ul </td></tr><tr><td> Single Cell RT Enzyme Mix </td><td> 0,04 ul </td><td> 2,4 ul </td></tr><tr><td> Advablue (OAX04227) </td><td> 0,1 ul </td><td> 6,00 ul </td></tr><tr><td> Nuclease freies Wasser </td><td> bis zu 1 ul </td><td> machen bis zu 60 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. Zusammensetzung des RT Master Mix für Single Cell RTPCR (cat # OAX04515).

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<li>Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sorting%3A+automated+separation+of+mammalian+cells+as+a+function+of+intracellular+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence.</a> Science. 166, 747(1969).</li>
<li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495(1975).</li>
<li>Barrett, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+does+not+predict+tumor+growth+potential+in+mouse+models+of+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-renewal does not predict tumor growth potential in mouse models of high-grade glioma.</a> Cancer Cell. 21, 11(2012).</li>
<li>Venugopal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+marks+intermediate+precursors+during+differentiation+of+human+brain+tumor+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Bmi1 marks intermediate precursors during differentiation of human brain tumor initiating cells.</a> Stem Cell Res. 8, 141(2012).</li>
<li>Gerlinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N. Engl. J. Med. 366, 883(2012).</li>
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<li>Maheshri, N., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+with+noisy+genes%3A+how+cells+function+reliably+with+inherent+variability+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Living with noisy genes: how cells function reliably with inherent variability in gene expression.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 413(2007).</li>
<li>Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4, e309(2006).</li>
<li>Ross, I. L., Browne, C. M., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+of+individual+genes+in+eukaryotic+cells+occurs+randomly+and+infrequently%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription of individual genes in eukaryotic cells occurs randomly and infrequently.</a> Immunol. Cell Biol. 72, 177(1994).</li>
<li>Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol. Aspects Med. 27, 95(2006).</li>
<li>Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+mRNA+using+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantification of mRNA using real-time RT-PCR.</a> Nat. Protoc. 1, 1559(2006).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Krebsstammzelle Hypothese 10, auf der Arbeit bei Leukämie 21 basierend, Brustkrebs 11 und Hirnkrebs 4,5, legt nahe, dass nur ein relativ kleiner Teil der Zellen im Tumor, bezeichnet Krebsstammzellen, eine Fähigkeit, ausgiebig proliferieren und selbst besitzen erneuern. Die meisten der Tumorzellen die Fähigkeit verlieren, sich zu vermehren und selbst zu erneuern, als sie in Zellen, die die phänotypische Signatur des Tumors zu differenzieren. Den Schlüssel Zellen im Gehirn T...

