Name: Generation, Reinigung und Charakterisierung von Cell-invasive DISC1 Protein Spezies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Erfahren Sie die Reinigung und Charakterisierung von DISC1-Protein-Aggresomen für Neurobiologie-Forschung. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung zellinvasiver Proteine in neuronalen Zellkulturen und im lebenden Gehirn.

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Diese Arbeit wurde von NEURON-ERANET entdecken (BMBF 01EW1003) an CK und JPH, DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) finanziert, um CKVB wird durch einen Zuschuss der Forschungskommission der Medizinischen Fakultät der Universität Düsseldorf unterstützt.

Ein. Vorbereitung der Aggresomen Spenderzellen: Transfektion von monomerem Red Fluorescent Protein (mRFP) oder Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP)-markierten menschlichen Full Length (FL) DISC1 <ol><li> Seed 1,5 x 10 6/10 cm Schale humanen Neuroblastom NLF (NLF; Kinderkrankenhaus von Philadelphia, Philadelphia, PA) Zellen in zehn 10 cm Gerichte und über Nacht wachsen. NLF Zellen werden in RPMI-1640-Medium mit 10% FBS kultiviert, Penicillin / Strepomycin, L-Glutamin. Am nächsten Tag sollten die Zellen bei 70-80% Konfluenz sein. </li><li> Transient zu transfizieren jede 10 cm Schüssel mit 15 ug Plasmid-DNA und Metafectene Transfektionsreagenz (Biontex, Martinsried, Deutschland). In kurzen, für eine 10 cm Schale wurden 15 ug Plasmid-DNA und 30 ul Metafectene bis 750 ul Opti-MEM zugegeben, gemischt und bei RT für 20 min. 5 Gerichte wurden mit pcDNA3.1 mRFP / eGFP-markierten menschlichen (FL) DISC1 und 5 Gerichte mit eGFP-Plasmid allein transfiziert. </li></ol> 2. AggresomenReinigung aus transfizierter Donorzellen Die hier beschriebene Protokoll ist eine Kombination eines Verfahrens, um Lewy-Bodies aus Gehirngewebe 13 und einem Protokoll, um große Aggregate und Aggresomen 14 isolieren reinigen. Da bereits bestehender Verfahren auf die Verwendung von Reinigungsmitteln, die Isolierung von Detergens-freien Protein für die Anwendung bei der Zell-Assays basieren Invasivität ist kritisch. <ol><li> 48 h nach der Transfektion, zur Überwachung der Expression des eGFP und mRFP/eGFP-DISC1 und bestätigen die Bildung von Aggresomen unter einem Fluoreszenz-Mikroskop (Abbildung 1). </li><li> Waschen Sie die Zellen mit PBS pH 7,4, kratzen mit 400 ul PBS jeder, fügen 1X Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Indianapolis, IN) und stören die Zellen unter Verwendung eines Precellys24 Homogenisator (Bertin Technologien, Frankreich). Kurz, 1 ml Zellsuspension auf eine 2 ml Lyse überführen und 10 Keramikkugeln. Lyse der Zellen mit 3 x 60 sec Impulse. Die mechanische Kraft des Prozesses kannErhöhung der Temperatur in der Probe oberhalb 37 ° C, so ist darauf zu achten, um die Probe auf Eis nach dem Lyseverfahren Chill werden. </li><li> Kühlen Sie die Zellen auf Eis und mit 10 mM MgCl 2, 40 U / ml DNase A und inkubieren für 60 min bei 37 ° C </li><li> Planen Lösungen von 80%, 50%, 20% Sucrose (w / v) in PBS pH 7,4 (10 ml). </li><li> Vorbereiten des Saccharosegradienten in einem 15 ml Falcon-Röhrchen, beginnend mit 2 ml 80% Saccharose, gefolgt von 50% und 20%. Gießen Sie die Steigung langsam und vorsichtig sein, nicht bereits gegossen Schichten stören. Schicht das verdaut Lysat auf der Oberseite des Gradienten und Zentrifuge für 15 min bei 1000 xg bei 4 ° C. </li><li> Sorgfältig sammeln Zwischenphase zwischen der 50-80% Saccharose-Schicht mit einer Pipette und gemischt mit 5 Volumina PBS pH 7,4. Zentrifuge für 15 min bei 1000 × g bei 4 ° C. Wiederholen Waschen zwei weitere Male. In dieser Zwischenphase sind Aggresomen fluoreszierenden und visualisiert werden kann in einem Mikroskop unter UV-Licht. </li><li> Überstand verwerfen unddas Pellet in 250-500 ul PBS pH 7,4. Dieses Pellet enthält das gereinigte Aggresomen (Abbildung 2). </li></ol> 3. Die Behandlung des Empfängers SH-SY5Y Zellen mit mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomen <ol><li> Samen 5 x 10 4 Empfängers SH-SY5Y menschlichen Neuroblastomzellen konstitutiv GFP-DISC1 (598-854) auf sterilen Deckgläschen in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen. SH-SY5Y-Zellen werden in Medium mit DMEM/F-12 Penicillin / Streptomycin, nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) und 10% FBS kultiviert. </li><li> 24 Stunden später, mit 10 ul in jede Vertiefung und inkubieren für 48-72 Std. </li><li> Waschen Sie die Zellen 3 x mit PBS pH 7,4 und stillen extrazellulären Fluoreszenz mit 0,04% Trypanblau für 5 min. </li><li> Befestigen Sie die Zellen mit 4% PFA in PBS pH 7,4 für 10 min auf Eis, einmal gründlich mit sterilem H 2 O und montieren Sie die Deckgläser auf Glasplättchen mit ProLong Gold mit DAPI Montage-Medium (Invitrogen, USA). </li><li> Bestätigen Sie die Aufnahme /Invasion von exogen applizierten Aggresomen durch Kolokalisation mit rekrutiert Proteine ​​Empfänger-Zellen in Z-Stapel-Bildern ausgedrückt. </li></ol> Dennoch könnte Aufnahme / Invasion von exogenen Proteins nicht wesentlich parallel mit einer Rekrutierung von Wirtszellprotein detektiert werden. In unserem Beispiel mRFP-markierten DISC1 Aggresomen Rekruten lösliche GFP-markierten DISC1 (598-854)-Protein von der Wirtszelle (siehe Abbildung 3) ausgedrückt. Die Bilder wurden auf einem Zeiss LSM 510 konfokalen-oder Zeiss Axiovision Apotome2 Lupe genommen. 4. Erzeugung von rekombinanten DISC1 (598-785) In einer früheren Veröffentlichung analysierten wir die Fähigkeit verschiedener DISC1 Proteinfragmente Selbständige interagieren bezogen auf das Vorhandensein von Selbstassoziation Domänen. Unter allen Proteinfragmenten getestet menschlichen DISC1 (598-785) zeigten die stärksten Multimerisierung Anschaffungsneigung 4 (Abbildung 4). Daher wurde die menschliche DISC1 (598-785) in pET15b kloniert (NoVagen, Madison, Wisconsin) mit einem N-terminalen 6-Histidin-Tag, ausgedrückt in E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, USA), und unter denaturierenden Bedingungen in 8 mol / l Harnstoff als 4 beschrieben gereinigt. Kurz gesagt, wird das Protokoll unten beschrieben. <ol><li> BL21-(IDE3) Rosetta E. coli wurden in 2 x 500 ml 2YT gezüchtet, das 5 mM-Arginin-HCl, 5 mM MgSO4, 100 ug / ml carbencillin, 35 ug / ml Chloramphenicol bis zu einer OD 600: 0,6-0,8 und DISC1 (598-785) die Expression induziert mit 1 mM IPTG. </li><li> DISC1 (598-785) für 4 h bei 37 ° C exprimiert wird, wurde die Expression durch Ernten der Bakterien durch Zentrifugation beendet. </li><li> Das Bakterienpellet wurde in 50 ml TE-Puffer (50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) und 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml Lysozym, 20 mM MgCl 2 und 400 ml resuspendiert U/50 DNase I. Um vollständige Lyse zu gewährleisten, wurde die Reaktion für 30 min bei RT unter vorsichtigem Rühren inkubiert. </li><li> Hinzufügen 10 mM β-Mercaptogruppeoethanol (ME) und 500 mM NaCl und Inkubation für weitere 30 min. </li><li> Spindown bakteriellen Einschlusskörperchen bei 20.000 g für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Pellet in 50 ml Extraktionspuffer, enthaltend 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 8 M Harnstoff und 10 mM β-ME und entfernen Verunreinigungen durch Zentrifugation bei 20.000 g für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen das Ni-NTA-Agarose-Matrix mit Extraktionspuffer. Inkubieren der resuspendierten, vorgereinigtes Proteinextrakt mit Ni-NTA-Matrix für 2 h bei RT. </li><li> Waschen das Ni-NTA-Matrix mit Extraktionspuffer, enthaltend 12 mM Imidazol. </li><li> Eluieren des Proteins langsam mit 15 ml Elutionspuffer 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM Imidazol, 8 M Harnstoff, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA und 10 mM β-ME. </li><li> Dialysieren das Protein schrittweise auf PBS pH 7,4 mit 10 mM β-ME. </li></ol> Aus 1 L bakteriellen Startkultur ist es möglich, Isolat bis zu 50 mg rekombinanter DISC1 (598-785) protEin. α-Synuclein Rückfaltung Für Experimente mit α-Synuclein, 500 ug des rekombinanten Proteins (Sigma-Aldrich, USA) wurde in PBS in einer Konzentration von 1 mg / ml gelöst. Um Oligomere zu erhalten, Rückfaltung wurde über Nacht bei 37 ° C, wie in einer früheren Veröffentlichung 10 beschrieben. 