Menschliche neuroendokrinen Tumor-Zelllinien als dreidimensionales Modell für das Studium der menschlichen neuroendokrinen Tumor-Therapie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine einfache und unkomplizierte Methode zur Herstellung homogener, dreidimensionaler Steroide von neuroendokrinen Tumoren sowie eine einfache Methode zur Verarbeitung der HistoGel-Einbettung zur Untersuchung der Histologie dieser Steroide zu entwickeln. Dies wird erreicht, indem 24-Loch-Platten gleichmäßig mit Aeros beschichtet werden, auf die humanen neuroendokrinen Tumorzellen in einer Einzelzell-Suspension ausgesät werden. Die Platte wird anschließend über Nacht in einem Inkubator auf einem rotierenden Schüttler bei einer Geschwindigkeit unterhalb von 40 U/min inkubiert und danach auf ein stabiles Regal im Inkubator übertragen.

Sphäroide bilden sich am dritten oder vierten Tag, und ihr Wachstum sowie ihre Integrität werden mittels Phasenkontrastmikroskopie überwacht, um ihre Histologie zu untersuchen. Die 3D-Steroiden werden vor der routinemäßigen Paraffineinbettung in erwärmtes HistoGel eingebettet, wodurch Ergebnisse erhalten werden, die das Wachstum von neuroendokrinen Tumoren in 3D-Steroiden anhand von Bildern zeigen, die während der Phasenkontrastmikroskopie aufgenommen wurden. Die Histologie der 3D-Steroiden wird durch H-und-E- sowie immunhistochemische Färbung von Paraffinschnittpräparaten der 3D-Steroiden analysiert.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der bestehenden Methode liegt in ihrer Einfachheit, Benutzerfreundlichkeit, Zuverlässigkeit und Kosteneffizienz. Diese Methode kann die Forschung im Bereich der Arzneimittelentwicklung unterstützen, indem sie dabei hilft, therapeutische Wirkstoffe für Patienten mit neuroendokrinen Tumoren schnell zu identifizieren. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, zumindest anfangs Schwierigkeiten haben, gleichförmig geformte 3D-Steroide von einheitlicher Größe anzuziehen.

Der Schlüssel hierfür liegt darin, sicherzustellen, dass Ihre 24-Loch-Platten gleichmäßig mit Agros beschichtet sind, und dass Ihre Einzelzell-Suspensionen gut dispergiert und genau dosiert sind. Um die Histologie der 3D-Steroide zu untersuchen, müssen wir eine Gewebeverarbeitung und immunchemische Färbung durchführen. Das histologische Einbetten der 3D-Steroide ist der entscheidende Schritt, der später am heutigen Tag demonstriert wird. Um 1 % Augurs zur Beschichtung von 24-Loch-Platten herzustellen, geben Sie ein Gramm Aeros in 100 Milliliter deionisiertes Wasser in eine Flasche mit einem Fassungsvermögen von 250 bis 500 Milliliter und autoklavieren das Aeros zur Sterilisation nach der Zubereitung.

Überführen Sie die Flasche für etwa eine Stunde in ein 70 Grad Celsius heißes Wasserbad. Damit sich das Aeros auf 70 Grad Celsius abkühlt, muss das Aeros stets steriler Haltung unterzogen werden. Geben Sie in einem Biosicherheitsschrank mit einer Mehrfachpipette jeweils 200 Mikroliter Aeros in die Vertiefungen einer 24er-Platte.

Platten mit flachem Boden für dieses Protokoll. Jede Art von 24-Loch-Platten mit flachem Boden ist geeignet, solange die Platten unter einem Phasenkontrstmikroskop abgebildet werden können. Wirbeln Sie das Aeros in dem Loch, um es gleichmäßig zu verteilen. 200 µL Aeros sind optimal, um eine konkave Oberfläche zu bilden, die die Bildung konsistenter sphärischer Formen des Sphäroids ermöglicht.

Nach etwa 10 Minuten sind die beschichteten 24-Well-Platten gebrauchsfertig. Die in diesem Experiment verwendeten Bon-eins-Zellen sind humane pankreatische neuroendokrine Tumor- oder NET-Zellen, die in D-M-E-M-F 12 mit 10 % FBS-Medium in einer sterilen Zellkulturschale in einem feuchten Inkubator bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid kultiviert werden. Wenn die monolayerartig wachsenden Bon-eins-Zellen eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreicht haben, werden Einzelzell-Suspensionen in einer Biosicherheitswerkbank hergestellt.

Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, lösen Sie die Zellen von der Schale, indem Sie ein Milliliter Trip le hinzufügen und fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob alle Zellen von der Schale abgelöst sind, und geben Sie dann neun Milliliter Wachstumsmedium zum Trypsin hinzu.

Pipettieren Sie die Zellen mehrmals auf und ab, um eine gleichmäßige Einzelzell-Suspension zu gewährleisten. Filtern Sie die Zellen durch einen 70-Mikron-Zellfilter. Nach der Zellzählung gesammelte gefilterte Zellen verwenden und eine Suspension mit 5.000 Zellen pro Milliliter in D-M-E-M-F 12 mit 10 % FBS Wachstumsmedium herstellen.