Hirntumoren gehören zu den aggressiven und heterogene Krebsarten beim Menschen bekannt. Obwohl ihre frühere Erkennung und Diagnose von modernen bildgebenden Technik erleichtert worden, wir noch fehlt kurative Therapien für vielen Hirntumoren, insbesondere für diffuse, invasive Einsen oder diesen sich tief im Gehirn. Hirntumoren stellen die Hauptursache der Krebssterblichkeit im Kindesalter aufgrund ihrer sehr aggressiven und oft unheilbaren Natur. Glioblastom (GBM), der häufigsten primären Hirntumoren bei Erwachsenen, ist einer der aggressivsten Krebserkrankungen des Menschen, für seine gleichmäßig tödlichen Prognose 1 gefürchtet. Diese hoch-malignen astrozytären Tumor (WHO Grad 4) tritt meist in den zerebralen Hemisphären von Erwachsenen, und kann auch bei kleinen Kindern und Säuglingen auftreten. Sein Wachstum ist schnell und infiltrative und diagnostische pathologischen Merkmale sind Kernpolymorphie, mikrovaskuläre Proliferation und Nekrosen 2,3. Für adults mit neu diagnostiziertem GBM, mediane Überlebenszeit nur selten erstreckt sich über 12 Monate 1, mit allgemein schlechte Antworten auf alle therapeutischen Modalitäten. Wir haben festgestellt, dass es viele funktionale und genetische Ähnlichkeiten durch somatische Stammzellen und Krebszellen geteilt, und dass die molekularen Signalwege, die normale Entwicklung des Gehirns reguliert werden häufig in der Krebstherapie fehlreguliert. Bei der Anwendung der Stammzellbiologie Paradigmen zur Untersuchung von Hirntumoren, wir waren die ersten Forscher, die prospektiv zu identifizieren und zu reinigen eine Subpopulation von Zellen aus menschlichen GBMs, die Stammzell-Eigenschaften der Proliferation, Selbsterneuerung ausgestellt, und die Differenzierung in vitro 4 und in vivo 5. Wir wendeten Kulturbedingungen und Assays ursprünglich zur normalen neuralen Stammzellen (NSC) in vitro 6,7 charakterisieren, um mehrere Kinder-und Erwachsenen Hirntumoren und angereichert für diesen Stamm-ähnlichen Zellen durch Zellsortierung für das neuronale Vorläuferzellen Zelloberflächenmarker CD133 8 ,9. Die CD133 + Gehirntumor Fraktion enthaltenen Zellen, die eine viel höhere Frequenz als das Tumorinitiation CD133-Fraktion in NOD-SCID Mäusehirnen 5,10 hatte. Dieses formal festgestellt, dass nur eine seltene Untergruppe von Hirntumoren Zellen mit Stammzell-Eigenschaften Tumor-Initiierung, verdienen sie den Namen &quot;Gehirntumor initiierende Zellen&quot; oder &quot;BTICs&quot; sind. Der Roman Identifizierung BTICs gibt neue Einblicke in das menschliche Gehirn Tumorgenese, geben starke Unterstützung für die Krebsstammzellen Hypothese 10-13 als Grundlage für die vielen soliden Tumoren und stellt eine neuartige zelluläre Ziel für eine effektivere Krebstherapien 14-20. Therapien, die sich auf das Töten der Großteil des Tumors die seltene stielartigen Bruchteil verpassen kann, so dass der Tumor weiter wachsen. Therapien, die sich auf das Töten der Krebsstammzellen eine bessere Behandlung und Prognose für Patienten mit Hirntumoren vorsehen. Um BTIC Populationen zu untersuchen, haben wir unsere cultu verfeinertre Protokolle speziell für Zellpopulationen innerhalb der menschlichen Hirntumoren, die Stammzell-Eigenschaften besitzen wählen. Serumfreiem, neurale Stammzellen (NSC) Medium ermöglicht die Wartung von einer undifferenzierten Stammzellen Zustand, und die Zugabe von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), und Leukämie inhibierenden Faktor (LIF) ermöglicht die Verbreitung von Multi-potent, sich selbst erneuernden und erweiterbaren menschlichen tumorspheres. Hier beschreiben wir die Methoden bei der Verarbeitung von primären Hirntumoren und Kultivierung sie in NSC Medium für BTIC Bevölkerung bereichern beteiligt. Wir nannten unsere experimentellen Modellsystem &quot;BTIC Patienten Isolate&quot;, die Tatsache, dass diese Zellen nur minimal unter Stammzellen kultiviert betonen Zelle Bedingungen für Stammzellpopulationen auszuwählen. Nachfolgende Immunmarkierung von BTIC Populationen für Schlüssel Stammzellmarkern wie CD133 und CD15 und Durchflusszytometrie-Analyse wird ebenfalls beschrieben. Dann besprechen wir die Grenzverdünnung Analyseder Beihilfen bei der Untersuchung der Selbsterneuerung Potenzial BTICs. Schließlich untersuchen wir die Genexpressionsanalyse dieser seltenen Zellen durch Sortierung einzelnen Zellen auf AmpliGrid Dias und Durchführung einzelne Zelle RT-PCR. Diese Techniken sind auch anwendbar auf andere Hirntumore wie Medulloblastom, Ependymom und pädiatrische Gliomen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> 01.01 DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-082 </td></tr><tr><td> N2 Ergänzung </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> Wisent </td><td> 330-050-EL </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Invitrogen </td><td> 15023-021 </td></tr><tr><td> N-Acetylcystein </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A9165-25g </td></tr><tr><td> Neural Überlebensfaktor -1 (NSF-1) </td><td> Lonza Clonetics </td><td> CC-4323 </td></tr><tr><td> Epidermal Growth Factor (EGF) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E9644 </td></tr><tr><td> Basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0261 </td></tr><tr><td> Leukämie inhibierenden Faktor (LIF) </td><td> Millipore </td><td> LIF1010 </td></tr><tr><td> Antibiotikum / mykotischen </td><td> Wisent </td><td> 450-115-EL </td></tr><tr><td> Liberase TM </td><td> Roche </td><td> 05 401 119 001 </td></tr><tr><td> Ammoniumchloridlösung </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 07850 </td></tr></tbody></table>

verarbeitung von primären hirntumoren tissue für stem cell assays und flow sortierung