5. Kennzeichnung von rekombinanten DISC1 (598-785) mit DyLight594 <ol><li> Vor der anschließenden Labelling-Verfahren, DISC1 (598-785)-Protein ist das von β-ME befreit werden. Daher wird das Protein 3 mal in PBS pH 7,4 dialysiert bei einer Verdünnung von 1:2.000. </li><li> Label 1 mg DISC1 (598-785) mit DyLight 594 Maleimid (Thermo Scientific, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, löst 1 mg / ml Protein in PBS pH 7.4 und 5 mM TCEP hinzuzufügen, um freie Thiolgruppen zu erholen. Fügen Sie 20 ul der DMF gelösten Farbstoff der Reaktion und inkubieren für 2 h bei RT. </li><li> Dialysieren das Protein 3 x PBS pH7,4 in einem Verhältnis von 1:2000 für 2 Stunden jeweils. </li></ol> Zur weiteren Steigerung der Reinheit des markierten Proteins einen His 6-Tag basierte Affinitätsreinigung auf eine Ni-NTA-Säule durchgeführt wird. <ol start="4"><li> Waschen 1 ml Ni-NTA-Matrix (Qiagen, Deutschland) mit 10 ml PBS pH 7,4. </li><li> Anwenden des markierten, dialysierte Protein an der Säule und ließ es über die Säule langsam laufen. </li><li> Waschen des Proteins mit 3 x 20 ml PBS pH 7,4 </li><li> Eluieren des Proteins mit PBS pH 7,4, 500 mM Imidazol tropfenweise während der Überwachung des farbigen Band auf der Ni-NTA-Säule, das Eluat Volumen zu reduzieren. </li><li> Dialysieren des Eluats 3 x bis 10 mM NaPi pH 7,4 bei einer Verdünnung von 1:2000 für 2 Stunden jeweils. </li><li> Verwenden Sie eine sterile 0,45 um Spritzenfilter das Eluat, Aliquot in 5 x 100 ul Proben und Schnellfrostmedium in flüssigem Stickstoff zu filtern. 1 pg / ml in je 100 ul Aliquot - Die Gesamtmenge des Proteins sollte 0,5 sein. </li></ol> optional konzentration Schritt <ol start="10"><li> Für stereotaktische rat Injektionen, wurde das Protein 10-fach in einer Speed-Vac (Eppendorf Concentrator 5301) konzentriert. Der letzte Puffer Bedingung war 100 mM NaPi. </li></ol> α-Synuclein Labeling Die Markierung und Reinigung (Ni-NTA-Säule) des rekombinanten α-Synuclein wurde parallel zur DISC1 (598-785) durchgeführt. Die gesamte Ausgangsmaterial war 500 ug statt 1 mg DISC1 (598-785). 6. Die Behandlung des Empfängers SH-SY5Y Zellen mit markierten rekombinanten DISC1 (598-785) Protein <ol><li> Saatgut 5x10 4 Empfängers SH-SY5Y menschlichen Neuroblastomzellen konstitutiv GFP-DISC1 (598-854) auf sterilen Deckgläschen in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen. </li><li> Hinzufügen markiertes Protein zu dem Zellkulturmedium in einer Konzentration von 5-10 ug / ml und 48 bis 72 Stunden inkubieren. </li><li> Waschen Sie die Zellen 3 x mit PBS pH 7,4 und stillen Extraktionellular Fluoreszenz mit 0,04% Trypanblau für 5 min. </li><li> Befestigen Sie die Zellen mit 4% PFA in PBS pH 7,4 für 10 min auf Eis, einmal gründlich mit sterilem H 2 O und montieren Sie die Deckgläser auf Glasplättchen mit ProLong Gold mit DAPI Montage-Medium (Invitrogen, USA). </li><li> Bestätigen Sie die Aufnahme / Invasion von exogen applizierten rekombinanten Proteins durch Kolokalisation mit rekrutiert Proteine ​​Empfänger-Zellen in Z-Stapel-Aufnahmen von Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie generiert ausgedrückt. Noch, Rekrutierung von endogenem Protein nicht könnten wesentlichen parallel Invasion Wirtszellprotein detektiert werden können Z-Stapel noch bestätigen die invasive Natur des Proteins. </li></ol> In unserem Beispiel rec. DISC1 (598-785) * zumindest teilweise löslich Rekruten DISC1 (598-854)-Protein durch die Wirtszelle (siehe 5A) ausgedrückt GFP-markierten. Für die rekombinante α-Synuclein Invasion, aber keine Einstellungen angezeigt wird (Abbildung 5B). Bilder aufgenommen wurdenauf einem Zeiss LSM 510 konfokalen-oder ein Zeiss Axiovision Apotome2 Mikroskop. Die Injektion der konzentrierten (ca. 4 ul von 2,5 ug / ul), beschriftet DISC1 (598-785) * in die mPFC Ergebnisse bei der Verbreitung des Proteins an der Einstichstelle, die auch nach Perfusion des Tieres mit erfasst werden kann 4% PFA in PBS pH 7,4 mit einem Rhodamin Filtersatz. In unserem Beispiel DISC1 (598-785) eingerichtet ist, durch eine bestimmte Anzahl von Neuronen entnommen und kann mit Z-Stapel bildgebenden (Abbildung 6) überwacht werden. Im Allgemeinen haben die Injektion von anderen Proteinen dann diejenigen welche hier nicht unbedingt auf Zell-Invasion führen. Die Invasion Ereignis ist im wesentlichen abhängig von der Art des Proteins, ist trotzdem eine saubere Reinigung eine Voraussetzung für eine weitere Analyse. 7. Repräsentative Ergebnisse Aggresomen bestehend aus rekombinantem FL DISC1-eGFP gereinigte vom NLF Zellen eingedrungen Empfänger SH-SY5Y cells bei niedrigen Wirkungsgrad (ca. 0,3% 5) durch Kolokalisation mit der konfokalen Mikroskopie (Abbildung 3). Wie bereits berichtet, äußerte DISC1 (598-785) und gereinigt aus E. coli gebildet Multimere 4 waren gleich Zell-invasiven bei einem Wirkungsgrad von ca. 20% 5 (5A) ähnlich dem von α-Synuclein, die parallel als positive Kontrolle (5B) verwendet wurde. Markierten rekombinanten DISC1 (598-785) exprimiert und aus E. coli war auch Zell-invasive Neuronen in vivo, wenn das multimere Protein wurde stereotaktisch in den medialen präfrontalen Kortex einer Ratte (Abbildung 6; Pum, Bader, Huston, Korth, unveröffentlicht) injiziert. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. NLF Neuroblastomzellen transient exprimierenden FP-DISC1 (rot). Rot fluoreszierende Aggresomen kann VerschlechterungCTED innerhalb der Zellen. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Gereinigtes DISC1 Aggresomen nach der Reinigung in einem Sucrosegradienten mRFP-tagged. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Fluorescent Bild überfallen Aggresomen. mRFP-markierten flDISC1 Aggresomen wurden gereinigt und mit SH-SY5Y Neuroblastomzellen inkubiert überexprimierenden lösliche GFP-markierten DISC1 (598-854). Eine Aufnahme von markiertem Aggresomen wird durch Z-Stapel Bildgebung an einem Laser-Scan-Mikroskops (Zeiss LSM 510) überwacht. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. SEC-Profil rec. DISC1 (598-785), das den C704 S704 und die single nucleotide polymorphisms (SNPs). Beide Varianten weisen eine Unterbrechung von geordneten Oligomerisierung und die Bildung von hochmolekularen multIMers (roter Pfeil). Dieses Bild ist von der Veröffentlichung Leliveld et al., Biochemistry 2009 geändert. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Fluorescent Z-Stapel Bild invasive DyLight-markierten rekombinanten DISC1 (598-785). SH-SY5Y-Neuroblastom-Zellen, löslichen GFP-DISC1 (598-854) wurden inkubiert mit markierten, rekombinanten Proteins in einer Konzentration von 5 pg / ml. (A) Red Aggregate zeigt die Invasion der rec. DISC1 (598-785)-Protein und gelben Punkte zeigen eine Rekrutierung von löslichem GFP-DISC1 (598-854) in Aggregaten. (B) Rekombinante α-Synuclein (rot) dringt die Zellen ohne Rekrutierung mit einer Frequenz von etwa 20%. <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Immunfluoreszenz Bilddas injizierte markierten rekombinanten DISC1 (598-785)-Protein. Z-Stapel Bildgebung bestätigt das Vorhandensein von rec. DISC1 (598-785)-Protein von Ratten kortikalen Neuronen mit einem Antikörper gegen neuronale Kerne (NeuN, grün) angefärbt.