Модифицированный метод QuEChERS-ВЭЖХ для обнаружения полициклических ароматических углеводородов в эмбрионах рыбок данио, подвергшихся воздействию мелкодисперсных частиц

Данное исследование направлено на разработку модифицированного метода QuEChERS-HPLC для количественного определения ПАУ в эмбрионах рыбок данио-рерио, подвергшихся воздействию ЭОМ, устраняя существующий пробел, вызванный техническими проблемами в измерении внутренних уровней ПАУ из-за размера массы эмбрионов и сложности их биологической матрицы. Для получения достоверных результатов требуется 200 эмбрионов в группе, что представляет собой практическую задачу. Сочетание ВЭЖХ с флуоресцентным детектором может еще больше повысить чувствительность метода. По сравнению с другими методами, этот модифицированный метод QuEChERS-HPLC значительно сокращает время подвешивания образца и обеспечивает быстрый и эффективный подход к анализу уровней 16 ПАУ в эмбрионах данио-рерио, подвергшихся воздействию ЭОМ.

[Рассказчик] Для начала подготовьте образец QuEChERS, вынув чашки с эмбрионами из инкубатора через 72 часа после оплодотворения. Трижды промойте зародыши чистой водой. Перенесите эмбрионы в 1,5-миллилитровые пробирки и удалите лишнюю воду. Поместите пробирки в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов Цельсия на 30 минут для лиофилизации эмбрионов. После лиофилизации измельчите зародыши с помощью стеклянной палочки. Добавьте 25 микролитров 16 полициклических ароматических углеводородов, или ПАУ, смешайте стандартный раствор в контрольной группе ДМСО для проверки восстановления спайков. Затем добавьте один миллилитр н-гексана и вортекс на 30 секунд. Ультразвуком воспользуйтесь смесью при температуре 35 градусов Цельсия в течение 30 минут. Теперь центрифугируйте образец при весе 7000 г в течение пяти минут. Переложите надосадочную жидкость в свежую трубку. Выпарить собранные надосадочные жидкости до сухости под потоком азота на водяной бане при температуре 35 градусов Цельсия. Добавьте один миллилитр ацетонитрила и вортекс на 30 секунд. Добавьте в образец 10 мг первичного вторичного амина, 45 мг сульфата магния и 15 мг упаковки C18, затем перемешайте в течение 30 секунд. Центрифугируйте при 7 000 г в течение пяти минут и перелейте надосадочную жидкость в свежую пробирку. Выпарить надосадочную жидкость до 0,5 миллилитра под азотом и отфильтровать образец через микропористую мембрану толщиной 0,22 микрометра. Приготовьте серию рабочих растворов в диапазоне от одного до 500 нанограмм на миллилитр для стандарта смеси 16 ПАУ с использованием ацетонитрила. Введите 20 микролитров растворов образца в жидкостный хроматограф с помощью ацетонитрила или водоподвижной фазы и следуйте процедуре элюирования, показанной на экране. Постройте стандартную кривую с массовыми концентрациями стандартных рабочих растворов по оси x и соответствующими пиковыми площадями по оси y, охватывающую диапазон от пяти нанограмм на миллилитр до 500 нанограмм на миллилитр. Введите очищенный образец в жидкостный хроматограф, оснащенный флуоресцентным детектором, или FLD, и детектором диодной матрицы, или DAD. Определите наличие ПАУ, сравнив время хранения. Измерьте площади пиков, чтобы определить концентрацию. Наконец, рассчитайте внутренние концентрации 16 ПАУ на основе измеренных массовых концентраций. Концентрации полициклических ароматических углеводородов, или ПАУ, в эмбрионах данио-рерио через 72 часа после оплодотворения приведены в этой таблице. Шесть ПАУ были успешно обнаружены в экстрагируемых органических веществах, или ЭОМ, подвергшихся воздействию эмбрионов данио-рерио. Напротив, в контрольных образцах DSMO были идентифицированы только две ПАУ, на уровнях значительно ниже, чем в образцах EOM.