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Hirntumoren sind typischerweise aus morphologisch unterschiedlichen Zellen, die eine Vielzahl von neuronalen Marker exprimieren Linie besteht. Nur ein relativ kleiner Teil der Zellen im Tumor mit Stammzelleigenschaften, genannt Gehirntumor initiierende Zellen (BTICs), besitzen die Fähigkeit, entlang mehrerer Abstammungslinien unterscheiden, selbst zu erneuern, und initiieren Tumoren in vivo. Wir wendeten Kulturbedingungen ursprünglich für normalen neuralen Stammzellen (NSC) an einer Vielzahl von menschlichen Gehirntumoren verwendet und festgestellt, dass diese Kultur spezifisch Verfahren wählt für stielartigen Populationen. Serum-freiem Medium (NSC) ermöglicht die Aufrechterhaltung eines undifferenzierten Stammzellen Zustand, und die Zugabe von bFGF und EGF ermöglicht die Verbreitung von Multi-potent, sich selbst erneuernden und erweiterbaren tumorspheres. Zur weiteren Charakterisierung der einzelnen Tumors BTIC Bevölkerung, werten wir Zelloberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie. Wir können auch sortieren Bevölkerung von Interesse für die besonderen characterization. Selbsterneuerung Assays sind auf einzelnen BTICs in 96 Well-Platten sortiert durchgeführt, die Bildung von tumorspheres nach Inkubation bei 37 ° C zeigt das Vorhandensein von einem Stamm oder Vorläuferzelle. Mehrere Zellzahlen von einer bestimmten Population können auch in verschiedenen Brunnen für Grenzverdünnung Analyse sortiert werden, um sich selbst zu erneuern Fähigkeit zu analysieren. Wir können auch studieren differentiellen Genexpression innerhalb einer bestimmten Zellpopulation mit einzelnen Zelle RT-PCR. Die folgenden Protokolle beschreiben unser Verfahren zur Dissoziation und Kultivieren von primären humanen Proben zum Nachweis BTIC Populationen sowie die Dissoziation von tumorspheres anzureichern. Ebenfalls eingeschlossen sind Protokolle für die Färbung für Durchflusszytometrie Analyse oder Sortierung, Selbsterneuerung Assays und einzelne Zelle RT-PCR.

Die Identifizierung von Gehirntumor initiierende Zellen (BTICs), die seltenen Zellen innerhalb einer heterogenen Tumor besitzt Stammzell-Eigenschaften, liefert neue Einblicke in das menschliche Gehirn Tumor Pathogenese. Wir haben spezifische Kulturbedingungen verfeinert für BTICs bereichern, und wir routinemäßig Durchflusszytometrie weiter bereichern diese Populationen. Selbsterneuerung Assays und Transkript Analyse durch einzelne Zelle RT-PCR kann anschließend auf diesen isolierten Zellen durchgeführt werden.

Verarbeitung von primären Hirntumoren Tissue für Stem Cell Assays und Flow Sortierung

Hirntumoren setzen sich typischerweise aus morphologisch diversen Zellen zusammen, die eine Vielzahl von Markern der neuralen Linie exprimieren. Nur ein relativ geringer Anteil ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Hirntumor-initiierende Zellen in vitro zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem primäre humane Tumoren zunächst mechanisch und enzymatisch dissoziiert und dann unter Stammzellserum-freien Kulturbedingungen kultiviert werden. Die nächste Kugelbildung wird über drei bis fünf Tage überwacht.Die Tumorkugeln werden dann wieder enzymatisch verdaut und ihre Oberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie ausgewertet. Der letzte Schritt besteht darin, die gewünschten Zellen für die weitere Charakterisierung in 96-Well-Platten oder PL-Gitter-Objektträger zu sortieren. Letztendlich kann die Selbsterneuerungsfähigkeit und die differentielle Genexpression der sortierten Population durch Limitverdünnungsanalyse und Einzelzell-R-T-P-C-R bewertet werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Massentumoranalyse, besteht darin, dass sie prospektiv die Hirntumor initiierenden Zell- oder Krebsstammzellpopulationen isoliert. Wir hatten die Idee zu dieser Methode erstmals, als wir die Kulturbedingungen, die ursprünglich für normale neurale Stammzellen verwendet wurden, auf eine Vielzahl von menschlichen Hirntumoren

processing-primary-brain-tumor-tissue-for-stem-cell-assays-flow

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video zeigt, Protokoll der Isolierung und Expansion von Stammzellen, wie Zellen, die aus operativ entfernt menschlichen Glioblastom mutliforme (GBM) Tumorgewebe mit dem Neurosphäre Assay Kultur-Methode.

