Name: High-throughput Screening niedermolekularer Modulatoren von Inward Gleichrichter-Kaliumkanäle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie einen quantitativen Fluoreszenz-Assay zur Messung der Aktivität von Inward Rectifier-Kaliumkanälen (Kir) entwickeln und validieren. Diese Methode ermöglicht das Hochdurchsatz-Screening potenzieller Modulatoren für die Arzneimittelforschung.

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<ol><li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129(2008).</li>
<li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K%2B+channels%3A+recent+advances+and+future+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757(2010).</li>
<li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213(2007).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291(1998).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin%3A+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286(1999).</li>
<li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain%3A+a+Mount+Everest+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764(2010).</li>
<li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thallium-sensitive%2C+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671(2004).</li>
<li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094(2009).</li>
<li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1%2C+the+renal+outer+medullary+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42(2011).</li>
<li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+%28Kir%29+channels+with+preference+for+Kir2.3%2C+Kir3.x%2C+and+Kir7.1%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75(2012).</li>
<li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213(2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Datenverarbeitung: Sobald die Daten gesammelt werden, ein gemeinsamer Schritt in der Analyse beinhaltet Normalisierung jedes Brunnens Fluoreszenz-Antwort, F, auf den Ausgangswert zu Beginn des Experiments, F 0. Dies wird allgemein als der &quot;statische Verhältnis&quot; bezeichnet und symbolisiert &quot;F / F 0&quot;. In Fällen, in denen F 0 von der Indikatorfarbstoff dominiert wird die statische Verhältnis Operation wird im wesentlichen für viele Faktoren wi...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> Tetracyclin-induzierbarer Expressionsvektor </td></tr><tr><td> T-Rex-HEK293-Zellen </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> Tetracyclin-induzierbaren Zelllinie </td></tr><tr><td> Lipofectamine LTX / Plus Reagent </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Transfektionsreagenz </td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S11550 </td><td> Zellkulturmedien </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Zellkulturmedien </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> Zellkulturmedien </td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> Zellkulturmedien </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Zellkulturmedien </td></tr><tr><td> HBSS-zweiwertigen kostenlos </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> Waschen der Zellen </td></tr><tr><td> Trypsin-0,25% </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> Zelldissoziationslösung </td></tr><tr><td> Tetracyclin-HCl </td><td> Sigma </td><td> T9823 </td><td> Induction Reagenz </td></tr><tr><td> Dialysiertes FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S12650 </td><td> Plattierungsmedien </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> Fluoreszenzfarbstoff </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> Dye Belastung </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> Assay-Puffer </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td> Assay-Puffer </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td> Tl + Stimulus-Puffer </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Tl + Stimulus-Puffer </td></tr><tr><td> CaSO 4 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3771 </td><td> Tl + Stimulus-Puffer </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> Tl + Stimulus-Puffer </td></tr><tr><td> Thalliumsulfat </td><td> Aldrich </td><td> 204625 </td><td> Tl + Stimulus-Puffer </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Tl + Stimulus-Puffer </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D4540 </td><td> Lösungsmittel </td></tr><tr><td> Acht-Kanal elektronische Pipette </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> Zelle plating in 384 -Well-Platten </td></tr><tr><td> BD PureCoat Amin-beschichtete 384-Well-Platten </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> Assay Mikrotiterplatten </td></tr><tr><td> Echo qualifiziert 384-Well Polypropylen Microplatte (384PP) </td><td> Labcyte </td><td> P-05.525 </td><td> Compound Quelle Mikrotiterplatten </td></tr><tr><td> 384-well Mikroplatten Polypropylen </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Multidrop Combi Reagenzspender </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 Mikroplatten-Washer </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> Automationszelle Waschen </td></tr><tr><td> Echo Liquid Handler </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte Echo 550 </td><td></td></tr><tr><td> Bravo automatisierten Liquid-Handling-Plattform </td><td> Agilent Technologies </td><td> Standard-Modell </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu FDSS 6000 </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> Kinetic Imaging Plate Reader </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Liste der Materialien und Reagenzien.

high-throughput screening niedermolekularer modulatoren von inward gleichrichter-kaliumkanäle