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In dieser Studie beschreiben wir die Reinigung von mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomen aus einer transfizierten Neuroblastom-Zelllinie, die Vorbereitung und Kennzeichnung eines rekombinanten DISC1 Proteinspezies und deren Anwendung in der Zell-Invasion Versuche des Empfängers Zellen in vitro und in vivo. Die Reinigung des nativen mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomen wurde aus Protokollen entwickelt, Lewy-Körper-ähnliche Strukturen und größere Aggregate 13, 14 isolieren, aber modifiziert, um die Verwendung von Detergenzien zu vermeiden und die Gefahr von falsch-positiven Zell-Invasion, die auftreten könnten minimieren durch Detergens-erleichterte Membranpenetration. Eine mögliche zukünftige Verbesserung könnte der in eine weitere Erhöhung der Reinheit der Aggresomen durch Beschallung vollständig getrennten restlichen Membranen und Zytoskelett von den Aggresomen sein. Durch Erhöhung Gesamtreinheit, die Anzahl der gesamten Invasion Ereignisse, die für große Aggresomen ma aufgezeichneteny 5 erhöht werden. Ob die eingeschränkte Definition der von uns vorgeschlagenen 3-Phasen-Saccharose ausreichend für Aggresomen andere Protein-Spezies ist muss geprüft werden, in diesem Sinne das Protokoll hier skizzierten sollte als Ausgangspunkt für individuelle Optimierung berücksichtigt werden. Die gereinigten Aggresomen erwies sich als sehr robust in unseren Händen, zusätzliche Waschschritte (ohne Reinigungsmittel), um Spuren von Saccharose nicht signifikant reduzieren die Gesamtausbeute zu beseitigen. In einer früheren Veröffentlichung wir beschrieben, dass Oligomeraufbau des DISC1 abhängig deutliche Multimerisierungsdomänen in der C-Terminus 4 (Abbildung 4). Wir entschieden uns für dieses Fragment für die rekombinante lösliche Expression in E. coli und anschließender und Ni-NTA-Reinigung. Seine Multimerisierung überwachen und ihre Invasivität Zelle mit einer Zelle beschrieben invasive Protein wie α-Synuclein vergleichen, etikettiert wir DISC1 (598-785) mit dem Fluoreszenzfarbstoff DyLight594 und verglichen ihreZell-Invasivität mit der gleichen Bezeichnung α-Synuclein. Das Zell-Invasivität des rekombinanten DISC1 Fragment wurde dramatisch im Vergleich zu der von nativem, in voller Länge DISC1 Aggresomen, wahrscheinlich aufgrund seiner geringeren Größe und viel höhere Reinheit erhöht. Wieder scheint Reinheit eine entscheidende Rolle bei der Zell-Invasivität zu spielen. In unserem Beispiel die invasiven Aggresomen rekrutiert lösliche Protein-Homolog des Ziel-Zelllinie, die rekombinant in einer löslichen, dh Zell-dispergierter Form exprimiert wurde. Die Expression eines fluoreszierenden Proteins (zB GFP oder RFP) in den Empfänger-Zelllinie ist ein Vorteil, da sie die Co-Lokalisation von invasiven Aggresomen und rekombinanten Proteine ​​innerhalb der Empfängerzelle Grenzwert über-Z-Stapel Bildgebung ermöglicht. Cell-invasive DISC1 Aggresomen und multimeren Fragmenten exprimiert und aus E. coli konnte ein bestimmendes Merkmal eines Proteins Konformationsänderungen Erkrankungen im Zusammenhang mit DISC1, DI werdenSC1opathies 15. Fehlersuche: Low Aggresomen Ausbeute nach Saccharosegradienten Reinigung: Die Saccharose-Gradienten in diesem Protokoll eingeführt funktioniert gut mit eGFP/mRFP-DISC1 (FL) Aggresomen. Aggresomen aus anderen Proteinen könnte der variable Dimensionen daher die Saccharose-Konzentrationen sollten durch andere Benutzer optimiert werden. Ungenügende Reinigung von rekombinanten Proteins: Irgendwelche bakteriellen Kontaminanten in dem Reinigungsverfahren des rekombinanten Proteins wird auch in späteren Schritten des Protokolls zu kennzeichnen. Um Verschmutzungen zu vermeiden, laufen die das Protein auf einem SDS-PAGE und bestätigen, dass das rekombinante Protein mindestens 95% rein ist durch Färbung mit Coomassie-Blau. Um höchste Qualität und Ausbeute zu gewährleisten, muss das Protokoll für jedes einzelne Protein optimiert werden. Low Kennzeichnung efzienz von rekombinanten Proteinen: Etwaige Verunreinigungen, die freien SH-Gruppen enthalten verringert effiziente Markierung des Proteins. Daher ist extensive Dialyse und Ni-NTA-basiertes Reinigungsverfahren erforderlich.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagent Namen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td> Medium hängt von der Wirtszelllinie. Die optimale Empfänger Zelllinie sollte vom Anwender bestimmt werden. </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-033 </td><td> Medium hängt von der Empfänger-Zelllinie. Die optimale Empfänger Zelllinie sollte vom Anwender bestimmt werden. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td> Andere Transfektionsreagenzien könnte genauso gut funktionieren, aber nicht mit unserem Protokoll getestet. </td></tr><tr><td> Ni-NTA Agarose </td><td> Qiagen </td><td> 30210 &lt;/ Td&gt; <td> Die Experimente mit Ni_NTA Agarose von Qiagen durchgeführt wurden, sollten andere Lieferanten als gut zu funktionieren. </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td><td> Es besteht keine Notwendigkeit für RNase freier DNase im Prozess der Aggresomen Aufreinigung. </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-062 </td><td> Serum-freiem Medium funktioniert auch </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td> Zuschlag für SH-SY5Y und NLF Medium </td></tr><tr><td> Nicht wesentlichen-Amino-Säuren (NEAA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> Zuschlag für SH-SY5Y Medium </td></tr><tr><td> Trypanblau 0,4% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td> Toxic Reagenz </td></tr><tr><td> DyLight 594 Maleimide </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 46608 </td><td> Cystein reduziert Reaktivfarbstoffs zu stabilen Thioetherbindungen bilden. Auch in anderen Farben erhältlich. </td></tr><tr><td> ProLong Gold mit DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36935 </td><td> Diese antifade flüssigen Deckfluessigkeit gab hervorragende Ergebnisse in unseren Händen. </td></tr><tr><td> Protease-Inhibitor-Cocktail </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Lösen Sie 1 Tisch in 500 ul H 2 O für 100X Lösung. </td></tr><tr><td> Synthetische a-Synuclein </td><td> Sigma </td><td> S7820 </td><td> Falten wie im Text beschrieben. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle spezifischen Reagenzien. </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td> Bertin Technologies </td><td> 03119.200.RD000 </td><td> Wir haben keine anderen mechanischen Homogenität geprüftnizers andere als diese. Andere Mittel frei Homogenisierung Methode könnte auch funktionieren, aber nicht für dieses Protokoll getestet. </td></tr><tr><td> 5301 Concentrator (Speedvac) </td><td> Eppendorf </td><td> 5301 000.210 </td><td> Nur notwendig, wenn Protein zu konzentrieren. </td></tr><tr><td> LSM 510 und Axiovision Apotome2 </td><td> Zeiss </td><td> Siehe Hersteller Katalog </td><td> Beide Mikroskope beherbergen die Fähigkeit, Z-Stapel Bildgebung durchzuführen. Dies ist eine Voraussetzung für solide und ernsthafte Evaluierung der Invasion Veranstaltungen. </td></tr><tr><td> Zellkultur Kunststoff </td><td> Nunc </td><td> 10 cm Schalen # 172.958, 24-well Platten # 142.475 </td><td> Die Verwendung von unterschiedlichen Kunststoffmaterial beeinflussen könnten die Wechselwirkung von rekombinanten Proteinen oder Aggresomen und die Kunststoffoberflächen. Wir haben keine anderen Materialien als den hier beschriebenen getestet. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle der spezifischen Material und Ausrüstung. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Anzahl </td><td> Buffer Namen </td><td> Inhalt </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Ein. </td><td> Bakterielle Wachstumsmedium </td><td> 16 g / l Bacto Trypton, 10 g / l Bacto Hefeextrakt, 5 g / l NaCl, 5 mM-Arginin-HCl, 5 mM MgSO4, 100 ug / ml carbencillin, 35 ug / ml Chloramphenicol </td><td> Bakterien wachsen auf OD 600: 0.6-0.8 induzieren die Expression mit 1 mM IPTG. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Bakterielle Resuspensionspuffer </td><td> 50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml Lysozym, 20 mM MgCl 2 und 400 ml DNase I U/50 </td><td> Resupend Bakterienpellet von 1 L overnight Kultur in 50 ml Resuspensionspuffer. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Protein Extraktionspuffer </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 8 M Harnstoff und 10 mM b-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4. </td><td> Ni-NTA-Säule Waschpuffer </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 8 M Harnstoff und 10 mM b-ME, 12 mM Imidazol </td><td> Geändert Extraktionspuffer mit 12 mM Imidazol zugegeben. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Ni-NTA-Säule Elutionspuffer </td><td> 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM Imidazol, 8 M Harnstoff, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA und 10 mM b-ME </td><td> Der Elutionspuffer enthält 10 mM b-ME, die später wird dialysiert. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> PBS </td><td> 8 g / l NaCl, 0,2 g / l KCl, 1,44 g / l Na 2 HPO 4, 0,24 g / l KH 2 PO 4, pH 7,4 einzustellen </td><td></td></tr><tr><td>7. </td><td> Labeling-Puffer </td><td> PBS, das 5 mM TCEP </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Tabelle von Rezepten. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

