Generation, Reinigung und Charakterisierung von Cell-invasive DISC1 Protein Spezies

Das übergeordnete Ziel der folgenden Verfahren ist die Erzeugung gereinigter Discs. Ein Aggregat ist in der Lage, in Empfängerzellen einzudringen. Mit der ersten Methode werden zwei verschiedene Methoden zur Erreichung dieses Ziels demonstriert.

Das Asom-bildende fluoreszierende Protein-Disc-One-Fusionsprotein wird in NLF-Spenderzellen des humanen Neuroblastoms überexprimiert. Die Zellen werden dann mit PBS gewaschen und ohne den Einsatz von Reinigungsmitteln gelegt. Die DNA wird verdaut und die Agrozonen werden mit Hilfe eines Saccharosegradientensystems gereinigt.

Agrios, die nach dieser Methode gereinigt werden, haben eine geringe Zellinvasionseffizienz. Der alternative Ansatz besteht darin, die Aminosäuren 5, 98 bis 7, 85 des rekombinanten Disc-1-Proteins in E-coli zu überexprimieren. Das Proteinfragment wird dann mit DITE 5 94 markiert, dialysiert und mit einer NI NTA-Matrix aufgereinigt, wobei alle verbleibenden ungebundenen Farbstoff-Multimer-Scheiben entfernt werden.

Ein Fragment, das mit dieser Methode erzeugt wird, hat eine hohe Zellinvasionseffizienz, um die Invasion von Wirtszellen zu beurteilen. Entweder die gereinigte fluoreszierende Proteinscheibe, eine Risomenscheibe oder die markierte rekombinante Scheibe. Ein Fragment wird mit den Empfängerzellen von Interesse inkubiert.

Trianblau wird dann hinzugefügt, um die extrazelluläre Fluoreszenz zu löschen, und die Invasion wird durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht. Bisher ist die Proteinaggregation kein bekanntes Merkmal der chronischen psychischen Erkrankungen wie der Schizophrenie. Während das bei Schizophrenie gestörte Protein ein Zellkandidat ist, ist die Invasivität von Proteinaggregaten ein Kennzeichen für proteinbestätigende Krankheiten.

Hier zeigen wir mit zwei Methoden, dass Disc One Proteinaggregate zellinvasiv sind und dass Disc One bedingte Störungen oder Disc One Neuropathien proteinbestätigende Störungen sind. Bei den beiden Methoden handelt es sich zum einen um die Reinigung einer Bandscheibe in voller Länge, einer ASOS aus Neuroblastom-Zelllinien und zum anderen um die Expression einer C-terminalen multimeren Bandscheibe. Ein Fragment in E-coli sowie die Reinigung und Markierung mit dem Fluoreszenzfarbstoff.

Während die erste Methode nur zu einer geringen effizienten Zellinvasion von oh 0,3% der Zellen führt, die die gereinigten Mikrosomen aufnehmen, infiziert das rekombinante Proteinfragment bis zu 20% der exponierten Zellen. Die hier beschriebenen Methoden sollten auf andere Proteine übertragbar sein, bei denen die Akrosombildung oder der multimere Assemblierung überzeugend nachgewiesen wurde. In jeder der 10 10 Zentimeter großen Schalen.

Säen Sie 1,5 mal 10 zu den sechs menschlichen Neuroblastom- und LF-Zellen in supplementiertem RPMI 1640 Medium und wachsen Sie über Nacht. Am nächsten Tag sollten die Zellen zu 70 bis 80 % konfluent sein und fünf Schalen für die Transfektion mit PC-DNA 3.1, MRFP und EGFP markiert sein, die menschliche Bandscheibe eins und fünf für die Transfektion mit EGFP-Plasmid allein. Kombinieren Sie für jede 10-Zentimeter-Schale 15 Mikrogramm Plasmid-DNA, 30 Mikroliter getroffene Auswirkungen und 750 Mikroliter.

