Name: High-throughput Screening niedermolekularer Modulatoren von Inward Gleichrichter-Kaliumkanäle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie einen quantitativen Fluoreszenz-Assay zur Messung der Aktivität von Inward Rectifier-Kaliumkanälen (Kir) entwickeln und validieren. Diese Methode ermöglicht das Hochdurchsatz-Screening potenzieller Modulatoren für die Arzneimittelforschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch Mittel aus National Institutes of Health Zuschüsse 1R21NS073097-01 und 1R01DK082884 (JSD) und der Stiftung für den National Institutes Gewährung PIER11VCTR unterstützt.

<ol><li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129(2008).</li>
<li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K%2B+channels%3A+recent+advances+and+future+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757(2010).</li>
<li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213(2007).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291(1998).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin%3A+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286(1999).</li>
<li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain%3A+a+Mount+Everest+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764(2010).</li>
<li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thallium-sensitive%2C+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671(2004).</li>
<li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094(2009).</li>
<li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1%2C+the+renal+outer+medullary+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42(2011).</li>
<li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+%28Kir%29+channels+with+preference+for+Kir2.3%2C+Kir3.x%2C+and+Kir7.1%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75(2012).</li>
<li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213(2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Datenverarbeitung: Sobald die Daten gesammelt werden, ein gemeinsamer Schritt in der Analyse beinhaltet Normalisierung jedes Brunnens Fluoreszenz-Antwort, F, auf den Ausgangswert zu Beginn des Experiments, F 0. Dies wird allgemein als der &quot;statische Verhältnis&quot; bezeichnet und symbolisiert &quot;F / F 0&quot;. In Fällen, in denen F 0 von der Indikatorfarbstoff dominiert wird die statische Verhältnis Operation wird im wesentlichen für viele Faktoren wi...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> Tetracyclin-induzierbarer Expressionsvektor </td></tr><tr><td> T-Rex-HEK293-Zellen </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> Tetracyclin-induzierbaren Zelllinie </td></tr><tr><td> Lipofectamine LTX / Plus Reagent </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Transfektionsreagenz </td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S11550 </td><td> Zellkulturmedien </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Zellkulturmedien </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> Zellkulturmedien </td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> Zellkulturmedien </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Zellkulturmedien </td></tr><tr><td> HBSS-zweiwertigen kostenlos </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> Waschen der Zellen </td></tr><tr><td> Trypsin-0,25% </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> Zelldissoziationslösung </td></tr><tr><td> Tetracyclin-HCl </td><td> Sigma </td><td> T9823 </td><td> Induction Reagenz </td></tr><tr><td> Dialysiertes FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S12650 </td><td> Plattierungsmedien </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> Fluoreszenzfarbstoff </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> Dye Belastung </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> Assay-Puffer </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td> Assay-Puffer </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td> Tl + Stimulus-Puffer </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Tl + Stimulus-Puffer </td></tr><tr><td> CaSO 4 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3771 </td><td> Tl + Stimulus-Puffer </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> Tl + Stimulus-Puffer </td></tr><tr><td> Thalliumsulfat </td><td> Aldrich </td><td> 204625 </td><td> Tl + Stimulus-Puffer </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Tl + Stimulus-Puffer </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D4540 </td><td> Lösungsmittel </td></tr><tr><td> Acht-Kanal elektronische Pipette </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> Zelle plating in 384 -Well-Platten </td></tr><tr><td> BD PureCoat Amin-beschichtete 384-Well-Platten </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> Assay Mikrotiterplatten </td></tr><tr><td> Echo qualifiziert 384-Well Polypropylen Microplatte (384PP) </td><td> Labcyte </td><td> P-05.525 </td><td> Compound Quelle Mikrotiterplatten </td></tr><tr><td> 384-well Mikroplatten Polypropylen </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Multidrop Combi Reagenzspender </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 Mikroplatten-Washer </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> Automationszelle Waschen </td></tr><tr><td> Echo Liquid Handler </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte Echo 550 </td><td></td></tr><tr><td> Bravo automatisierten Liquid-Handling-Plattform </td><td> Agilent Technologies </td><td> Standard-Modell </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu FDSS 6000 </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> Kinetic Imaging Plate Reader </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Liste der Materialien und Reagenzien.

