Модифицированного метода EPA 1623, в котором используются Тангенциальный поток полые волокна ультрафильтрации и тепловой диссоциации шаги для обнаружения водной основе Cryptosporidium И Giardia SPP.

Общая цель этой процедуры заключается в обнаружении и визуализации видов водных организмов, криптоспоридий и лямблий. Это достигается путем предварительного концентрирования пробы воды с использованием тангенциального потока, полого волокна, ультрафильтрации. Второй шаг заключается в элюировании организмов и улавливании мусора из фильтра после этапа центрифугирования.

Иммуномагнитная сепарация позволяет селективно отделять паразитов от концентрированного мусора. Магнитные шарики отделяются от паразитов путем тепловой диссоциации и удаляются с помощью магнита. Затем кисты и О-цисты помещаются на предметное стекло, а образец окрашивается для визуализации с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии.

Основное преимущество фильтрации по методу hofi по сравнению с существующими методами заключается в том, что ультрафильтр значительно дешевле и улавливает множество микроорганизмов в дополнение к криптоспоридиям и лямблиям, таким как вирусы и бактерии. Как правило, люди, не знакомые с иммуносепарацией, сталкиваются с проблемой количества и типа мусора, связанного с различными образцами из очень климатических условий. Начните со сборки ультрафильтрационного аппарата внутри шкафа биобезопасности.

После сборки аппарат функционирует следующим образом: проба воды поступает в систему, проходя через черный Т-образный разъем и перемещается через головку насоса по манометру, а в фильтр с полым волокном ультра отфильтрованная вода выходит из боковой части фильтра в контейнер для отходов. Задержанная вода, содержащая микроорганизмы, нагнетается в бутылку с лентой и рециркулирует по системе до тех пор, пока объем воды не уменьшится. Чтобы начать процедуру, снимите вентиляционную крышку и откройте все зажимы, кроме зажима два, который следует закрыть, чтобы позволить бутылке с водой наполниться, установите направление насоса таким образом, чтобы проба воды стекала в фильтр.

Затем отрегулируйте скорость насоса на 25% и включите насос, когда флакон с ренатом будет полностью открыт на две трети. Зажмите зажим два и быстро плотно закройте бутылку с помощью вентиляционной крышки. Проверьте все трубопроводы и фитинги, чтобы убедиться в отсутствии утечек.

Затем медленно увеличьте скорость насоса примерно до 1,5 литров в минуту с помощью градуированного цилиндра и таймера или расходомера, убедитесь, что скорость фильтрата воды, выходящей из дренажной линии, действительно составляет 1,5 литра в минуту. Следите за процессом фильтрации, следя за тем, чтобы бутылка reten никогда не опустошалась, хотя объем может немного увеличиться или уменьшиться. Если объем падает ниже одной трети, снимите вентиляционную крышку и закройте зажим два.

Опять же, дайте объему в бутылке увеличиться до двух третей. Затем плотно установите на место вентиляционную крышку и снова откройте второй зажим. Как только контейнер для образца опустеет, немедленно закройте зажим, уменьшите скорость насоса до 20%Снимите вентиляционную крышку с бутылки и закройте рампу, соединяющую трубку для сточных вод фильтрующей колонны с резервуаром для отходов.

Затяните или ослабьте рампу зажима, чтобы отрегулировать объем в ретентной бутылке примерно до 200 миллилитров. Затем затяните скомбу рампы, чтобы элюциан элюировал образец. Сначала добавьте 500 миллилитров раствора элуциана в контейнер для образца, промыв в процессе внутреннюю часть контейнера.

Затем поместите пипетку объемом 10 миллилитров, подключенную к линии забора пробы, в емкость с элюцианским раствором. Откройте зажим один и закройте зажим два на мгновение, чтобы получить раствор элуциана. После того, как весь раствор будет загружен, закройте зажим номер один, откройте зажим два и дайте раствору циркулировать в течение пяти минут со скоростью насоса 20%, затяните или ослабьте зажим рампы, чтобы отрегулировать объем образца в флаконе с ренатом примерно до 100 миллилитров.

Затем полностью затяните рампу и дайте образцу рециркулировать в течение одной минуты. В этот момент измените направление насоса на 20 секунд. Это приведет к накоплению около 225 миллилитров образца в бутылке Тейт.

Затем выключите насос. Снимите трубку с головки насоса и трубки, выходящей из фильтра, и удерживайте трубку над бутылкой тат, чтобы вдавить оставшийся образец в бутылку. Затем отсоедините все трубки от бутылки и замените вентиляционный колпачок на невентиляционный колпачок.

Переложите концентрированный образец в коническую пробирку центрифуги объемом 250 миллилитров. Дважды промыть флакон с ренатом 10 миллилитрами воды реагента и перенести жидкость для промывки в центрифужную пробирку. Центрифугируйте образец при температуре не менее 1500 раз G в течение 15 минут.

Не используйте перерыв для остановки центрифугирования. После центрифугирования осторожно отсасывайте надосадочную жидкость до пяти миллилитров над гранулой. Следует проявлять особую осторожность, чтобы оставаться на верхнем уровне жидкости и избегать аспирации О-цисты и кист, которые находятся внутри гранулы.