generation, reinigung und charakterisierung von cell-invasive disc1 protein spezies

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Proteinaggregation wird als allgemeines Kennzeichen von chronischen, degenerativen Gehirn Verhältnissen, beispielsweise bei den neurodegenerativen Erkrankungen Morbus Alzheimer (Aß, tau) gesehen, Parkinson-Krankheit (α-Synuclein), Huntington-Krankheit (Polyglutamin, Huntingtin), und andere. Proteinaggregation angenommen wird, entstehen durch gestörte proteostasis, dh das Ungleichgewicht zwischen dem Entstehen und Abbau von falsch gefalteten Proteinen. Zu beachten ist, sind die gleichen Proteine ​​gefunden aggregiert sporadische Formen dieser Krankheiten, die Mutante in seltenen Varianten von familiären Formen sind. Schizophrenie ist eine chronische, fortschreitende Gehirn Bedingung, dass in vielen Fällen geht einher mit einer dauerhaften und irreversiblen kognitives Defizit. In einem Kandidatengen Ansatz untersuchten wir, ob Störungstag-in-Schizophrenie 1 (DISC1), ein Gen in einer schottischen Familie mit Anbindung an chronischen psychischen Erkrankung 1, 2 geklont, als unlösliche Aggregate im brai gefunden werden konnten der sporadischen Fälle von Schizophrenie 3. Mit dem SMRI CC, identifizierten wir in etwa 20% der Fälle mit CMD aber nicht normalen Kontrollen oder Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen Sarkosyl unlösliche DISC1 Immunreaktivität nach biochemischer Fraktionierung. Nachfolgende Studien in vitro zeigten, dass die Aggregation Neigung DISC1 durch krankheits-assoziierte Polymorphismus S704C 4 beeinflusst wurde, und dass DISC1 Aggresomen in vitro generiert wurden Zell-invasive 5, ähnlich dem, was war für Aß 6 gezeigt, tau 7-9, α -Synuclein 10, Polyglutamin 11 oder SOD1 Aggregate 12. Diese Ergebnisse schlagen vor veranlasste uns, dass mindestens eine Untermenge von Fällen mit CMD solche mit aggregierten Proteins DISC1 könnte konformationelle Erkrankungen. Hier beschreiben wir, wie wir DISC1 Aggresomen in Säugetierzellen zu erzeugen, reinigen sie auf einem Saccharose-Gradienten und nutzen sie für Zell-Invasivität studies. Ebenso beschreiben wir, wie wir eine ausschließlich multimeren C-terminalen DISC1 Fragment, Label generiert und reinigen es für die Zelle Invasivität Studien. Mit den rekombinanten Multimere DISC1 erreichen wir ähnliche Zell Invasivität wie bei einer ähnlich bezeichneten synthetischen α-Synuclein-Fragment. Wir zeigen, daß dieses Fragment sich in vivo aufgenommen wenn stereotaktisch in das Gehirn des Empfängers Tiere injiziert.

