Дуплексной связи с цифровой ПЦР-анализ для одновременного Количественное определение Enterococcus SPP. И человеческая Фекальные-ассоциированный HF183 Marker в водах

Общая цель этого дуплексного цифрового ПЦР-анализа заключается в одновременной количественной оценке общего и связанного с человеком фекального загрязнения в воде. Этот анализ может помочь ответить на ключевые вопросы в области оценки качества рекреационной воды, такие как сколько общего показателя кала, т.е. энтерококка и, что более важно, маркера HF183, связанного с фекалиями человека, находится в воде.

Основное преимущество этого анализа заключается в том, что он количественно определяет две мишени в одной реакции и, по сравнению с количественной ПЦР, устраняет необходимость в прохождении стандартных кривых и, следовательно, смещение и вариабельность ассоциации. Демонстрировать процедуру будет Мередит Райт, наш старший научный сотрудник. Чтобы начать эту процедуру, сначала приготовьте концентрацию 100 микромолей на литр для всех праймеров в воде молекулярного качества и зондов в буфере TEPH 8, как описано в тексте протокола.

Затем приготовьте мастер-смесь, смешав соответствующие количества смеси Digital PCR, прямых и обратных праймеров, флуоресцентного зонда и воды, не содержащей нуклеазы. Перемешайте пипетку вверх и вниз не менее 10 раз, стараясь при этом не допустить попадания пузырьков воздуха в раствор. Поскольку dPCR Master Mix более вязкий, чем обычный qPCR Master Mix, для создания однородного раствора необходимо использовать метод смешивания пипетированием.

Это позволяет проводить точное количественное определение dPCR на последующих этапах. Чтобы изготовить Assay Mix for Droplet Generation для запуска проб в двух экземплярах, пипетку 36 мкл Master Mix в обычный ПЦР-планшет. К каждой из 36 микролитровых мастер-смесей добавьте 12 микролитров матрицы ДНК, оставив соответствующие лунки репликации пустыми на пластине.

Включите положительный контроль, чтобы убедиться, что анализ проводится правильно. Включите элементы управления без шаблонов или NTC, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения внутри планшета и установить флуоресцентный базовый уровень позже для анализа данных. Перед настройкой капельного генератора смешайте смеси для анализа с помощью многоканальной пипетки для дозирования смесей вверх и вниз примерно 15 раз.

Следите за тем, чтобы наконечник пипетки оставался в жидкости, чтобы избежать образования пузырьков доступа к смеси. Затем вставьте картридж номер один, содержащий восемь лунок, в белый держатель картриджа и защелкните держатель картриджа. Картридж один теперь прочно стоит на месте и не может быть выбит из держателя при образовании капель.

С помощью многоканальной пипетки аккуратно перенесите 20 микролитров пробирной смеси в среднее положение картриджа с маркированным образцом, не вводя пузырьков воздуха. Пипетку в 70 микролитрах масла Droplet Generation с левой стороны картриджа отметьте маслом. Накройте картридж прокладкой, убедившись, что прокладка плоская и равномерно удерживается четырьмя тиками по направлению к краю картриджа.

Нажмите кнопку с зеленым светом на генераторе капель, чтобы открыть дверцу и поместить картридж. Нажмите кнопку еще раз, чтобы закрыть генератор. Как только дверь закроется, зеленая кнопка затемнится, и дверь нельзя будет открыть снова.

Генерация капель начнется немедленно и продлится примерно одну минуту. Пока идет генерация капель, поместите второй картридж во второй белый держатель картриджа и подготовьте его так же, как и для первого картриджа. Когда генерация капель будет завершена, тускло освещенная кнопка станет зеленой.

Откройте дверцу генератора капель, снимите белый держатель картриджа с картриджем и отложите его в сторону. Поместите второй картридж в генератор капель. Снимите прокладку с картриджа один и выбросьте.

Не снимайте защелку с белого держателя картриджа, так как это может привести к поломке вновь образовавшихся капель. С помощью многоканальной пипетки, установленной на 40 микролитров, вставьте наконечники в третий столбик картриджа с размеченными каплями под углом 45 градусов и медленно проведите пипеткой вверх все капли. Перенесите их на окончательный планшет для ПЦР, приложив наконечник пипетки к стенке лунки примерно на полпути вниз и медленно удаляя капли.

Таким же образом, когда генерация капель для второго картриджа завершена, удалите прокладку из второго картриджа и перенесите сгенерированные капли на окончательный планшет для ПЦР. Поместите прокалываемую крышку из фольги поверх пластины и поместите ее на герметик для тарелок. Установите запайщик на 180 градусов Цельсия, нажмите на люфт на запайщике и запечатайте на 10 секунд.

Чтобы начать эту процедуру, поместите герметичную конечную ПЦР-планшет в термоамплификатор. Используйте амплификатор, совместимый с конечным планшетом для ПЦР и со скоростью нарастания температуры два градуса Цельсия в секунду. Выполните следующую тепловую программу: десять минут при 95 градусах Цельсия, затем 40 циклов по 30 секунд при 94 градусах Цельсия и 60 секунд при 60 градусах Цельсия, а затем десять минут удержания при 98 градусах Цельсия.