Сделайте вихревую трубку для тщательной ресуспензии гранулы. Затем перенесите образец в плоскую пробирку L 10, содержащую по одному миллилитру каждого из 10 X SL буфера А и буфера В. Промойте пробирку центрифуги дважды 2,5 миллилитрами реагентной воды и добавьте раствор для промывки в пробирку D 10. Доведя итоговый объем до 12 миллилитров, добавьте в пробирку по 100 микролитров магнитных конъюгированных, антикриптоспоридиевых и антилямблийных антител.

Затем вращайте трубку со скоростью 18 об/мин в течение одного часа при комнатной температуре на вращающемся миксере после вращения. Приложите плоскую сторону трубки к магниту MP six и осторожно покачивайте трубку в течение двух минут, не снимая трубку с магнита. Держите плоской стороной вверх и сцедите надосадочную жидкость.

Будьте осторожны, чтобы не потревожить бусины, удерживаемые на плоской стороне трубки рядом с магнитом. Снимите пробирку с образцом с магнита и трижды промойте плоскую сторону пробирки 500 микролитрами буфера А, избегая попадания мусора на круглую сторону пробирки. Перенесите каждый объем полоскания в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, помещенную в магнит MPCS.

С магнитом в вертикальном положении. Закройте трубку и осторожно покачивайте ее в течение одной минуты. Затем, установив магнит, отсасывайте надосадочную жидкость с помощью пастбищной пипетки, расположенной в нижней части пробирки, аккуратно добавьте в пробирку один миллилитр PBS.

Будьте осторожны, чтобы не потревожить гранулу шарика. Приложите к стенке трубки, прилегающей к магниту. Снимите магнитную полосу и осторожно покачивайте трубку, пока бусины не будут подвешены.

Снова вставьте магнитную полосу в вертикальное положение. Осторожно покачивайте трубку в течение минуты и аспирируйте надосадочную жидкость, удаляя как можно больше мусора, не нарушая бусины. После этого промывку снимите магнит и добавьте 50 микролитров воды реагента прямо на палитру валика.

Поверните трубку на полную скорость в течение 50 секунд, чтобы снова подвесить бусины. Затем инкубируйте образец при температуре 80 градусов Цельсия в течение 10 минут, позволяя цистам лямблий и цистам криптоспоридий диссоциировать от гранул После инкубации поместите образец на вихрь в течение 30 секунд. Затем поместите магнитную полосу в ПДКС, используя наклонное положение, чтобы отделить бусины от цист и О-цист во взвешенном состоянии.

Перенесите надосадочную жидкость, содержащую кисты и О-кисты, на предметное стекло. Повторите шаги добавления воды в вихрь и тепловую диссоциацию во второй раз, добавив надосадочную жидкость на тот же предметный стек. Что ж, затем поместите горку на грелку для горок при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы высушить суспензию.

Начните с нанесения 50 микролитров метанола на предметное стекло, чтобы зафиксировать образец и дать ему высохнуть при комнатной температуре. Далее добавьте 50 микролитров раствора DPI и выдержите предметное стекло в течение двух минут при комнатной температуре. Чтобы испачкать ядра, используйте салфетку Кима, чтобы вытащить салфетку из колодца, стараясь не прикасаться к колодцу.

Затем добавьте 50 микролитров легкого окрашивания, чтобы окрашивать клеточную стенку цист лямблий и цист криптоспоридий. Инкубируйте образец при температуре 35 градусов Цельсия в течение 30 минут. Удалите пятно салфеткой Ким, как и раньше.

Затем медленно добавьте 300 микролитров холодного буфера для фиксации пятен, осторожно поместив наконечник пипетки за пределы лунки и позволив жидкости переместиться в лунку. Выдержите предметное стекло в течение двух минут при комнатной температуре. Затем снимите буфер с помощью салфетки kim и нанесите 10 микролитров монтажной среды, аккуратно поместите защитное стекло на образец, удаляя любые пузырьки, и запечатайте защитное стекло прозрачным лаком для ногтей Используя флуоресцентный микроскоп, рассмотрите предметное стекло с увеличением от 200 x до 1000x и fse, затем фильтр DPI при увеличении 200x Цисты и O цисты выглядят как блестящие яблочно-зеленые флуоресцентные овоидные структуры с яркими выделенные края.

Цисты Cryptosporidium O круглые и варьируются в размерах от четырех до шести микрон. Цисты лямблий более крупные, шириной от пяти до 15 микрон и длиной от восьми до 18 микрон, могут быть круглыми или яйцевидными при увеличении в 1000 раз. А с помощью фильтра DPI можно лучше оценить внутреннюю структуру кист и ЦВС.

Как правило, до четырех спорозоитов, которые выглядят как небесно-голубые ядра окрашивания DPI, видны в Cryptosporidium O cys и Giardia Cys.DIC. Микроскопия также может помочь в правильной идентификации паразитов, поскольку это позволяет оценить дополнительные морфологические характеристики. Цисты лямблий часто демонстрируют одну или несколько различимых внутренних структур, таких как видимые ядра, серповидные органеллы, называемые срединными тельцами, и внутренние жгутиковые структуры, называемые аксонами.

Важно отметить, что процедура ультрафильтрации holo fiber обладает способностью захватывать несколько микроорганизмов. Кроме того, к концентрированным образцам можно применять другие методы обнаружения, такие как QPCR и генотипирование, что делает этот метод более гибким и более адаптируемым к вашим приложениям. Спасибо за просмотр и дайте нам знать, если у вас есть какие-либо вопросы.