High-throughput Screening niedermolekularer Modulatoren von Inward Gleichrichter-Kaliumkanäle

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neuartige Verbindungen zu entdecken, die die Aktivität der nach innen gerichteten Gleichrichter-Kaliumkanäle modulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Tetracyclin-induzierbare HK 2 9 3-Zellen plattiert werden, wobei ein interessierender KIR-Kanal in eine 384-Well-Platte exprimiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen mit einem fluoreszierenden Thallium-Reporterfarbstoff namens Grippe in zwei Teilen zu beladen.

Als nächstes wird der nicht eingebaute Farbstoff aus den Zellen gewaschen und durch einen Assay-Puffer ersetzt, der eine Vehikelkontrolle oder Testverbindungen enthält. Der letzte Schritt ist die Zugabe eines Stimuluspuffers zu den Vertiefungen, um den Thalliumfluss zu initiieren. Letztendlich wird ein Fluoreszenzplatten-Reader verwendet, um die Verbindungen zu identifizieren, die die Bewegung von Thallium-Ionen durch den KIR-Kanal verändern. Arm.

Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Techniken wie der manuellen Patch-Clamp-Elektrophysiologie besteht darin, dass sie es dem Untersucher ermöglicht, Hunderte von Experimenten gleichzeitig und Tausende von Experimenten täglich durchzuführen. Diese Methode ermöglicht es dem Forscher, Bibliotheken von Tausenden von kleinen Molekülen zu screenen, um Modulatoren von nach innen gerichteten gleichrichtenden Kaliumkanälen zu entdecken. Einen Tag vor dem Thalliumfluss-Experiment dissoziieren die Zellen und quantifizieren die Dichte der Zellsuspension, wie im begleitenden Manuskript beschrieben. Als nächstes verwenden Sie das BH-Medium mit 10 % dialysierter FBS-Platte 20.000 monoklonale Zellen, die stabil mit einem KIR-Kanal-Gen von Interesse transfiziert wurden, in jeder Vertiefung einer BD Pure Coat Amin beschichteten 384-Well-Platte unter Verwendung einer Thermo-Multi-Drop-Kombi oder einer Mehrkanalpipette am nächsten Tag, inspizieren Sie die Platte unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen adhärent und gleichmäßig über den Boden der Wells verteilt sind.

Verwenden Sie dann einen ELX 4 0 5 Mikroplattenwascher, um das Zellkulturmedium durch den HBSS-Assay zu ersetzen. Puffern Sie bei 20 Mikrolitern pro Vertiefung. Bereiten Sie danach die Grippe in 2:00 Uhr D Ladelösung vor, indem Sie das Röhrchen kurz zentrifugieren, um 50 Mikrogramm Grippe in zwei Pulvern in 100 Mikrolitern wasserfreiem DMSO aufzulösen.

Geben Sie nun 50 Mikroliter einer onic F1 27 DMSO-Lösung mit 20 Gew.-% zum Farbstoff. Mischen Sie sie, indem Sie sie vorsichtig pipettieren. Dann 150 Mikroliter Grippe in 2:00 Uhr morgens onic F1 27 bis 35 Milliliter HBSS-Assay hinzufügen, puffern und vorsichtig mischen.

Geben Sie anschließend 20 Mikroliter Farbstoffladepuffer in jede Vertiefung, die bereits 20 Mikroliter HBSS-Assay enthält. Puffer. Inkubieren Sie die Zellen etwa eine Stunde lang bei Raumtemperatur, während die Zellen mit Farbstoff beladen werden. Bereiten Sie eine Thallium-Stimulusplatte vor, indem Sie 0,5 Gramm Natriumbicarbonat in 50 Millilitern von fünf x Thallium-Stimuluspuffer frisch auflösen.

Geben Sie dann 50 Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte aus Polypropylen, nachdem die Zellen um 2:00 Uhr morgens mit Grippe beladen wurden. Waschen Sie die Platte mit einem ELX 4 0 5 Mikrotiterplatten-Wascher. Fügen Sie als Nächstes 20 Mikroliter oder 40 Mikroliter HBSS-Assay hinzu. Puffern Sie zurück in jede Vertiefung und die Platte ist nun bereit für die Experimente.

Laden Sie die Thallium- und Zellplatten in ein funktionelles Wirkstoff-Screening-System von Hema Matsu oder ein gleichwertiges kinetisches Bildgebungsplatten-Lesegerät mit integrierten Flüssigkeitsabgabefunktionen und verwenden Sie geeignete Filter für fluoresceinbasierte Farbstoffe wie Flu OH 4. Richten Sie danach ein einzelnes Addierprotokoll ein, um 10 Mikroliter von fünf X Thallium-Serien in die entsprechenden Vertiefungen der Zellplatte mit 40 Mikrolitern HBSS-Assay-Puffer zu geben. Nehmen Sie dann die Basisfluoreszenz bei einer Abtastfrequenz von einem Hertz für mindestens 10 Sekunden auf.