high-throughput screening niedermolekularer modulatoren von inward gleichrichter-kaliumkanäle

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Bestimmte Mitglieder der Einwärtsgleichrichter Kalium (Kir) Kanal Familie drug targets für eine Vielzahl von Erkrankungen, einschließlich Bluthochdruck, Vorhofflimmern und Schmerzen 1,2 postuliert. Zum größten Teil jedoch Fortschritte zum Verständnis ihres therapeutischen Potenzials oder sogar grundlegenden physiologischen Funktionen durch den Mangel an guten pharmakologischen Werkzeugen verlangsamt. In der Tat hat die molekulare Pharmakologie des Einwärtsgleichrichter Familie weit hinter der des S4 Superfamilie der spannungsgesteuerten Kaliumkanäle (Kv)-Kanäle, für die eine Reihe von nanomolaren-Affinität und hochselektive Peptidtoxin Modulatoren 3 entdeckt haben zurückgeblieben. Die Bienengift Toxin tertiapin und seine Derivate sind potente Inhibitoren von Kir1.1 und Kir3 Kanäle 4,5, aber Peptide sind nur von begrenztem Nutzen therapeutisch als auch experimentell aufgrund ihrer antigenen Eigenschaften und schlechte Bioverfügbarkeit, metabolische Stabilität und Gewebe Penetranz. Die Entwicklung potenterund selektive niedermolekulare Sonden mit verbesserten pharmakologischen Eigenschaften werden ein Schlüsselfaktor für ein volles Verständnis der Physiologie und therapeutische Potenzial von Kir-Kanälen sein. Das Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) durch die National Institutes of Health (NIH) Common Fund hat Möglichkeiten geschaffen für akademische Wissenschaftler Sonde Entdeckung Kampagnen für molekulare Targets und Signalwege in der Notwendigkeit einer besseren pharmakologischen 6 einzuleiten. Die MLPCN bietet Forschern den Zugang zu Industrie-scale Screening-Zentren und die medizinische Chemie und Informatik zu unterstützen niedermolekularen Sonden, um die Funktion von Genen und Gen-Netzwerke aufzuklären entwickeln. Der entscheidende Schritt in der Zulassung zu dem MLPCN ist die Entwicklung eines robusten Target-oder Pathway-spezifischen Assay, zugänglich für High-Throughput-Screening (HTS) ist. Hier beschreiben wir, wie man eine Fluoreszenz-basierten Thallium (Tl +) flux assa entwickelny von Kir Kanalfunktion für das Hochdurchsatz-Screening Verbindung 7,8,9,10. Der Assay basiert auf der Durchlässigkeit des K +-Kanals Pore der K + Kongener Tl + basiert. Eine handelsübliche Leuchtstofflampen Tl + Reporter-Farbstoff wird verwendet, um transmembrane Fluss der Tl + durch die Pore zu erkennen. Es gibt mindestens drei kommerziell erhältliche Farbstoffe, die sich für Tl + Flux Assays sind: BTC, FluoZin-2 und 7,8 Fluxor. Dieses Protokoll beschreibt Assay-Entwicklung mit FluoZin-2. Obwohl ursprünglich entwickelt und vermarktet als Zink-Indikator, Ausstellungen FluoZin-2 eine robuste und dosisabhängige Erhöhung der Fluoreszenzemission auf Tl + Bindung. Wir begann mit FluoZin-2 vor Fluxor verfügbar war 7,8 und haben weiterhin so 9,10 zu tun. Jedoch sind die Schritte in Assay-Entwicklung im wesentlichen identisch für alle drei Farbstoffe, und Benutzer sollten bestimmen, welche am besten geeigneten Farbstoff ist für ihre spezifische nEEDS. Wir diskutieren auch die Assays Performance-Benchmarks, die erreicht, um für die Einreise in die MLPCN in Betracht gezogen werden muss. Da Tl + gut durchzieht die meisten K +-Kanäle, sollte der Test sein, anpassbar an die meisten K +-Kanal Ziele.