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Bestimmte Mitglieder der Einwärtsgleichrichter Kalium (Kir) Kanal Familie drug targets für eine Vielzahl von Erkrankungen, einschließlich Bluthochdruck, Vorhofflimmern und Schmerzen 1,2 postuliert. Zum größten Teil jedoch Fortschritte zum Verständnis ihres therapeutischen Potenzials oder sogar grundlegenden physiologischen Funktionen durch den Mangel an guten pharmakologischen Werkzeugen verlangsamt. In der Tat hat die molekulare Pharmakologie des Einwärtsgleichrichter Familie weit hinter der des S4 Superfamilie der spannungsgesteuerten Kaliumkanäle (Kv)-Kanäle, für die eine Reihe von nanomolaren-Affinität und hochselektive Peptidtoxin Modulatoren 3 entdeckt haben zurückgeblieben. Die Bienengift Toxin tertiapin und seine Derivate sind potente Inhibitoren von Kir1.1 und Kir3 Kanäle 4,5, aber Peptide sind nur von begrenztem Nutzen therapeutisch als auch experimentell aufgrund ihrer antigenen Eigenschaften und schlechte Bioverfügbarkeit, metabolische Stabilität und Gewebe Penetranz. Die Entwicklung potenterund selektive niedermolekulare Sonden mit verbesserten pharmakologischen Eigenschaften werden ein Schlüsselfaktor für ein volles Verständnis der Physiologie und therapeutische Potenzial von Kir-Kanälen sein. Das Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) durch die National Institutes of Health (NIH) Common Fund hat Möglichkeiten geschaffen für akademische Wissenschaftler Sonde Entdeckung Kampagnen für molekulare Targets und Signalwege in der Notwendigkeit einer besseren pharmakologischen 6 einzuleiten. Die MLPCN bietet Forschern den Zugang zu Industrie-scale Screening-Zentren und die medizinische Chemie und Informatik zu unterstützen niedermolekularen Sonden, um die Funktion von Genen und Gen-Netzwerke aufzuklären entwickeln. Der entscheidende Schritt in der Zulassung zu dem MLPCN ist die Entwicklung eines robusten Target-oder Pathway-spezifischen Assay, zugänglich für High-Throughput-Screening (HTS) ist. Hier beschreiben wir, wie man eine Fluoreszenz-basierten Thallium (Tl +) flux assa entwickelny von Kir Kanalfunktion für das Hochdurchsatz-Screening Verbindung 7,8,9,10. Der Assay basiert auf der Durchlässigkeit des K +-Kanals Pore der K + Kongener Tl + basiert. Eine handelsübliche Leuchtstofflampen Tl + Reporter-Farbstoff wird verwendet, um transmembrane Fluss der Tl + durch die Pore zu erkennen. Es gibt mindestens drei kommerziell erhältliche Farbstoffe, die sich für Tl + Flux Assays sind: BTC, FluoZin-2 und 7,8 Fluxor. Dieses Protokoll beschreibt Assay-Entwicklung mit FluoZin-2. Obwohl ursprünglich entwickelt und vermarktet als Zink-Indikator, Ausstellungen FluoZin-2 eine robuste und dosisabhängige Erhöhung der Fluoreszenzemission auf Tl + Bindung. Wir begann mit FluoZin-2 vor Fluxor verfügbar war 7,8 und haben weiterhin so 9,10 zu tun. Jedoch sind die Schritte in Assay-Entwicklung im wesentlichen identisch für alle drei Farbstoffe, und Benutzer sollten bestimmen, welche am besten geeigneten Farbstoff ist für ihre spezifische nEEDS. Wir diskutieren auch die Assays Performance-Benchmarks, die erreicht, um für die Einreise in die MLPCN in Betracht gezogen werden muss. Da Tl + gut durchzieht die meisten K +-Kanäle, sollte der Test sein, anpassbar an die meisten K +-Kanal Ziele.

Die Verwendung eines Tetracyclin-induzierbaren Expressionssystem bietet eine bequeme interne Kontrolle für die Unterscheidung Tl + Fluß durch endogene Wege und der Kir interessierenden Kanal. Abbildung 1 zeigt einige Beispiele von Zell Plattieren Karten in verschiedenen Arten von Experimenten verwendet. Die Positionen der Vertiefungen mit induzierten oder Tetracyclin-induzierten Zellen werden mit unterschiedlichen Farben dargestellt. Abbildung 2A zeigt die Source-Platte Karte...

Verfahren zum Entwickeln und Validieren eines quantitativen Fluoreszenz-Assay zur Messung der Aktivität von Kalium Einwärtsgleichrichter (KIR) Kanäle für das Hochdurchsatz-Screening Verbindung wird vorgestellt.

High-throughput Screening niedermolekularer Modulatoren von Inward Gleichrichter-Kaliumkanäle

Bestimmte Mitglieder der Familie der einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanäle (Kir) werden als potenzielle Wirkstofftargets für eine Vielzahl von Erkrankungen postuliert, darunter Hypertonie, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neue Verbindungen zu entdecken, die die Aktivität von inward-rectifier-Kaliumkanälen modulieren. Dies wird erreicht, indem zuerst tetracyclin-induzierbare HK 2 9 3-Zellen, die einen KIR-Kanal der gewünschten Spezifität exprimieren, in einer 384-Well-Platte ausplattiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen mit einem fluoreszierenden Thallium-Reportersfarbstoff namens flu in two zu beladen.Anschließend wird der nicht eingebaute Farbstoff aus den Zellen ausgewaschen und durch Assaypuffer mit einem Fahrzeugkontrollmittel oder Testverbindungen ersetzt. Im letzten Schritt wird ein Stimulationspuffer in die Vertiefungen gegeben, um den Thallium-Fluss einzuleiten. Abschließend wird ein Fluoreszenz-Plattenreader verwendet, um die Verbindungen zu identifizieren, die die Bewegung von Thalliumionen durch den KIR-Kanal verändern. Schlecht.Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Techniken wie der manuellen Patch-Clamp-Elektrophysiologie liegt darin, dass der Untersucher Hunderte von Experimenten gleichzeitig und Tausende von Experimenten pro Tag durchführen kann. Diese Methode ermöglicht es dem Untersucher, Bib

high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein Echtzeit-Screening-Verfahren zur Identifizierung von Medikamenten, die mit G-Protein-gated Einwärtsgleichrichter K...