Die Anzahl der zu plattierenden Zellen sollte empirisch basierend auf der Größe der Sphäroide am sechsten Tag bestimmt werden. Ideal wäre eine Größe zwischen 300 und 400 Nanometern im Durchmesser. Aus diesem Grund plattieren wir tausend Zellen pro 200 Mikroliter pro Vertiefung.

Um dieses Verfahren zu beginnen, überlagern Sie 200 Mikroliter der Einzelzell-Suspension auf jedes aeros-beschichtete Loch der zuvor vorbereiteten 24-Loch-Platten und versiegeln Sie die 24-Loch-Platten mit steriler Klebefolie, um Verdunstung zu verhindern. Stellen Sie die aeros-beschichteten 24-Loch-Platten, die Bon-One-Zellen enthalten, auf einen orbitalen Schüttler mit sehr schwacher Schüttelbewegung in einen feuchten Inkubator bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid in Luft. Inkubieren Sie über Nacht; am folgenden Morgen versetzen Sie die Platten auf eine stabile Fläche und lassen Sie die Kulturen weiterhin im Inkubator wachsen. Alle drei Tage.

Fügen Sie 200 µL Wachstumsmedium zu jedem Brunnen der Platten hinzu. Um das PHE nicht zu stören, berühren Sie die Pipettenspitze an der Seite des Brunnens und lassen Sie das Medium entlang der Wand in den Brunnen fließen. Überwachen Sie die OID-Bildung in den 24-Loch-Platten unter dem Mikroskop. Die medikamentöse Behandlung der 3D-Steroidstrukturen wird am sechsten Kulturtag begonnen.

Wenn die Sphäroide einen Durchmesser von etwa 300 bis 400 Mikrometern aufweisen, wird dieser Zeitpunkt als Tag null für die Behandlung mit Wirkstoffen am Tag sechs festgelegt. Jedes Well der Platten enthält etwa 400 Mikroliter Medium, um sicherzustellen, dass die Wirkstoffbehandlungen in jedem Well eine endgültige Konzentration von ein x erreichen. Für jede Behandlungsdosis wird die dreifache gewünschte Konzentration hergestellt, indem die entsprechende Menge der Wirkstoff-Stammlösung in fünf Milliliter Wachstumsmedium in einem 15-Milliliter-Kegelrohr verdünnt wird, was für acht Replikate ausreicht. Die PHE in jeder Reihe der 24-Well-Platten werden als Fahrzeug (vehicle) und Dosis 1, 2, 3, 4 und 5 bezeichnet. Für jede Dosis der Behandlung gibt es vier Replikate pro 24-Well-Platte.

Üblicherweise werden 3D-PHE in mindestens zwei 24-Loch-Platten kultiviert, was für jede Behandlungsdosis mindestens acht Wiederholungen ergibt. Vor dem Hinzufügen der Behandlung spinnt man die 24-Loch-Platten ab, um sicherzustellen, dass sämtliche Kondensation an der Deckfolie aufgrund der Schwimmfähigkeit der 3D-Steroid-Körperchen in die Vertiefungen gelangt. Das Medium in jedem Loch wird nach der Zentrifugation nicht entfernt.

Um eine Störung der Sphäroide zu vermeiden, vorsichtig 200 Mikroliter jeder Behandlungsdosis in die entsprechenden Vertiefungen entlang der Wand jeder Vertiefung hinzufügen. Die 24-Loch-Platten mit Klebeband abdichten und die Kulturen in einem feuchten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid in Luft inkubieren. Die 3D-Steroidkulturen zu jedem gewählten Zeitpunkt nach der Behandlung mit einem Phasenkontrastmikroskop überwachen.

Ein 5x-Objektiv ist ideal, da die PHE mit einem 10x-Objektiv das Abbildungsfeld schnell überschreiten. Nehmen Sie Bilder des Steroids in jeder Vertiefung zu jedem Zeitpunkt vor der HistoGel-Behandlung auf. Die entstehenden 3D-Steroid-Netzstrukturen werden aus den 24-Loch-Platten gesammelt und in 10 % Formalin fixiert.

Stellen Sie eine Tube mit kaltem HistoGel in einen mit Wasser gefüllten Becher. Erhitzen Sie den Becher in einer Mikrowelle für eine Minute oder bis das Gel vollständig verflüssigt ist. Bewahren Sie die Tube während des gesamten Verfahrens in dem gleichen mit Wasser gefüllten Becher auf.

Unter Verwendung einer Einweg-Plastikpipette. Überführen Sie das gesamte Steroid in eine Biopsie-Kryoform. Lassen Sie das Steroid etwa eine Minute lang stehen, damit es sich auf den Boden der Biopsie-Kryoform absetzen kann.