Die Verwendung eines Tetracyclin-induzierbaren Expressionssystem bietet eine bequeme interne Kontrolle für die Unterscheidung Tl + Fluß durch endogene Wege und der Kir interessierenden Kanal. Abbildung 1 zeigt einige Beispiele von Zell Plattieren Karten in verschiedenen Arten von Experimenten verwendet. Die Positionen der Vertiefungen mit induzierten oder Tetracyclin-induzierten Zellen werden mit unterschiedlichen Farben dargestellt. Abbildung 2A zeigt die Source-Platte Karte...

Verfahren zum Entwickeln und Validieren eines quantitativen Fluoreszenz-Assay zur Messung der Aktivität von Kalium Einwärtsgleichrichter (KIR) Kanäle für das Hochdurchsatz-Screening Verbindung wird vorgestellt.

High-throughput Screening niedermolekularer Modulatoren von Inward Gleichrichter-Kaliumkanäle

Bestimmte Mitglieder der Familie der einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanäle (Kir) werden als potenzielle Wirkstofftargets für eine Vielzahl von Erkrankungen postuliert, darunter Hypertonie, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neue Verbindungen zu entdecken, die die Aktivität von inward-rectifier-Kaliumkanälen modulieren. Dies wird erreicht, indem zuerst tetracyclin-induzierbare HK 2 9 3-Zellen, die einen KIR-Kanal der gewünschten Spezifität exprimieren, in einer 384-Well-Platte ausplattiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen mit einem fluoreszierenden Thallium-Reportersfarbstoff namens flu in two zu beladen.Anschließend wird der nicht eingebaute Farbstoff aus den Zellen ausgewaschen und durch Assaypuffer mit einem Fahrzeugkontrollmittel oder Testverbindungen ersetzt. Im letzten Schritt wird ein Stimulationspuffer in die Vertiefungen gegeben, um den Thallium-Fluss einzuleiten. Abschließend wird ein Fluoreszenz-Plattenreader verwendet, um die Verbindungen zu identifizieren, die die Bewegung von Thalliumionen durch den KIR-Kanal verändern. Schlecht.Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Techniken wie der manuellen Patch-Clamp-Elektrophysiologie liegt darin, dass der Untersucher Hunderte von Experimenten gleichzeitig und Tausende von Experimenten pro Tag durchführen kann. Diese Methode ermöglicht es dem Untersucher, Bibliotheken mit Tausenden von kleinen Molekülen daraufhin zu screenen, ob sie Modulatoren von einwärts gerichteten Kaliumkanälen beeinflussen. Einen Tag vor dem Thallium-Flux-Experiment die Zellen lösen und die Dichte der Zellsuspension quantifizieren, wie in der begleitenden Veröffentlichung beschrieben. Anschließend das BH-Medium mit 10 % dialysiertem FBS verwenden, um 20.000 monoklonale Zellen, die stabil mit einem Gen für einen KIR-Kanal der Wahl transfiziert wurden, in jede Vertiefung einer BD PureCoat Amin-beschichteten 384-Loch-Platte mit einem Thermo Multi Drop Combi oder einer Mehrkanalpipette zu geben. Am nächsten Tag die Platte unter dem Mikroskop überprüfen, um sicherzustellen, dass die Zellen anhaftend sind und gleichmäßig über den Boden der Vertiefungen verteilt sind.Verwenden Sie anschließend einen ELX 405 Mikroplattenwascher, um das Zellkulturmedium durch HBSS-Assaypuffer mit je 20 µL pro Vertiefung zu ersetzen. Danach bereiten Sie das Flus in der 2:00 AM D-Lösung vor, indem Sie das Röhrchen kurz zentrifugieren, um 50 µg Flus in zwei Pulver in 100 µL wasserfreiem DMSO aufzulösen.Geben Sie nun 50 Mikroliter einer 20 % (Gewicht pro Volumen) Onic F1 27 DMSO-Lösung zum Farbstoff hinzu. Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. Anschließend geben Sie 150 Mikroliter Flus in 2:00 AM Onic F1 27 zu 35 Millilitern HBSS-Assaypuffer und mischen vorsichtig.Fügen Sie anschließend 20 Mikroliter Farbstoff-Lade-Puffer in jede Vertiefung hinzu, die bereits 20 Mikroliter HBSS-Assay-Puffer enthält. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für etwa eine Stunde, während die Zellen mit dem Farbstoff beladen werden. Bereiten Sie eine Thallium-Stimulationsplatte vor, indem Sie 0,5 Gramm Natriumbicarbonat frisch in 50 Milliliter 5x-Thallium-Stimulationspuffer auflösen.Als Nächstes 50 Mikroliter der Lösung in jedes Brunnen einer Polypropylen-Mikrotiterplatte mit 384 Brunnen geben, nachdem die Zellen um 2:00 Uhr morgens mit Flus beladen wurden. Die Platte mit einem ELX 405 Mikrotiterplattenwascher waschen. Danach 20 oder 40 Mikroliter HBSS-Assaypuffer zurück in jeden Brunnen geben. Die Platte ist nun bereit für die Experimente.Laden Sie die Thallium- und Zellplatten in ein funktionales Wirkstoff-Screening-System vom Typ Hema Matsu oder ein gleichwertiges kinetisches Bildgebungs-Plattenlesegerät mit integrierter Flüssigkeitsdosierung und verwenden Sie geeignete Filter für auf Fluorescein basierende Farbstoffe wie flu oh four. Richten Sie danach ein Einzelschritt-Zudosierungsprotokoll ein, um 10 Mikroliter einer fünffach konzentrierten Thallium-Lösung zu den entsprechenden Vertiefungen der Zellplatte hinzuzufügen, die 40 Mikroliter HBSS-Assaypuffer enthalten. Nehmen Sie anschließend die Basislinien-Fluoreszenz mit einer Abtastrate von einem Hertz über mindestens 10 Sekunden auf.Die Fluoreszenz von Vertiefung zu Vertiefung sollte gleichmäßig und stabil über die gesamte Platte sein, sobald optimale Bedingungen für das Zellausplattieren, Waschen und Beladen etabliert sind. In der Zwischenzeit verwenden Sie den integrierten 384-Kanal-Pipettierer, um den Thallium-Stimulationspuffer gleichzeitig in jede Vertiefung zuzugeben, und setzen die Aufzeichnung für mindestens zwei Minuten fort, damit die Rate und das Maximum des thalliuminduzierten Anstiegs der Fluoreszenz für die nachträgliche Analyse erfasst werden. In der nächsten Versuchsreihe bewerten Sie die Gleichmäßigkeit und Reproduzierbarkeit des Assays, indem Sie in jeder Spalte und Reihe einer 384-Vertiefungs-Platte in jeder zweiten Vertiefung einen Kontrollinhibitor ausplattieren und in die übrigen Vertiefungen DMSO als Fahrzeugkontrolle hinzufügen.Verwenden Sie einen Mehrkanalpipettierer. Stellen Sie eine Verbindung-DMSO-Platte her, indem Sie einen Inhibitor des Ziel-KIR-Kanals in der zuvor bestimmten Konzentration mit 80 Mikroliter pro Vertiefung und 0,1 % DMSO als Fahrzeug in eine 384-Loch-Polypropylenplatte pipettieren. Dies erfolgt, indem ein bekannter Inhibitor beginnend in Vertiefung A1 hinzugefügt wird, anschließend alternierend in Vertiefung B2 und so weiter bis hin zu Vertiefung B24.Wiederholen Sie diesen Vorgang mit DMSO, beginnend in Vertiefung B1 und so weiter bis Vertiefung A24. Laden Sie nun die Zell-, Verbindungsmittel- und Thalliumstimulationsplatten in das Plattenlesegerät. Richten Sie anschließend ein zweifaches Zugabeprotokoll ein, um 20 Mikroliter der zweifachen Konzentration der Verbindungsserie zu den entsprechenden Vertiefungen der Zellplatte hinzuzufügen, die 20 Mikroliter HBSS-Assaypuffer enthalten.Fügen Sie die Verbindungen der Zellplatte hinzu und inkubieren Sie sie bis zu 20 Minuten bei Raumtemperatur. Registrieren Sie die Basislinienfluoreszenz in zwei Fluoreszenzkanälen mindestens 10 Sekunden lang. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter Fünf-x-Thallium-Puffer in jedes Loch der Zellplatte.Wiederholen Sie das Experiment an drei aufeinanderfolgenden Tagen, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu überprüfen. Verwenden Sie den Thallium-Fluss in DMSO- und in mit Wirkstoff behandelten Zellen, um einen Wert für Z-Prime zu berechnen. Ein statistisches Maß für die Variabilität von Vertiefung zu Vertiefung zwischen den beiden Populationen von Vertiefungen, berechnet Z-Prime anhand dieser Formel, die auf den Mittelwerten und Standardabweichungen von P und N basiert, wobei P den uninhibierten Flusswert und N den vollständig inhibierten Flusswert darstellt.Ein Assay mit ZPrime-Werten größer oder gleich 0,5 an drei verschiedenen Tagen gilt als geeignet für das Hochdurchsatz-Screening. Diese Abbildungen zeigen einige Beispiele der Zellansäte-Karten, die in verschiedenen Experimenttypen verwendet werden. Die Positionen der Vertiefungen mit nicht induzierten oder mit Tetracyclin induzierten Zellen sind in unterschiedlichen Farben gekennzeichnet.Diese Abbildung zeigt die Quellplattenkarte, die zur Bestimmung der optimalen Thalliumkonzentration für die Assay-Entwicklung und die Substanzs screening verwendet wurde. Das Farbverlaufsmuster repräsentiert die dreifache Verdünnungsreihe im Bereich von 100 % bis 0,002 % Thallium, und hier ist eine repräsentative Fluoreszenzintensitätskarte mit kühlen bis warmen Farben dargestellt, die niedrige bis hohe Thallium-Flusswerte anzeigen. Die hier gezeigte Zellplattierungskarte mit Anpassung einer vierparametrigen logistischen Funktion an die Thallium-Konzentrations-Wirkungs-Kurve (CRC) dient zur Bestimmung eines EEC-80-Werts von 15 % Thallium.Diese Abbildung zeigt die Quellplattenkarte, die zur Bestimmung der DMSO-Toleranz eines Assays verwendet wurde. Die Spalten eins und 24 enthalten nur Assaypuffer, während der Farbverlauf die zweifache Verdünnungsreihe von 10 % bis 0,01 % DMSO angibt, sowie eine repräsentative Fluoreszenzintensitätskarte, bei der niedrige Thallium-Flusswerte durch dunkleres Blau gekennzeichnet sind. Die durchschnittlichen Thallium-Flusswerte, die aus den Vertiefungen mit den angegebenen DMSO-Konzentrationen aufgezeichnet wurden, sind hier zusammengefasst.Nun zeigt diese Abbildung die Quellplattenkarte, die zur Erstellung von Konzentrations-Wirkungs-Kurven für bekannte Inhibitoren eines KIR-Kanals verwendet wurde. Jede Verbindung ist mit einer anderen Farbe gekennzeichnet und wird typischerweise als dreifache Verdünnungsreihe aufgetragen. Hier ist eine repräsentative Fluoreszenzintensitätskarte dargestellt, und diese Abbildung zeigt die dosisabhängige Hemmung des Thallium-Flusses durch einen Inhibitor nach der Entwicklung und Optimierung.Der Thallium-Fluss-Assay kann ebenfalls zur Durchführung einer Vielzahl routinemäßiger pharmakologischer Assays eingesetzt werden. Der Thallium-Fluss-Assay wurde bereits früher für die Anwendung mit spannungs- und ligandenaktivierten Kaliumkanälen, nichtselektiven Kationenkanälen und sogar Kaliumtransportern angepasst. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Thallium äußerst gefährlich sein kann und stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von Handschuhen sowie eine geeignete Entsorgung von Abfällen getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein Echtzeit-Screening-Verfahren zur Identifizierung von Medikamenten, die mit G-Protein-gated Einwärtsgleichrichter K...