По завершении цикла перенесите планшет в считыватель капель для автоматического измерения флуоресцентных ламп в каждой капле в каждой лунке. Прежде чем приступать к считыванию капель, убедитесь, что капли имеют комнатную температуру. Начните с открытия прилагаемого программного обеспечения, чтобы настроить чтение капель.

В стандартном меню настройки, содержащем схему пустой 96-луночной пластины, дважды щелкните по скважине A1, чтобы открыть меню, содержащее три раздела: Образец, Анализ 1 и Анализ 2. В разделе «Образец» введите идентификатор образца в поле «Имя» и установите флажок справа с пометкой «Применить». Затем щелкните раскрывающееся меню с надписью experiment, выберите RED для обнаружения редких событий и нажмите Enter.

Перейдите к разделу, обозначенному как Проба 1. В разделе «Название» заполните поле «Анализ» и нажмите «Enter». В поле ниже с надписью «Тип» щелкните раскрывающееся меню, выберите «Канал 1 неизвестен» и нажмите «Enter».

Перейдите к разделу, обозначенному как Проба 2. В разделе «Название» заполните поле «Анализ» и нажмите «Enter». В поле ниже с надписью «Тип» нажмите раскрывающееся меню, выберите «Канал 2 неизвестен» и нажмите «Enter».

Вся информация, полученная на предыдущих шагах, теперь присутствует в колодце A1.Name во всех последующих лунках, содержащих капли. Чтобы сократить общее время настройки, нажмите Shift или Control, чтобы выбрать несколько скважин одновременно. Когда цифровое изображение номерного знака будет зеркально отражать физическую форму, нажмите кнопку OK в правом нижнем углу меню.

В новом меню, которое появится в верхней части схемы пластины, в разделе Шаблон выберите Сохранить как и имя и сохраните пластину. В левой части экрана нажмите «Выполнить» и выберите соответствующий набор красителей в всплывающем окне «Параметры запуска». Сбор данных начнется и будет отображаться в программном обеспечении в режиме реального времени.

Когда чтение будет завершено и появится окно с надписью «Запустить завершено», нажмите OK. Проверьте расстояние между положительными и отрицательными каплями. Убедитесь, что флуоресцентность во всех каплях в лунках NTC близка к исходному уровню. Нажмите на кнопку с надписью «События».

Внизу нажмите на поле с именем «Одиночный» и справа от представленной гистограммы нажмите на поле с именем «Всего», чтобы отобразить общее количество принятых капель на лунку. Исключите лунки, содержащие менее 10 000 капель, удерживая клавишу Control и щелкая по лункам, которые нужно исключить. Нажмите на кнопку, обозначенную как 1D Amplitude, чтобы установить порог флуоресценции примерно на одно стандартное отклонение отрицательных капель в лунках NTC для обеих мишеней.

В самой левой части экрана под кнопкой «Автоанализ», показывающей две кнопки порога, выберите значок справа, через который проходит сплошная розовая горизонтальная линия. Нажмите на поле слева от поля «Установить порог» под каждым из амплитудных графиков и введите соответствующие значения порога флуоресценции. Затем автоматически рассчитываются целевые концентрации в копире на микролитр.

Экспортируйте результаты в файл CSV, нажав кнопку «Экспорт» в верхнем левом углу на экране «Амплитуда 1D». В файле CSV умножьте концентрацию экспортируемой мишени на четыре, чтобы преобразовать ее из копии мишени на микролитровую реакцию в копию мишени на микролитровый шаблон ДНК. На этом рисунке сравниваются дуплексный и симплексный форматы цифрового ПЦР-анализа.

На левой и правой панелях отображается количественная оценка энтерококка и HF183 соответственно с соответствующими коэффициентами корреляции между дуплексными и симплексными результатами. Сплошными линиями обозначены линии регрессии, а серой штриховкой обозначены соответствующие стандартные ошибки. Символами обозначены разные типы образцов.

Результаты весьма последовательны и часто неразличимы независимо от того, измеряются ли энтерококк и HF183 одновременно в одной реакции или отдельно в двух реакциях. Цифровой ПЦР-анализ также может переносить ингибитор в концентрациях на один-два порядка выше, чем у его аналогов с количественной ПЦР. На этом рисунке показана количественная оценка маркера HF183 в чистых сточных водах с увеличением концентрации гуминовой кислоты, которая ингибирует ПЦР.

Ожидаемое количественное определение HF183 в отсутствие ингибиторов определяется как 95%-ная достоверность между двумя горизонтальными пунктирными линиями. Цифровая ПЦР, обозначенная треугольниками, продолжает обеспечивать точное количественное определение с концентрацией гуминовой кислоты до 15 нанограммов на микролитр реакции, в то время как количественная ПЦР, обозначенная крестиками, начинает недооцениваться при одном нанограмме на микролитр и полностью ингибируется при пяти нанограммах на микролитр. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить этот энтеральный анализ HF183 Duplex Droplet Digital PCR или другой подобный анализ с использованием различных праймеров и зондов.

С момента разработки этого дуплексного анализа, который был опубликован в журнале Water Research в 2015 году, мы разработали и проверили множество других цифровых ПЦР-анализов, которые нацелены на бактерии общего калового индикатора, маркеры микробного отслеживания и патогены, передающиеся через воду. Эти анализы обеспечивают прямую и непредвзятую количественную оценку их цели и становятся полезной альтернативой количественному анализу ПЦР в области тестирования качества воды.