Versuchen Sie, die Flüssigkeit in der Biopsie-Kryoform mit Kim-Tüchern zu entfernen. Drücken Sie das Steroid mit einem Zahnstocher sehr vorsichtig in die Mitte am Boden der Biopsie-Kryoform. Halten Sie danach das Steroid mit der Pasteur-Pipette, indem Sie es sehr sanft in der Mitte der Biopsie-Kryoform fixieren.

Geben Sie eine dünne Schicht erwärmtes HistoGel in die Biopsie-Kryoform. Geben Sie nicht zu viel HistoGel hinzu. Es sollte gerade ausreichen, um die Steroide in der Mitte zu stabilisieren.

Lassen Sie das Steroid in HistoGel eine bis zwei Minuten bei Raumtemperatur stehen oder bis das HistoGel erstarrt ist. Füllen Sie den Rest der Biopsie-Kryoschablone mit erwärmtem HistoGel auf und lassen Sie es etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur erstarren. Unmittelbar vor dem Herauslösen dieses HistoGel-Blocks aus der Biopsie-Kryoschablone.

Das Kryoschneidemodul eine Minute lang auf Eis liegen lassen, dann den intakten Steroid-HistoGel-Block herauslösen. Den Block in eine Folie aus Bio-Wrap einschlagen und in ein Gewebe- und Biopsiekassettenfach legen. Die Gewebe- und Biopsiekassette in einem Behälter mit 70 % Ethanol aufbewahren.

Anschließend werden routinemäßige Gewebeverarbeitungsverfahren für die Paraffineinbettung durchgeführt, wenn die Zellen auf aeros kodierten 24-Loch-Platten gezüchtet wurden. Verschiedene NET-Zelllinien weisen unterschiedliche Morphologien auf, wie hier zu sehen ist. Die humane pankreatische NET-Zelllinie BON-1 und die humane pulmonale NET-Zelllinie H727 bildeten 3D-Steroide.

Im Gegensatz dazu qgp one. Menschliche pankreatische Netzellen zeigen große, traubenartige, poröse Zellverbände, die nicht als Steroide angesehen werden. Nach dem Ansäen von one-Zellen auf die mit Agros beschichtete 24-Loch-Platte tritt typischerweise bis zum dritten oder vierten Tag eine multizelluläre Steroidbildung auf, und bis zum sechsten Tag werden die Steroide runder.

Aufgrund der Nährstoff- und Sauerstofflimitierung beginnen die Zellen im dichten Kern des Steroids etwa ab Tag 10 abzusterben, und bis Tag 17 beginnen die Steroide auseinanderzufallen. Aufgrund der großen Größe oder in einigen Fällen der Ausschüttung des nekrotischen Strangs können die Steroide typischerweise bis zu 1000 µm im Durchmesser erreichen.

In diesem Experiment wurden am sechsten Tag erzeugte 3D-Steroidstrukturen als Ausgangspunkt für die Behandlung mit dem Histondeacetylase-Inhibitor Trichostatin A oder TSA gewählt. Bisher wurde berichtet, dass Histondeacetylase-Inhibitoren antiproliferative und pro-apoptotische Effekte auf Netzhautzellen ausüben. Diese Bilder verfolgen die Morphologie der 3D-Steroidstrukturen zu Beginn der Behandlung sowie 24, 48, 72 und 96 Stunden danach.

V steht für die Behandlung mit dem Lösungsmittel, das in diesem Fall DMSO ist. D eins bis D fünf repräsentieren die Behandlung mit steigenden Dosen von TSA entsprechend der Größe jedes einzelnen Individuums. OID wurde automatisch von einem speziell entwickelten MATLAB-Computerprogramm geschätzt.

Pro Zeitpunkt wurden mindestens acht SPHs pro Dosis der TSA-Behandlung gemessen, und die Ergebnisse werden in diesem Diagramm relativ zum Vehicle dargestellt. Alle Dosen von TSA zeigten in 3D-OIDs einen gewissen Grad an Wachstumshemmung. Bei TSA-Konzentrationen von 125 Nanomolar und 250 Nanomolar wurde das Wachstum der 3D-Steroide stark unterdrückt, um die Histologie des verbleibenden 3D-Steroids zu verstehen.

Die H- und E-Färbung sowie immunhistochemische Färbungen wurden an einem 3D-Steroid durchgeführt, das 17 Tage lang kultiviert worden war. KI 67 ist ein Marker für proliferierende Zellen, während gespaltene Caspase-3 ein Marker für apoptotische Zellen ist. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zellen der äußeren Schicht des 3D-Steroids aktiv proliferieren, während die Zellen im Inneren hauptsächlich nekrotisch oder apoptotisch sind.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können zusätzliche Analysen wie der Cell-Titer-Glo-Assay durchgeführt werden, um die Zellviabilität dieser 3D-Steroidstrukturen zu bestimmen. Nach ihrer Entwicklung kann diese Technik auf 96-Loch-Platten erweitert werden, um Hochdurchsatz-Screenings durchzuführen, was die Entdeckung therapeutischer Wirkstoffe in der Krebsforschung erleichtern wird.