Isolation und Expansion der menschlichen Glioblastoma multiforme Tumorzellen unter Verwendung der Neurosphäre Assay

Diese Video-Protokoll zeigt ein neues Verfahren zur Erzeugung und anschließender Reinigung von neuronalen Vorläuferzellen aus einer erneuerbaren Quelle von neuralen Stammzellen (NSC) an körperlicher (Größe und Granularität internen) und fluoreszierenden Eigenschaften unter Verwendung von Durchflusszytometrie-Technologie.

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

Diese Video-Protokoll zeigt die Anwendung des Fluoreszenzfarbstoffs Carboxyfluorescein-succinimidylester (CFSE) zur Identifikation und Trennung von verschiedenen Subpopulationen von Zellen in humanen Glioblastomzellen nach der Häufigkeit des Zellteilung basiert.

Identifizierung und Isolierung von Slow-teilenden Zellen im menschlichen Glioblastoma Mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

In diesem Bericht beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung von hochreinem Populationen von Leukozyten, die Tumore infiltrieren. Dieses Protokoll wird aus der Miltenyi Biotech-Protokoll geeignet ist, Ausbeute und Reinheit zur Isolierung von Zellen aus komplexen Tumorgewebe zu verbessern.

Isolierung von Immunzellen aus Primärtumoren

Das Video zeigt die Isolierung von tumorinfiltrierenden mononukleären Zellen des peripheren Blutes aus einem Mäusegehirn durch mechanische Dissoziation und enzymatische Verdauung. Daran schließt sich eine Dichtegradientenzentrifugation an, um die Immunzellen für die weitere Analyse zu sammeln.

Isolierung tumorinfiltrierender Immunzellen aus einem Gehirn von Mäusen

Dieser Artikel beschreibt die Herstellung von frisch gewonnenen Melanomgewebe in primären Zellkulturen und wie Kontaminationen von Erythrozyten und Fibroblasten von den Tumorzellen zu entfernen. Schließlich beschreiben wir, wie...

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Wir berichten über eine auf Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS) basierende Methode, um neurale Stammzellen (NSCs) und ihre Nachkommen aus der subventrikulären Zone (SVZ) des adulten Mäusegehirns zu isolieren. Angewendet auf FUCCI-transgene Mäuse (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator) ermöglicht es die Untersuchung des Zellzyklusverlaufs durch Live-Bildgebung.

Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Dargestellt ist hier die einfache Methode zur Isolierung und Durchflusszytometrieanalyse Gliom-infiltrierenden mononukleären peripheren Blutzellen, die zeitabhängige quantitative Daten über die Anzahl und Aktivierungsstatus von Immunzellen in das Gehirn frühen Tumorumgebung ergibt.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

Eine effizientes Screening-Protokoll wird für die Identifikation von kleinen Molekülen präsentiert, die Astroglial Differenzierung in Glioblastom Stammzellen (vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen) zu fördern. Der Test basiert auf Stammzell-Differenzierung Reporter, wobei der Ausdruck der verbesserte GFP (eGFP) durch den menschlichen GFAP Projektträger angetrieben wird.

Flow Cytometry-based Drug Screening-System für die Identifizierung von kleinen Molekülen, die zelluläre Differenzierung von Stammzellen Glioblastom zu fördern

Intratumorale Heterogenität ist ein inhärentes Merkmal von Tumoren, einschließlich Gliomen. Wir haben ein einfaches und effizientes Protokoll entwickelt, das eine Kombination aus Puffern und Gradientenzentrifugation verwendet, um einzelne Kerne aus frischem gefrorenem Gliomgewebe für Einzelkern-RNA- und ATAC-Sequenzierungsstudien zu isolieren.

Kernisolierung aus frischen gefrorenen Hirntumoren für Einzelkern-RNA-seq und ATAC-seq

Lernen Sie die Verarbeitung von primären Hirntumorgewebe für Stammzell-Assays und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Anreicherung von BTICs zur Untersuchung ihrer Selbsterneuerung und Genexpression.

Verarbeitung von primären Hirntumoren Tissue für Stem Cell Assays und Flow Sortierung

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