Verarbeitung von primären Hirntumoren Tissue für Stem Cell Assays und Flow Sortierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Hirntumor-initiierende Zellen in vitro zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem primäre humane Tumoren zunächst mechanisch und enzymatisch dissoziiert und dann unter Stammzellserum-freien Kulturbedingungen kultiviert werden. Die nächste Kugelbildung wird über drei bis fünf Tage überwacht.

Die Tumorkugeln werden dann wieder enzymatisch verdaut und ihre Oberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie ausgewertet. Der letzte Schritt besteht darin, die gewünschten Zellen für die weitere Charakterisierung in 96-Well-Platten oder PL-Gitter-Objektträger zu sortieren. Letztendlich kann die Selbsterneuerungsfähigkeit und die differentielle Genexpression der sortierten Population durch Limitverdünnungsanalyse und Einzelzell-R-T-P-C-R bewertet werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Massentumoranalyse, besteht darin, dass sie prospektiv die Hirntumor initiierenden Zell- oder Krebsstammzellpopulationen isoliert. Wir hatten die Idee zu dieser Methode erstmals, als wir die Kulturbedingungen, die ursprünglich für normale neurale Stammzellen verwendet wurden, auf eine Vielzahl von menschlichen Hirntumoren anwendeten und feststellten, dass diese Kulturmethode, die speziell für stammzellähnliche Populationen ausgewählt wurde, das Verfahren demonstriert, von den Postdoktoranden der CHITRA AL-Doktoranden, bran Van Manen und Sarah Nolte, durchgeführt wird. und unsere Durchflusszytometrie-Technikerin Nicole McFarland, alle aus unserem Labor Beginnen Sie damit, 200 Mikroliter Auftauliase zu 15 Millilitern künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit oder A CSF hinzuzufügen und dann den Schlauch in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad zu legen. Bringen Sie die Ammoniumchloridlösung zu diesem Zeitpunkt ebenfalls auf Raumtemperatur.

Geben Sie dann fünf Milliliter A CSF in einen Probenbehälter mit Hirntumorgewebe, schwenken Sie den Behälter zum Spülen und spritzen Sie ihn dann von der Flüssigkeit ab, um die roten Blutkörperchen zu entfernen. Übertragen Sie nun das Gewebe in eine sterile 100 Millimeter Petrischale und zerkleinern Sie das Gewebe mit einer feinen Schere und Pinzette auf eine Slurry-Konsistenz. Entnehmen Sie dann die Probe mit einer normalen 10-Milliliter-Pipette und einer Pinzette und übertragen Sie die Gewebefragmente in das Röhrchen mit dem vorwarmen A-Liquor.

Legen Sie das Röhrchen mit Liase bei 30 U/min und 37 Grad Celsius auf einen Inkubatorschüttler. Und nach 15 Minuten filtrieren Sie das Gewebelysat durch ein Sieb mit sieben D-Mikrometern in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Schleudern Sie das Filtrat fünf Minuten lang bei 280 GS bei Raumtemperatur herunter.

Entfernen Sie dann vorsichtig die Schlinge und beurteilen Sie die Größe und Farbe des resultierenden Pellets. Als nächstes resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter PBS und fügen Sie dann eine angemessene Menge Ammoniumchloridlösung hinzu, die auf der Pelletgröße und der Kontamination der roten Blutkörperchen basiert. Nach einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur schleudern Sie die Zellen nach einer zweiten Wäsche in PBS herunter, resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern Neurostammzell-Komplettmedium und überführen Sie die Zellsuspension dann für die ersten Tage auf eine 60-Millimeter-Gewebekulturplatte mit extrem geringer Bindung.

Füllen Sie die Kulturen nach Bedarf mit ein bis zwei Millilitern Medium auf und wechseln Sie das Medium nur, wenn die Farbe leicht gelb wird. Beginnen Sie mit der Übertragung der Tumor-Sphysenkultur in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie zwei bis drei Milliliter steriles PBS hinzu, um die Platte gründlich zu spülen, und geben Sie dann die Wäsche in das Tumorschlauch.

Entfernen Sie nach dem Schleudern der Zellen die Schlinge und resuspendieren Sie das Pellet in ein bis zwei Millilitern sterilem PBS und fügen Sie dann 10 Mikroliter Liase hinzu. Eine Herausforderung dieser Technik besteht darin, die Lebensfähigkeit der soliden Tumorstammzellen während der Verarbeitung zu erhalten. Jede Manipulation der Zellen während der Kultivierung und Sättigung erfordert eine sanfte Berührung.

Als nächstes inkubieren Sie das Röhrchen in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Entfernen Sie die Aufhängung nach drei Minuten und bewerten Sie sie visuell. Wenn mehrere Klumpen zu sehen sind, verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipettenspitze, um den Zellcluster vorsichtig zu iterieren.