Opti MEM in einem Mikrozentrifugenröhrchen und inkubiert durch Auf- und Abpipettieren 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Um die Zellen zu transfizieren, fügen Sie dann die DNA-Transfektionsreagenzlösung hinzu, inkubieren Sie die Zellen tropfenweise bei 37 Grad Celsius mit 5% CO 2 48 Stunden nach der Transfektion, überwachen Sie die Expression der MRFP-Volllänge der ersten Scheibe und bestätigen Sie die Bildung von Agrozonen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Einige Zellen beherbergen massive fluoreszierende Proteineinschlüsse, wie hier gezeigt.

Dieses Protokoll kombiniert eine Methode zur Reinigung von Lewy-Körpern aus Hirngewebe und das Protokoll zur Isolierung größerer Aggregate oder Agrozonen, da bereits bestehende Methoden auf der Verwendung von Detergenzien basieren, ist die Isolierung von detergenzienfreiem Protein für die Anwendung in Zellinvasivitätsassays von entscheidender Bedeutung. Als nächstes aspirieren Sie das Medium mit PBS und fügen Sie 400 Mikroliter PBS hinzu, das einen Proteasehemmer-Cocktail enthält. Kratzen Sie dann die Zellen ab und geben Sie einen Milliliter Zellsuspension und 10 Keramikkügelchen in ein zwei Milliliter Lyseröhrchen.

Lysiert die Zellen mit drei 62. Impulsen auf einem Pre-Cell Lyse 24 Homogenisator. Die mechanische Kraft des Prozesses kann die Temperatur in der Probe auf über 37 Grad Celsius erhöhen. Es sollte also darauf geachtet werden, die Probe auf Eis zu kühlen. Nach dem Lysevorgang nach dem Abkühlen der Zellen auf Eis 10 Millimolare Magnesiumchlorid 40 Einheiten pro Milliliter DNAA hinzufügen und 60 Minuten bei 37 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren.

Bereiten Sie jeweils 10 Milliliter mit 80 % 50 % und 20 % Saccharose pro Volumen in PBS vor. Bereiten Sie dann in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen den Saccharosegradienten vor, beginnend mit zwei Millilitern 80 % Saccharose, gefolgt von zwei Millilitern 50 % und zwei Millilitern 20 % Saccharose. Gießen Sie den Farbverlauf langsam und achten Sie darauf, bereits gegossene Schichten nicht zu stören.

Als nächstes schichten Sie das verdaute Lysat auf den Gradienten und zentrifugieren Sie 15 Minuten lang bei 1000 mal G bei vier Grad Celsius. Nach dem Abbrechen die Grenzfläche zwischen der 50- bis 80%igen Saccharoseschicht vorsichtig mit einer Pipette auffangen und mit fünf Volumina einer 15-Milliliter-Zentrifuge aus dem konischen Röhrchen 15 Minuten lang bei 1000-fachem G bei vier Grad Celsius mischen. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und bewahren Sie die Agri-Zone mit Pellets auf.

Wiederholen Sie das Waschen zwei weitere Male in dieser Schnittstelle. Agri-Zonen sind fluoreszierend und können nach der letzten Wäsche unter UV-Licht sichtbar gemacht werden, den Überstand entsorgen und das Pellet in 250 bis 500 Mikrolitern PBS resuspendieren. Dieses Pellet enthält die gereinigten Agrarzonen.

Geben Sie 10 Mikroliter MRFP-Scheibe und eine Asome Suspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte, die SHSY fünf Y humane Neuroblastomzellen enthält. Konstitutiv exprimierende lösliche GFP-Scheibe mit einem C-Terminus auf sterilen Glasdeckgläsern und inkubiert für 48 bis 72 Stunden nach der Inkubation. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und löschen Sie die extrazelluläre Fluoreszenz fünf Minuten lang mit 0,04 % Trianblau.

Dann mit PBS waschen, um das Trianblau zu entfernen. Stellen Sie dann die Schale auf Eis und fügen Sie 10 Minuten lang 4% PFA und PBS hinzu, um die Zellen zu fixieren. Anschließend einmal mit sterilem Wasser abwaschen und die Deckgläser mit verlängertem Gold mit DPI-Eindeckmedium auf Objektträger aufkleben.