Ein fluoreszierendes Screening Assay zur Identifizierung von Modulatoren der GIRK Kanäle

Optische Biosensor-Techniken können Massenänderungen in der Nähe der Plasmamembran in lebenden Zellen erkennen und erlauben es, zelluläre Reaktionen in beiden Einzelzellen und Zellpopulationen zu folgen. Dieses Protokoll wird die Detektion der Modulation von Kaliumkanälen durch G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in intakten Zellen unter Verwendung dieses Ansatzes zu beschreiben.

Verwenden von Label-freien optischen Biosensoren zur Modulation von Kaliumkanälen durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren erkennen

Hier beschreiben wir einen zellbasierten Reportergen-Assay als wertvolles Werkzeug zum Screening chemischer Bibliotheken auf Verbindungen, die posttranskriptionelle Kontrollmechanismen modulieren, die durch 3' UTR ausgeübt werden.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Die Wechselwirkung zwischen HCN-Kanäle und deren Hilfsuntereinheit als ein therapeutisches Ziel in der Major Depressive Disorder identifiziert worden. Hier wird eine Fluoreszenzpolarisationsgestütztes Verfahren zur Identifizierung von Kleinmolekül-Inhibitoren dieser Protein-Protein-Interaktion, dargestellt.

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Studieren Ionenkanäle durch ein heterolog exprimierenden System hat eine Kerntechnik in der biomedizinischen Forschung. In diesem Manuskript stellen wir eine zeiteffiziente Methode streng kontrollierten Ionenkanal-Expression durch Durchführung transienter Transfektion unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors zu erzielen.

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Hier stellen wir ein quantitatives und skalierbares Protokoll vor, um gezielte kleine Molekülbildschirme für Kinase-Regulatoren des naiv-grundierten pluripotenten Übergangs durchzuführen.

Eine einfache Methode zur Identifizierung von Kinasen, die die embryonale Stammzell-Pluripotenz durch Hochdurchsatz-Inhibitor-Screening regulieren

Ein Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH)-gekoppelter ATPase-Assay wurde an das semihohe Durchsatzscreening von kleinen Molekül-Myosininhibitoren angepasst. Dieser kinetische Assay wird in einem 384-Well-Mikroplattenformat mit einem Gesamtreaktionsvolumen von nur 20 l pro Brunnen ausgeführt. Die Plattform sollte für praktisch jedes ADP-produzierende Enzym gelten.

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Untersuchung von elektrogenen Membranproteinen durch Messung von Änderungen des Membranpotentials. Dieser Assay bietet eine Plattform für die funktionelle Auslesung mehrerer Ionenkanäle, die endogen in Epithelzelllinien exprimiert werden.

Ein fluoreszenzbasierter Assay des Membranpotentials zur Hochdurchsatz-Funktionsuntersuchung zweier endogener Ionenkanäle in zwei Epithelzelllinien

Das vorliegende Protokoll hebt die Anwendung der Western-Blotting-Technik hervor, um die Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K-Cl-Co-Transporters KCC2 zu untersuchen. Das Protokoll beschreibt die Untersuchung der KCC2-Phosphorylierung an Kinase-regulatorischen Stellen Thr906/1007 mittels Western Blotting. Außerdem werden zusätzliche Methoden zur Bestätigung der KCC2-Aktivität in diesem Text kurz hervorgehoben.

Untersuchung der Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K-Cl-Co-Transporters KCC2 mittels Western Blotting

Dieses Protokoll beschreibt eine auf Durchflusszytometrie basierende Hochdurchsatz-Screening-Methode zur Identifizierung niedermolekularer Medikamente, die die β2-Integrin-Aktivierung auf menschlichen Neutrophilen hemmen.

Eine auf Durchflusszytometrie basierende Hochdurchsatztechnik für das Screening von Integrin-hemmenden Medikamenten

Das pharmakologische Targeting von Ionenkanälen ist ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung solider Tumore. Es werden detaillierte Protokolle zur Charakterisierung der Ionenkanalfunktion in Krebszellen und zur Untersuchung der Auswirkungen von Ionenkanalmodulatoren auf die Lebensfähigkeit von Krebs bereitgestellt.

Screening von Ionenkanälen in Krebszellen

Erfahren Sie, wie Sie einen quantitativen Fluoreszenz-Assay zur Messung der Aktivität von Inward Rectifier-Kaliumkanälen (Kir) entwickeln und validieren. Diese Methode ermöglicht das Hochdurchsatz-Screening potenzieller Modulatoren für die Arzneimittelforschung.

High-throughput Screening niedermolekularer Modulatoren von Inward Gleichrichter-Kaliumkanäle

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