Ein fluoreszierendes Screening Assay zur Identifizierung von Modulatoren der GIRK Kanäle

Optische Biosensor-Techniken können Massenänderungen in der Nähe der Plasmamembran in lebenden Zellen erkennen und erlauben es, zelluläre Reaktionen in beiden Einzelzellen und Zellpopulationen zu folgen. Dieses Protokoll wird die Detektion der Modulation von Kaliumkanälen durch G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in intakten Zellen unter Verwendung dieses Ansatzes zu beschreiben.

Verwenden von Label-freien optischen Biosensoren zur Modulation von Kaliumkanälen durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren erkennen

Hier beschreiben wir einen zellbasierten Reportergen-Assay als wertvolles Werkzeug zum Screening chemischer Bibliotheken auf Verbindungen, die posttranskriptionelle Kontrollmechanismen modulieren, die durch 3' UTR ausgeübt werden.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Die Wechselwirkung zwischen HCN-Kanäle und deren Hilfsuntereinheit als ein therapeutisches Ziel in der Major Depressive Disorder identifiziert worden. Hier wird eine Fluoreszenzpolarisationsgestütztes Verfahren zur Identifizierung von Kleinmolekül-Inhibitoren dieser Protein-Protein-Interaktion, dargestellt.

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Studieren Ionenkanäle durch ein heterolog exprimierenden System hat eine Kerntechnik in der biomedizinischen Forschung. In diesem Manuskript stellen wir eine zeiteffiziente Methode streng kontrollierten Ionenkanal-Expression durch Durchführung transienter Transfektion unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors zu erzielen.

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Hier stellen wir ein quantitatives und skalierbares Protokoll vor, um gezielte kleine Molekülbildschirme für Kinase-Regulatoren des naiv-grundierten pluripotenten Übergangs durchzuführen.

Eine einfache Methode zur Identifizierung von Kinasen, die die embryonale Stammzell-Pluripotenz durch Hochdurchsatz-Inhibitor-Screening regulieren

Ein Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH)-gekoppelter ATPase-Assay wurde an das semihohe Durchsatzscreening von kleinen Molekül-Myosininhibitoren angepasst. Dieser kinetische Assay wird in einem 384-Well-Mikroplattenformat mit einem Gesamtreaktionsvolumen von nur 20 l pro Brunnen ausgeführt. Die Plattform sollte für praktisch jedes ADP-produzierende Enzym gelten.

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Untersuchung von elektrogenen Membranproteinen durch Messung von Änderungen des Membranpotentials. Dieser Assay bietet eine Plattform für die funktionelle Auslesung mehrerer Ionenkanäle, die endogen in Epithelzelllinien exprimiert werden.

Ein fluoreszenzbasierter Assay des Membranpotentials zur Hochdurchsatz-Funktionsuntersuchung zweier endogener Ionenkanäle in zwei Epithelzelllinien

Das vorliegende Protokoll hebt die Anwendung der Western-Blotting-Technik hervor, um die Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K-Cl-Co-Transporters KCC2 zu untersuchen. Das Protokoll beschreibt die Untersuchung der KCC2-Phosphorylierung an Kinase-regulatorischen Stellen Thr906/1007 mittels Western Blotting. Außerdem werden zusätzliche Methoden zur Bestätigung der KCC2-Aktivität in diesem Text kurz hervorgehoben.

Untersuchung der Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K-Cl-Co-Transporters KCC2 mittels Western Blotting

Dieses Protokoll beschreibt eine auf Durchflusszytometrie basierende Hochdurchsatz-Screening-Methode zur Identifizierung niedermolekularer Medikamente, die die β2-Integrin-Aktivierung auf menschlichen Neutrophilen hemmen.

Eine auf Durchflusszytometrie basierende Hochdurchsatztechnik für das Screening von Integrin-hemmenden Medikamenten

Das pharmakologische Targeting von Ionenkanälen ist ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung solider Tumore. Es werden detaillierte Protokolle zur Charakterisierung der Ionenkanalfunktion in Krebszellen und zur Untersuchung der Auswirkungen von Ionenkanalmodulatoren auf die Lebensfähigkeit von Krebs bereitgestellt.

Screening von Ionenkanälen in Krebszellen

Erfahren Sie, wie Sie einen quantitativen Fluoreszenz-Assay zur Messung der Aktivität von Inward Rectifier-Kaliumkanälen (Kir) entwickeln und validieren. Diese Methode ermöglicht das Hochdurchsatz-Screening potenzieller Modulatoren für die Arzneimittelforschung.

High-throughput Screening niedermolekularer Modulatoren von Inward Gleichrichter-Kaliumkanäle

Weitere Videos entdecken