Bestätigen Sie die Aufnahme in die Invasion von exogen. Angewandte Aggrozonen durch Kolokalisation mit rekrutierten Proteinen, die von Empfängerzellen in Zack-Bildern exprimiert werden. Dieser Zack ist etwa sechs Mikrometer tief.

24 Bilder, die in Schritten von 200 Nanometern aufgenommen wurden. Die Fluoreszenz der MRFP-Scheibe in einer Agri-Zone, die in rot dargestellt ist, rekrutiert die zytosolische GFPC-terminale Scheibe. Ein Fragment, das in grüner Kolokalisation dargestellt ist, ist gelb dargestellt und zeigt an, dass die Agri-Zonen in das Empfänger-Zytosol eingedrungen sind und ehemals lösliches Disc-1-Protein rekrutiert haben.

In diesem Teil des Protokolls wird eine menschliche Scheibe mit DITE 5 94 beschriftet. Dieser D ermöglicht die direkte Überwachung des rekombinanten Proteins, ohne dass eine zusätzliche Immunfärbung erforderlich ist. Beginnen Sie mit der Befreiung des wie im Begleitdokument beschrieben hergestellten Proteins von strahlendem Mercaptoethanol, indem Sie es dreimal in zwei Litern PBS in einer Verdünnung von eins bis 2000 dialysieren.

Als nächstes wird eine Milligramm-Scheibe mit DITE 5 94 IDE markiert, ein Milligramm pro Milliliter Protein in PBS aufgelöst und fünf Millimolare TCEP hinzugefügt, um freie TH-Gruppen wiederherzustellen, 20 Mikroliter des gelösten DMF-Farbstoffs zur Reaktion hinzugefügt und zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Verwendung einer SLI-Dialysekassette mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 10 inkubiert. 000. Daltons dialysieren das Protein dreimal in PBS in einem Verhältnis von eins zu 2000 für jeweils zwei Stunden. Als nächstes wird die Reinheit des markierten Proteins weiter erhöht.

Es wird eine Hiss-Tag-basierte Affinitätsreinigung auf einer NTA-Säule von NI durchgeführt. Waschen Sie einen Milliliter NI NTA-Matrix mit 10 Millilitern. PBS trägt dann das markierte Dialyzeprotein auf die Säule auf und lässt es über die Säule laufen.

Langsam verliert die Lösung einen Teil ihrer blauen Farbe, da das Protein an die NTA-Matrix bindet, unmarkierter freier Farbstoff verbleibt im Durchfluss. Sobald die Proteinlösung eingegeben ist. Die Säule, waschen Sie die Säule dreimal mit 20 Millilitern PBS, um das Protein zu eluieren, fügen Sie der Säule zwei Milliliter PBS mit 500 Millimolar Ole hinzu.

Stellen Sie das Ventil auf langsame Geschwindigkeit ein und eluieren Sie abfallweise, während Sie das farbige Band in der N NI NTA-Spalte überwachen. Um darauf hinzuweisen, dass diese farbige Fraktion des Eluats ein markiertes rekombinantes Protein enthält, das EIT auf eine SLI-Dialysekassette überträgt und das EIT dreimal zu 10 millimolaren NAPI in einer Verdünnung von eins zu 2000 für jeweils zwei Stunden in zwei Litern nach der Dialyse dialysiert. Schieben Sie das EIT durch einen sterilen 0,45-Mikrometer-Spritzenfilter, aliquotieren Sie es in fünfmal 100 Mikroliter Proben und frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein.