Die Erzeugung, Reinigung und Zellinvasion von intrazellulären, zytoplasmatischen voller Länge DISC1 Protein Aggresomen aus Zellkulturen und einer markierten, multimere rekombinante DISC1 Proteinfragment in<em&gt; E. coli</em&gt; Beschrieben. Zelle Invasivität für Empfängerzellen in Zellkultur und für Neuronen gezeigt<em&gt; In vivo</em&gt; Nach stereotaktischen Hirn-Impfung.

Generation, Reinigung und Charakterisierung von Cell-invasive DISC1 Protein Spezies

Die Proteinaggregation wird als allgemeines Kennzeichen chronischer, degenerativer Hirnerkrankungen angesehen, wie zum Beispiel bei den neurodegenerativen Erkrankungen Alzheimer-Krankheit (Aβ, Tau), Parkinson-Krankheit (α-Synuclein), Huntington-Krankheit (Polyglutamin, Huntingtin) und anderen. Es wird angenommen, dass die Proteinaggregation aufgrund einer gestörten Proteostase auftritt, d. h. eines Ungleichgewichts zwischen der Entstehung und dem Abbau fehlgefalteter Proteine. Bemerkenswert ist, dass dieselben Proteine in sporadischen Formen dieser Krankheiten aggregiert vorliegen, die in seltenen Varianten familiärer Formen mutiert sind. Schizophrenie ist eine chronisch progressive Hirnerkrankung, die in vielen Fällen mit einem dauerhaften und irreversiblen kognitiven Defizit einhergeht. Im Rahmen eines Kandidatengen-Ansatzes haben wir untersucht, ob Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), ein in einer schottischen Familie mit einer Kopplung an chronische psychische Erkrankungen geklontes Gen1, 2, in Form von unlöslichen Aggregaten im Gehirn von sporadischen Schizophrenie-Fällen3 nachgewiesen werden konnte. Mithilfe des SMRI CC identifizierten wir in etwa 20 % der Fälle mit chronischen psychischen Erkrankungen, jedoch nicht bei normalen Kontrollen oder Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen, eine sarkosyl-unlösliche DISC1-Immunreaktivität nach biochemischer Fraktionierung. Nachfolgende In-vitro-Studien ergaben, dass die Aggregationsneigung von DISC1 durch den krankheitsassoziierten Polymorphismus S704C4 beeinflusst wurde und dass in vitro erzeugte DISC1-Aggresomen zellinvasiv waren5, ähnlich wie es für Aβ6, Tau7-9, α-Synuclein10, Polyglutamin11 oder SOD1-Aggregate12 gezeigt wurde. Diese Ergebnisse veranlassten uns zu der Hypothese, dass zumindest eine Teilmenge von Fällen mit chronischen psychischen Erkrankungen – jene mit aggregiertem DISC1 – Proteinfehlfaltungskrankheiten sein könnten. Hier beschreiben wir, wie wir DISC1-Aggresomen in Säugetierzellen erzeugen, diese an einem Saccharosegradienten aufreinigen und für Studien zur Zellinvasivität verwenden. Ebenso beschreiben wir, wie wir ein ausschließlich multimeres C-terminales DISC1-Fragment erzeugen, markieren und für Studien zur Zellinvasivität aufreinigen. Unter Verwendung der rekombinanten DISC1-Multimere erreichen wir eine ähnliche Zellinvasivität wie bei einem analog markierten synthetischen α-Synuclein-Fragment. Wir zeigen außerdem, dass dieses Fragment in vivo aufgenommen wird, wenn es stereotaktisch in das Gehirn von Empfängertieren injiziert wird.