Die Well-to-Well-Fluoreszenz sollte gleichmäßig und stabil über die gesamte Platte sein, sobald optimale Bedingungen für die Zellplattierung, das Waschen und die d-Beladung hergestellt sind. In der Zwischenzeit können Sie mit der integrierten 384-Kanal-Pipettierer den Thallium-Stimuluspuffer gleichzeitig in jede Vertiefung geben und die Aufzeichnung mindestens zwei Minuten lang fortsetzen, so dass die Rate und der Peak des Thallium-induzierten Anstiegs der Fluoreszenz für die Offline-Analyse erfasst werden. In der nächsten Versuchsreihe wird die Gleichmäßigkeit und Reproduzierbarkeit des Assays bewertet, indem in jeder zweiten Vertiefung jeder Säule und Reihe einer 384-Well-Platte ein Kontrollinhibitor plattiert und DMSO als Vehikelkontrolle in die anderen Vertiefungen gegeben wird.

Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette. Stellen Sie eine zusammengesetzte DMSO-Platte her, indem Sie einen Inhibitor des Ziel-KIR-Kanals in der zuvor bestimmten Konzentration von 80 Mikrolitern pro Vertiefung und 0,1 % DMSO-Vehikel in eine 384-Well-Polypropylenplatte pipettieren. Dies geschieht durch Zugabe eines bekannten Inhibitors, beginnend in Vertiefung A eins und abwechselnd zu Vertiefung B zwei und so weiter bis Vertiefung B 24.

Wiederholen Sie diesen Vorgang mit DMSO beginnend in der Vertiefung, B eins usw. bis Vertiefung A 24. Laden Sie nun die Zelle, die Compound- und Thallium-Stimulusplatten in den Plattenreader. Richten Sie dann ein Protokoll mit zwei Addiervorgängen ein, um 20 Mikroliter der beiden X-Konzentrations-Verbindungsserien in die entsprechenden Vertiefungen der Zellplatte zu geben, die 20 Mikroliter HBSS-Assay-Puffer enthalten.

Geben Sie die Verbindungen auf die Zellplatte und inkubieren Sie sie bis zu 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zeichnen Sie die Ausgangsgrippe in zwei Fluoreszenzen für mindestens 10 Sekunden auf. Geben Sie dann 10 Mikroliter mit fünf x Thalliumpuffer in jede Vertiefung der Zellplatte.

Wiederholen Sie den Versuch an drei aufeinanderfolgenden Tagen, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu ermitteln. Verwenden Sie den Thalliumfluss in DMSO und medikamentös behandelten Zellen, um einen Wert für Z prime zu berechnen. Ein statistisches Maß für die Variabilität von Bohrloch zu Bohrloch zwischen den beiden Grundgesamtheiten von Bohrlöchern: Berechnen Sie die Z-Primzahl mit dieser Formel basierend auf den Mittelwerten und Standardabweichungen von P und N, wobei P der Wert des ungehemmten Flusses und N der vollständig gehemmte Flusswert ist.

Ein Assay mit ZPrime-Werten von mindestens 0,5 an drei verschiedenen Tagen gilt als geeignet für das Hochdurchsatz-Screening. Diese Abbildungen sind einige Beispiele für die Zellplattierungskarten, die in verschiedenen Arten von Experimenten verwendet werden. Die Positionen von Vertiefungen, die uninduzierte oder Tetracyclin-induzierte Zellen enthalten, sind in verschiedenen Farben dargestellt.

Diese Abbildung zeigt die Quellplattenkarte, die zur Bestimmung der optimalen Thalliumkonzentration für die Assay-Entwicklung und das Wirkstoff-Screening verwendet wird. Der Farbverlauf stellt die dreifache Verdünnungsreihe dar, die von 100 % bis 0,002 % Thallium reicht, und hier ist eine repräsentative Fluoreszenzintensitätskarte mit kühlen bis heißen Farben, die auf niedrige bis hohe Thalliumflusswerte hinweist. Die hier gezeigte Zellplattierungskarte mit einer Anpassung von vier Parametern an den Thallium-CRC wird verwendet, um einen EEC 80-Wert von 15%Thallium zu bestimmen.

Diese Abbildung zeigt die Quellplatte, die zur Bestimmung der DMSO-Toleranz eines Assays verwendet wird. Die Spalten eins und 24 enthalten nur Assay-Puffer, während der Farbverlauf die zweifache Verdünnungsreihe von 10 % bis 0,01 % DMSO anzeigt und hier eine repräsentative Fluoreszenzintensitätskarte mit niedrigen Thalliumflusswerten mit dunklerem Blau angezeigt wird. Die durchschnittlichen Thalliumflusswerte, die aus den Vertiefungen mit den angegebenen DMSO-Konzentrationen aufgezeichnet wurden, sind hier zusammengefasst.

Diese Abbildung zeigt nun die Quellplattenkarte, die zur Erstellung von Konzentrationsreaktionskurven für die bekannten Inhibitoren eines KIR-Kanals verwendet wird. Jede Verbindung ist mit einer anderen Farbe gekennzeichnet und wird typischerweise als dreifache Verdünnungsreihe plattiert. Eine repräsentative Fluoreszenzintensitätskarte ist hier dargestellt, und diese Abbildung zeigt die dosisabhängige Hemmung des Thalliumflusses durch einen Inhibitor nach seiner Entwicklung und Optimierung.

Der Thallium-Flux-Assay kann auch zur Durchführung einer Vielzahl von routinemäßigen pharmakologischen Assays verwendet werden. Der Thalliumfluss-Assay wurde zuvor für die Verwendung mit spannungs- und ligierten Kaliumkanälen, nicht-selektiven Kationenkanälen und sogar Kaliumtransportern angepasst. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Tellium äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Tragen von Handschuhen und die ordnungsgemäße Abfallentsorgung.