Die Gesamtmenge an Protein sollte 0,5 bis 1 Mikrogramm pro Milliliter in jedem 100 Mikroliter Aliquot betragen. Um die Invasivität des Proteins zu beurteilen, geben Sie ein Medium mit fünf bis 10 Mikrogramm pro Milliliter markierter rekombinanter Scheibe, ein Protein, in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte, die Empfänger-SH SY, fünf Y-Zellen des menschlichen Neuroblastoms enthält, hinzu. Die lösliche GFP-Tag-Disc exprimiert einen C-Terminus auf sterilen Glas-Deckgläsern und inkubiert 48 bis 72 Stunden lang.

Quench, extrazelluläre Fluoreszenz, Fixierung und Montage der Zellen, wie dies bei den mit der Agri-Zone behandelten Zellen der Fall ist, bestätigen die Invasion des exogen applizierten rekombinanten Proteins durch Zack Imaging. Wenn das markierte Protein aufgenommen wird, wird es innerhalb des Perimeters der Empfängerzellen in Bildern nachgewiesen, die durch konfokale Mikroskopie erzeugt werden. Dieser Zack umfasst eine Tiefe von etwa fünf Mikrometern in 24 Schritten von 220 Nanometern.

Hier wird die rekombinante Scheibe, ein Fragment 5, 98 bis 7, 85, dargestellt in rot, von Empfängerzellen aufgenommen, die die lösliche C-terminale GFP-markierte Scheibe exprimieren, die eine, die in grün dargestellt ist, um die Invasivität der Bandscheibe zu bestimmen. Ein Proteinaggregat Agro-Zonen, bestehend aus MRFP-markierten Scheiben in voller Länge, wurden von NLF-Zellen gereinigt und auf Empfänger-SH SY, fünf Y-Zellen, aufgebracht, wie in diesem Foto beschrieben, wie hier gezeigt. A-M-R-F-P-markierte Bandscheibe, eine Akrosom drang in ein humanes Neuroblastom ein, SH SY, fünf Y-Zellen, die lösliche GFP-markierte C-terminale Bandscheibe eins exprimierten.

Darüber hinaus war die MRFP-markierte Scheibe eins in der Lage, lösliche GFP-markierte Scheibe eins in unlösliche Aggregate zu rekrutieren, um die Invasivität von DIA-Licht-markierten rekombinanten Scheibe eins zu bestimmen, die auf SH SY fünf Y-Neuroblastomzellen angewendet wurde, die lösliche GFP-Scheibe eins exprimieren, wie hier gezeigt. Rekombinante Disc One Protein Malter, die in rot dargestellt sind, drangen in die Empfängerzelle ein, gelbe Punkte deuten auf eine Rekrutierung von löslichem GFP markierter C-terminaler Disc eins in Aggregate hin, die als rekombinante Disc markiert waren, die von E. coli exprimiert und gereinigt wurden, war auch zellinvasiv für Neuronen in vivo, wenn das multimere Protein stereotaktisch in den medialen präfrontalen Kortex einer Ratte injiziert wurde. Die Zack-Bildgebung bestätigt das Vorhandensein eines rekombinanten Disc-1-Proteins in einem kortikalen Neuron der Ratte, das mit einem Antikörper gegen neuronale Kerne gefärbt wurde.

Wir haben Ihnen gerade zwei Methoden zur Erzeugung von Disc-One-Aggregaten zur Untersuchung der Zellinvasion gezeigt. Mit jeder dieser Methoden können wir die zellulären Effekte der Aufnahme von Disc-One-Aggregaten untersuchen, ohne die potenziell verwirrenden Variablen der rekombinanten Genexpression durch Transfektion fremder DNA. Diese Techniken können angewendet werden, um die biologischen Auswirkungen der Disk-1-Proteinpathologie in vitro in Zellen und in vivo durch intrazerebrale Inokulation oder andere Verabreichung in Tiermodellen zu untersuchen.

Wir sind zuversichtlich, dass diese Techniken auch auf andere Proteinaggregate übertragen werden können, schließlich mit leichten Modifikationen des Protokolls, das für jedes einzelne Protein übernommen wird. Achten Sie bei diesem Verfahren darauf, dass Sie sich Zeit für eine sorgfältige Analyse der konfokalen Mikroskopiebilder nehmen.