Das übergeordnete Ziel der folgenden Verfahren besteht darin, gereinigte Discs zu erzeugen. Eine aggregationsfähige Form, die in der Lage ist, Wirtszellen zu infizieren. Zwei verschiedene Methoden, um dieses Ziel zu erreichen, werden mit der ersten Methode demonstriert.Das asomale bildende fluoreszierende Protein-Disc-Eins-Fusionsprotein wird in NLF-menschlichen Neuroblastom-Donorzellen überexprimiert. Die Zellen werden anschließend mit PBS gewaschen, gesammelt und ohne Verwendung von Detergenzien lysiert. Die DNA wird digeriert und Agro-Zonen mittels eines Zuckergehaltsystems gereinigt.Agrios, die mit dieser Methode gereinigt wurden, weisen eine geringe Zellinvasions-Effizienz auf. Der alternative Ansatz besteht darin, die Aminosäuren 5 98 bis 7 85 des rekombinanten Disc-one-Proteins in E. coli überzuexprimieren. Das Proteinfragment wird anschließend mit DITE 5 94 markiert, dialysiert und mittels einer NI-NTA-Matrix gereinigt, wodurch alle verbleibenden ungebundenen Farbstoffe und multimeren Disc entfernt werden.Mit dieser Methode erzeugte One-Fragmente weisen eine hohe Zellinvasions-Effizienz zur Beurteilung der Wirtszellinvasion auf. Entweder die gereinigte fluoreszierende Proteinscheibe, One-Risome oder die markierte rekombinante Scheibe. Die One-Fragmente werden mit den gewünschten Empfängerzellen inkubiert.Trian-Blau wird anschließend hinzugefügt, um die extrazelluläre Fluoreszenz zu unterdrücken, und die Invasion wird mittels konfokaler Mikroskopie sichtbar gemacht. Bisher wurde die Proteinausscheidung nicht als Merkmal chronischer psychischer Erkrankungen wie der Schizophrenie anerkannt. Wo das bei Schizophrenie gestörte Protein 1 ein Kandidat für die Zellinvasivität ist, stellt die Bildung von Proteinaggregaten ein kennzeichnendes Merkmal für Proteinkonformationskrankheiten dar.Hier zeigen wir mit zwei Methoden, dass Disc-One-Proteinaggregate zellinvasiv sind, und folglich, dass Disc-One-assoziierte Erkrankungen oder Disc-One-Neuropathien konformationelle Proteinopathien sind. Die beiden Methoden sind erstens die Reinigung des vollständigen Disc-One-ASOS aus Neuroblastomzelllinien und zweitens die Expression eines C-terminalen multimeren Disc-One-Fragments in E. coli sowie die Reinigung und Markierung mit dem fluoreszierenden Farbstoff.Während die erste Methode nur zu einer geringen Effizienz bei der Zellinvasion führt – lediglich 0,3 % der Zellen nehmen die gereinigten Mikrosomen auf – infiziert das gereinigte rekombinante Proteinfragment bis zu 20 % der exponierten Zellen. Die hier beschriebenen Methoden sollten auf andere Proteine übertragbar sein, bei denen die Akrosombildung oder multimerische Assemblierung überzeugend nachgewiesen wurde. In jedem der 10 10-Zentimeter-Dishs.Säen Sie 1,5 × 10⁶ humane Neuroblastom- und LF-Zellen in supplementiertem RPMI 1640-Medium und kultivieren Sie sie über Nacht. Am nächsten Tag sollten die Zellen 70 bis 80 % konfluent sein. Beschriften Sie fünf Petrischalen für die Transfektion mit PCDNA3.1-mRFP und EGFP-markiertem humanen vollständigen DISC1 sowie fünf weitere für die Transfektion mit dem alleinigen EGFP-Plasmid. Kombinieren Sie für jede 10 cm-Schale 15 µg Plasmid-DNA, 30 µl Metafecting und 750 µl.Opti MEM in einem Mikrozentrifugenröhrchen aufnehmen und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren lösen, 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend die DNA-Transfektionsreagenzlösung tropfenweise zu den Zellen geben, um diese zu transfizieren, und die Zellen 48 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO₂ inkubieren. Danach die Expression von mRFP, vollständige Länge, Disc1, überwachen und die Bildung von Agro-Zonen mittels Fluoreszenzmikroskopie bestätigen. Einige Zellen weisen massive Einschlüsse des fluoreszierenden Proteins auf, wie hier gezeigt.Dieses Protokoll kombiniert eine Methode zur Reinigung von Lewy-Körperchen aus Gehirngewebe mit dem Protokoll zur Isolierung größerer Aggregate oder Agrozonen, da bereits bestehende Methoden auf der Verwendung von Detergenzien basieren und die Isolierung detergentienfreier Proteine für die Anwendung in Zellinvasivitätsassays entscheidend ist. Danach das Medium abpipettieren, mit PBS waschen und 400 Mikroliter PBS mit Proteaseinhibitorcocktail hinzufügen. Anschließend die Zellen abkratzen und ein Milliliter Zellsuspension sowie 10 Keramikkügelchen in ein zwei Milliliter fassendes Lysetrögelchen geben.Lysieren Sie die Zellen mit drei 62. Impulsen auf einem Vor-Zelllyse-24-Homogenisator. Die mechanische Kraft des Prozesses kann die Temperatur in der Probe über 37 Grad Celsius ansteigen lassen. Daher sollte darauf geachtet werden, die Probe nach dem Lysevorgang auf Eis abzukühlen. Nach dem Abkühlen der Zellen auf Eis 10 Millimolar Magnesiumchlorid und 40 Einheiten pro Milliliter DNAA hinzufügen und 60 Minuten bei 37 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren.Stellen Sie jeweils 10 Milliliter 80 %, 50 % und 20 %iger Saccharoselösung bezogen auf das Volumen in PBS her. Bereiten Sie dann in einem 15-Milliliter-Konischgefäß den Saccharosegradienten vor, indem Sie mit zwei Millilitern 80 %iger Saccharoselösung beginnen, gefolgt von zwei Millilitern 50 %iger und zwei Millilitern 20 %iger Saccharoselösung. Gießen Sie den Gradienten langsam ein und achten Sie darauf, die bereits eingefüllten Schichten nicht zu stören.Schichten Sie anschließend das verdauten Lysat auf der Gradientenoberfläche auf und zentrifugieren Sie 15 Minuten bei 1000 × g und vier Grad Celsius. Sammeln Sie vorsichtig die Grenzfläche zwischen der 50- und 80-%-Saccharoselösung mit einer Pipette und mischen Sie sie mit dem Fünffachen an Volumen in einem 15-Milliliter-Konizentrifugenröhrchen; zentrifugieren Sie erneut 15 Minuten bei 1000 × g und vier Grad Celsius. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und bewahren Sie das Pellet, das die Agri-Zone enthält.Wiederholen Sie die Waschung an dieser Grenzfläche zwei weitere Male. Agri-Zonen sind fluoreszierend und können nach der letzten Waschung im Mikroskop unter UV-Licht sichtbar gemacht werden; verwerfen Sie danach den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 250 bis 500 Mikrolitern PBS. Dieses Pellet enthält die gereinigten Agro-Zonen.Gebe 10 µL MRFP-Disc, eine Asom-Suspension, in jede Vertiefung einer 24-Loch-Platte mit SHSY5Y-Human-Neuroblastomzellen. Diese exprimieren konstitutiv lösliches GFP-Disc am C-Terminus auf sterilen Glas-Deckgläsern. Inkubiere 48 bis 72 Stunden. Nach der Inkubation wasche die Zellen dreimal mit PBS und unterdrücke die extrazelluläre Fluoreszenz mit 0,04 % Trypanblau für fünf Minuten. Anschließend mit PBS waschen, um das Trypanblau zu entfernen. Danach die Schale auf Eis stellen und 10 Minuten lang 4 % PFA in PBS hinzufügen, um die Zellen zu fixieren. Danach einmal mit steriler Wasser waschen und die Deckgläser mit einem DPI-Mounting-Medium wie prolongiertem Gold auf Objektträgern montieren.Bestätigen Sie die Aufnahme in die Invasion von exogenen Aggro-Zonen durch Kollokalisierung mit rekrutierten Proteinen, die von Empfängerzellen in Zack-Bildern exprimiert werden. Dieser Zack umfasst eine Tiefe von etwa sechs Mikrometern.24 Aufnahmen in Schritten von 200 Nanometern. Die Fluoreszenz der MRFP-markierten Disk-Eins-agri-Zone, dargestellt in Rot, rekrutiert die zytoplasmatische GFPC-markierte Disk-Eins-Zone. Eine Überlagerung, dargestellt in Grün, erscheint gelb und zeigt an, dass die agri-Zonen in das Zytoplasma des Empfängers eingedrungen sind und das zuvor lösliche Disk-Eins-Protein rekrutiert haben.In diesem Teil des Protokolls wird die humane Scheibe eins mit DITE 5 94 markiert. Dieses D ermöglicht die direkte Überwachung des rekombinanten Proteins, ohne dass eine zusätzliche Immunfärbung erforderlich ist. Beginnen Sie damit, das wie im begleitenden Dokument beschrieben hergestellte Protein durch dreimaliges Dialysieren in zwei Litern PBS bei einer Verdünnung von eins zu 2000 von Beta-Mercaptoethanol zu befreien.Als Nächstes ein Milligramm Disc mit DITE 5 94 IDE beschriften, ein Milligramm pro Milliliter Protein in PBS lösen und fünf Millimolar TCEP hinzufügen, um freie TH-Gruppen zurückzugewinnen; 20 Mikroliter des in DMF gelösten Farbstoffs zur Reaktion hinzufügen und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Mithilfe einer SLI-Dialysiskassette mit einer Molekulargewichts-Cutoff-Grenze von 10.000 Dalton das Protein dreimal im Verhältnis 1:2000 in PBS dialysieren, jeweils zwei Stunden lang. Danach die Reinheit des markierten Proteins weiter erhöhen.Eine Affinitätsreinigung basierend auf einem His-Tag an einer NI-NTA-Säule wird durchgeführt. Waschen Sie ein Milliliter NI-NTA-Matrix mit 10 Milliliter PBS, anschließend wird das markierte dialysierte Protein auf die Säule aufgetragen und durch die Säule laufen gelassen.Langsam verliert die Lösung aufgrund der Bindung des Proteins an die NTA-Matrix einen Teil ihrer blauen Farbe; ungekoppelter Farbstoff bleibt im Durchlauf. Sobald die Proteiniösung vollständig aufgetragen ist, waschen Sie die Säule dreimal mit je 20 Milliliter PBS, um das Protein eluieren zu lassen, und geben Sie anschließend zwei Milliliter PBS mit 500 Millimolar Ole zur Säule hinzu.Stellen Sie das Ventil auf langsame Geschwindigkeit ein und eluieren Sie tropfenweise, während Sie den farbigen Bandverlauf an der N NI NTA-Säule überwachen. Um das erwähnte farbige Fraktion des Eluats, das ein markiertes rekombinantes Protein enthält, abzutrennen, überführen Sie das EIT in eine SLI-Dialyseskassette und dialysieren das EIT dreimal gegen jeweils zwei Liter 10 Millimolar NAPI unter einer Verdünnung von 1 zu 2000, wobei jede Dialyse zwei Stunden dauert. Danach wird das EIT durch einen sterilen Spritzenvorfilter mit 0,45 Mikrometer Porengröße filtriert, in jeweils fünf Portionen zu je 100 Mikroliter aufgeteilt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren.Die Gesamtmenge an Protein sollte in jeder 100-Mikroliter-Aliquotprobe 0,5 bis ein Mikrogramm pro Milliliter betragen. Um die Invasivität des Proteins zu bewerten, Medium hinzufügen, das fünf bis 10 Mikrogramm pro Milliliter markiertes rekombinantes Disc-One-Protein enthält, zu jedem Wells einer 24-Well-Platte mit auf sterilen Glasdeckgläsern kultivierten SH-SY-5Y-menschlichen Neuroblastomzellen, die konstitutiv das lösliche GFP-Tag am C-Terminus von Disc One exprimieren, und 48 bis 72 Stunden inkubieren.Löschen Sie die extrazelluläre Fluoreszenz, fixieren und montieren Sie die Zellen wie bei den mit Agri-Zone behandelten Zellen. Bestätigen Sie die Invasion des exogen applizierten rekombinanten Proteins mittels Zack Imaging. Wenn das markierte Protein aufgenommen wird, ist es in den Bildern der konfokalen Mikroskopie innerhalb der Umrisse der empfangenden Zellen nachweisbar. Dieses Zack umfasst eine Tiefe von etwa fünf Mikrometern bei 24 Schritten zu je 220 Nanometern.Hier wird das rekombinante Disc-eins-Fragment 598 bis 785, das in Rot dargestellt ist, von Empfängerzellen aufgenommen, die das lösliche, C-terminal mit GFP markierte Disc eins, in Grün dargestellt, exprimieren, um die Invasivität von Disc eins zu bestimmen. Agro-Zonen bestehend aus MRFP-markiertem vollständigem Disc-eins, wurden aus NLF-Zellen gereinigt und wie in diesem Foto gezeigt auf Empfänger-SH-SY-5Y-Zellen aufgetragen. Ein mit A-M-R-F-P markiertes Disc-eins-Akrosom drang in eine humane Neuroblastom-SH-SY-5Y-Zelle ein, die lösliches, mit GFP markiertes C-terminales Disc eins exprimierte.Außerdem war das mit MRFP markierte Disc-eins-Asome in der Lage, lösliches, mit GFP markiertes Disc-eins in unlösliche Aggregate zu rekrutieren, um die Invasivität zu bestimmen. DIA-Licht-markiertes rekombinantes Disc-eins wurde auf SH-SY-5-Y-Neuroblastomzellen angewendet, die lösliches GFP-Disc-eins exprimieren, wie hier gezeigt. Das rekombinante Disc-eins-Protein, dargestellt in Rot, drang in die Empfängerzelle ein; gelbe Punkte zeigen eine Rekrutierung des löslichen, mit GFP markierten C-terminalen Disc-eins in Aggregate an. Das rekombinante Disc-eins, exprimiert und aus E. coli gereinigt, zeigte sich ebenfalls in vivo als zellinvasiv für Neuronen, als das multimerische Protein stereotaktisch in den medialen präfrontalen Kortex einer Ratte injiziert wurde. Zack-Bildgebung bestätigt das Vorhandensein des rekombinanten Disc-eins-Proteins in kortikalen Rattenneuronen, die mit einem Antikörper gegen neuronale Kerne gefärbt wurden.Wir haben Ihnen soeben zwei Methoden zur Erzeugung von Disc-eins-Aggregaten zur Untersuchung der Zellinvasion gezeigt. Mit Hilfe dieser Methoden können wir die zellulären Effekte der Aufnahme von Disc-eins-Aggregaten untersuchen, ohne die möglicherweise störenden Variablen der rekombinanten Genexpression durch Transfektion mit fremder DNA. Diese Techniken lassen sich anwenden, um die biologischen Effekte der Disc-eins-Proteinpathologie in vitro in Zellen sowie in vivo durch intrazerebrale Inokulation oder andere Applikationsweisen in Tiermodellen zu erforschen.Wir sind zuversichtlich, dass sich diese Methoden letztendlich mit geringen Anpassungen des für jedes spezifische Protein übernommenen Protokolls auch auf andere Proteinaggregate übertragen lassen. Achten Sie darauf, ausreichend Zeit für die sorgfältige Analyse der konfokalen Mikroskopiebilder einzuplanen, wenn Sie dieses Verfahren durchführen.