Waschen Sie nun die Zellen in fünf Millilitern sterilem PBS und resuspendieren Sie das Pellet nach Entfernen des S-Überstands in 500 bis 1000 Mikrolitern sterilem PBS plus zwei Millimolaren EDTA. Nachdem Sie schließlich die Zellzahl und Lebensfähigkeit mit Trian Blue bewertet haben, passen Sie die Zellzahl auf 1 Million Zellen pro Milliliter in PBS plus EDTA an. Beginnen Sie mit der Übertragung von 100 Mikrolitern der Zellsuspension pro Test auf einzelne 12 x 75 Millimeter große Durchflussröhrchen.

Nach Zugabe der entsprechenden Antikörper inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang auf Eis und waschen Sie dann alle ungebundenen Antikörper in zwei Millilitern PBS plus EDTA pro Röhrchen ab. Dekantieren Sie nun die Waschlösung, tupfen Sie die Röhrchen ab und resuspendieren Sie dann die Zellpellets in weiteren 300 Mikrolitern PBS plus EDTA. Geben Sie dann 10 Mikroliter der sieben A- bis D-Viabilitätsfarbstoffe in jede Tube.

Nachdem die Röhrchen mindestens 15 Minuten lang auf Eis inkubiert wurden, sind die Zellen bereit für die durchflusszytometrische Analyse. Nachdem Sie die Parameter für die Vorwärts- und Seitenstreuung mit der negativen Kontrollprobe angepasst haben, zeichnen Sie einen Bereich um die interessierenden Zellen, der dem in diesem repräsentativen oberen Diagramm gezeigten ähnelt. Passen Sie die Spannung an den Fluoreszenzdetektoren an, die verwendet werden, um die negativen Zellen innerhalb der ersten zwei Dekaden zu platzieren.

Verwenden Sie als Nächstes den Viabilitätsfarbstoff sieben A a a d, um eine zweite Region für den Ausschluss toter Zellen zu erstellen, die der in diesem repräsentativen oberen Diagramm gezeigten Region ähnelt. Wenden Sie dann sowohl das Scatter- als auch das Live-Cell-Gate auf alle Fluoreszenzdiagramme an und verwenden Sie die einzelnen färbten Steuerelemente, um jegliche spektrale Überlappung zu subtrahieren. Führen Sie abschließend die Beispiele aus.

Beginnen Sie den begrenzenden Verdünnungsassay, indem Sie die dissoziierten Zellen mit unterschiedlicher Verdünnung zu einer einzelnen Zelle pro Vertiefung in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte sortieren, die 200 Mikroliter NSC-Medien-Neurosphären enthält, die sich normalerweise über einen Zeitraum von sieben Tagen bilden, und die Rate der nachfolgenden Kugelbildung während der letzten sieben Tage in Kultur kann für Einzelzell-R-T-P-C-R berechnet werden. Nachdem Sie einzelne Zellen aus den interessierenden Populationen auf die Reaktionsstellen eines großzügigen Gitterobjektträgers sortiert haben, fügen Sie einen Mikroliter Mastermix in die Mitte jeder Reaktionsstelle hinzu und beschichten Sie dann sofort jede Stelle mit fünf Mikrolitern Deckenlösung. Inkubieren Sie dann den Objektträger mit einem Slide Cycler mit reichlicher Geschwindigkeit für drei Temperaturzyklen.

Nach der reversen Transkription fügen Sie an jeder Reaktionsstelle drei Mikroliter rasefreies Wasser von DN a hinzu. Übertragen Sie dann die gesamte Mischung von jedem Reaktionsort auf einzelne PCR-Röhrchen. Lassen Sie die Proben schließlich für eine Echtzeit-Quantifizierung auf einem BioRad-Cycler laufen.

Diese erste Abbildung zeigt eine Magnetresonanztomographie eines repräsentativen Patienten mit Glioblastom. Die dissoziierten Tumorzellen können mit den Stammzellmarkern der neuralen Oberfläche, CD 1 33 und CD 15, markiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert werden, wie in diesem repräsentativen Punktdiagramm dargestellt. Hier ist das Amplifikationsdiagramm für die repräsentative einzellige R-T-P-C-R-Reaktion dargestellt.

Die CT-Werte, die aus einem solchen Diagramm erhalten werden, können verwendet werden, um die relativen Expressionsniveaus der interessierenden Gene zu berechnen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie primäres Hirntumorgewebe enzymatisch dissoziiert und kultiviert werden kann, um es für Stammzellpopulationen anzureichern. Sie wissen auch, wie Sie die Selbsterneuerungsfähigkeit und die differentielle Genexpression von sortierten Stammzellpopulationen untersuchen können, indem Sie eine Limitierungsverdünnungsanalyse oder eine Einzelzell-R-T-P-C-R durchführen.