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Dictyostelium Discoideum ist ein beliebter Modellorganismus, komplexe zelluläre Prozesse wie Zelle Migration, Endozytose und Entwicklung zu studieren. Das Dienstprogramm des Organismus ist abhängig von der Machbarkeit der Genmanipulation. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden, um Dictyostelium Discoideum Zellen zu transfizieren, die bestehende Grenzen der Kultivierung Zellen in flüssigen Medien zu überwinden.

Gentechnische Veränderung von Dictyostelium Discoideum Zellen basierend auf Auswahl und das Wachstum von Bakterien

Dieser Artikel stellt ein kleines Plasmamembranisolationsprotokoll zur Charakterisierung des Candida albicans ABC (ATP-bindende Kassette) Proteins Cdr1 vor, das in Saccharomyces cerevisiae überexprimiert wird. Ein proteasespaltender C-terminaler mGFPHis-Doppel-Tag mit einem 16-Rückstands-Linker zwischen Cdr1 und dem Tag wurde entwickelt, um die Reinigung und das Reinigungsmittel-Screening von Cdr1 zu erleichtern.

Plasmamembranpräparation im kleinen Maßstab zur Analyse von Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Wir beschreiben einen Ansatz zum Nachweis und zur Erfassung invasiver Zellsubpopulationen in Echtzeit. Das experimentelle Design verwendet die Echtzeit-Zellanalyse, indem Änderungen in der elektrischen Impedanz von Zellen überwacht werden. Invasive Krebs-, Immun-, Endothel- oder Stromazellen in komplexen Geweben können eingefangen und die Auswirkungen von Kokulturen beurteilt werden.

Echtzeit-Detektion und Erfassung invasiver Zellsubpopulationen aus Co-Kulturen

Erfahren Sie die Reinigung und Charakterisierung von DISC1-Protein-Aggresomen für Neurobiologie-Forschung. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung zellinvasiver Proteine in neuronalen Zellkulturen und im lebenden Gehirn.

Generation, Reinigung und Charakterisierung von Cell-invasive DISC1 Protein Spezies

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